Tài liệu Khóa luận nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau lên sự sinh trưởng và năng suất của vi tảo arthrospira platensis

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả khóa luận Phạm Thị Bích Luyến ii LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu khoa học tự lực đầu tiên mà tôi đã hoàn thành trong sự nghiệp học tập và nghiên cứu khoa học của mình. Chính vì vậy trong quá trình thực hiện đã gặp không ít khó khăn. Tuy nhiên, nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ từ phía gia đình, thầy cô và bạn bè mà tôi đã có thể hoàn thiện đƣợc khóa luận này. Trƣớc hết tôi xin cảm ơn ba mẹ và ngƣời thân đã giúp đỡ và động viên về tinh thần cũng nhƣ vật chất để tôi có tập trung hoàn thành tốt đề tài này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Mỹ đã định hƣớng, động viên tôi thực hiện khóa luận, giúp tôi đến gần hơn với khoa học. Cảm ơn cô đã luôn theo sát, truyền đạt kiến thức giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Trịnh Đăng Mậu đã tận tình chỉ dạy cho tôi những kiến thức, kĩ năng bổ ích về mặt chuyên ngành cũng nhƣ trong cuộc sống, tạo mọi điều kiện hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa Sinh – Môi trƣờng đã giúp tôi trang bị kiến thức và tạo điều kiện về trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất để tôi thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của mình. Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến những ngƣời bạn đã luôn bên cạnh, chia sẻ kiến thức và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng 5 năm 2018 Sinh viên Phạm Thị Bích Luyến iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...................................................... 3 3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................. 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................ 4 1.1. Giới thiệu chung về tảo Spirulina .............................................................. 4 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm phân loại ..................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................ 4 1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái ........................................................... 6 1.1.4. Cách thức sinh trƣởng, sinh sản ........................................................ 7 1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của tảo Spirulina. ........................................................................................................... 9 1.3. Vai trò và ảnh hƣởng của các nguồn nitơ đến sinh trƣởng, phát triển của Spirulina .......................................................................................................... 13 1.4. Các nghiên cứu về vi tảo Spirulina .......................................................... 16 1.4.1. Một số nghiên cứu trên giới ............................................................ 16 1.4.2. Một số nghiên cứu trong nƣớc ........................................................ 17 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................. 19 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 19 iv 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 19 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 19 2.4. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 20 2.4.1. Bố trí các nghiệm thức trong phòng thí nghiệm ............................. 20 2.4.2. Bố trí các nghiệm thức ngoài môi trƣờng thực nghiệm .................. 21 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 20 2.5.1. Phƣơng pháp làm thuần và nhân giống Spirulina ........................... 23 2.5.2. Phƣơng pháp xác định mật độ......................................................... 23 2.5.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sinh khối khô ........................... 24 2.5.4. Phƣơng pháp theo dõi thông số pH, ánh sáng, nhiệt độ. ................ 24 2.5.5. Phƣơng pháp xử lí số liệu ............................................................... 24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................... 25 3.1. Sinh trƣởng của vi tảo Spirulina .............................................................. 25 3.2. Ảnh hƣởng của nguồn amoni đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất của Spirulina .......................................................................................................... 27 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn ure đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất của Spirulina .......................................................................................................... 29 3.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitrit đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất của Spirulina .......................................................................................................... 31 3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrat đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất của Spirulina .......................................................................................................... 33 3.6. Đánh giá ảnh hƣởng của các nguồn nitơ đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất của Spirulina để tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy. .......................... 35 3.7. Đánh giá khả năng thích ứng của tảo Spirulina trong môi trƣờng bổ sung ure và natri nitrat làm nguồn cung cấp nitơ dƣới điều kiện sinh thái của Đà Nẵng ................................................................................................................ 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 43 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................... 45 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên Bảng 2.1 Khối lƣợng các nguồn cung cấp nitơ (g/l) cần bổ sung Trang 20 vào môi trƣờng tƣơng ứng với các nồng độ nitơ khác nhau Bảng 3.1 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng NH4Cl và NH4NO3 đến tốc 29 độ sinh trƣởng trung bình (µ), chỉ số mật độ tối đa (ODmax) và lƣợng sinh khối tối đa (DWmax) của tảo Spirulina Bảng 3.2 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng NaNO2 đến tốc độ sinh 33 trƣởng trung bình (µ), chỉ số mật độ tối đa (ODmax) và lƣợng sinh khối tối đa (DWmax) của tảo Spirulina Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng NaNO3 đến tốc độ sinh 35 trƣởng trung bình (µ), chỉ số mật độ tối đa (ODmax) và lƣợng sinh khối tối đa (DWmax) của tảo Spirulina Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ khác nhau với nồng độ 37 25% lên khả năng sinh trƣởng, năng suất của Spirulina Bảng 3.5 Cƣờng độ ánh sáng và nhiệt độ vào những khoảng thời gian khác nhau trong ngày theo dõi suốt quá trình nuôi. . 41 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên Trang Hình 1.1 Sự khử nitrat đồng hóa (Theo Prescott và cs, 2005) 14 Hình 1.2 Con đƣờng đồng hóa ammonia. (Theo Prescott và cs, 15 2005) Hình 1.3 Cố định ammonia nhờ glutamine synthetase và 15 glutamate synthase (Theo Prescott và cs, 2005) Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 22 Hình 3.1 Đƣờng cong sinh trƣởng của Spirulina 25 Hình 3.2 Phƣơng trình tƣơng quan giữa mât độ quang (OD) và 26 khối lƣợng khô của tảo Spirulina Hình 3.3 Đƣờng cong sinh trƣởng của Spirulina khi nuôi trong 28 môi trƣờng bổ sung muối amoni với các hàm lƣợng khác nhau: a) NH4Cl; (b) NH4NO3 Hình 3.4 Đƣờng cong sinh trƣởng của Spirulina nuôi trong môi 30 trƣờng bổ sung (NH2)2CO ở các hàm lƣợng khác nhau Hình 3.5 Đƣờng cong sinh trƣởng của Spirulina nuôi trong môi 32 trƣờng bổ sung NaNO2 ở các hàm lƣợng khác nhau Hình 3.6 Đƣờng cong sinh trƣởng của Spirulina nuôi trong môi 34 trƣờng bổ sung NaNO3 ở các hàm lƣợng khác nhau Hình 3.7 Đƣờng cong sinh trƣởng của Spirulina nuôi trong môi 36 trƣờng bổ sung các nguồn nitơ khác nhau ở hàm lƣợng 25% Hình 3.8 Đƣờng cong sinh trƣởng của Spirulina với sự bổ sung 39 của 2 nguồn cung cấp nitơ (NH2)2CO và NaNO3 Hình 3.9 Năng suất sinh khối khô của Spirulina với các nguồn cung cấp nitơ khác nhau 40 vii Hình 3.10 Cƣờng độ ánh sáng và nhiệt độ theo dõi trong suốt quá trình nuôi cấy. . 41 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, nhu cầu về chăm sóc sức khỏe của con ngƣời ngày càng đƣợc chú trọng. Con ngƣời không ngừng tìm cách đa dạng hóa các sản phẩm, nâng cao chất lƣợng thực phẩm theo hƣớng phát triển bền vững, thân thiện với môi trƣờng bằng việc tìm kiếm những sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên, có giá trị dinh dƣỡng và giá trị sinh học cao nhằm đáp ứng yêu cầu của con ngƣời. Vừa là thức ăn, vừa là dƣợc phẩm chữa bệnh, tảo Arthrospira platensis chính thức đƣợc Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kì (FDA) công nhận là một trong những lựa chọn hàng đầu đƣợc thế giới công nhận nguồn thực phẩm giá trị nhất [28]. Arthrospira platensis đƣợc biết đến với tên gọi Spirulina, là một loài tảo lam có giá trị dinh dƣỡng rất cao. Các sản phẩm từ tảo này đều có chứa đầy đủ các thành phần nhƣ vitamin (B12, beta - caroten, xanthophyll...), chất khoáng, các acid béo thiết yếu và acid amin (lysine, methyonin, triptophan,...) giúp tăng cƣờng sức khỏe cho con ngƣời [39]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, trong tảo Spirulina hàm lƣợng protein đạt khoảng 56-77% trọng lƣợng khô, cao hơn thịt bò và cá (15-25%), đậu tƣơng (35%), bột sữa (35%), đậu phộng (25%), trứng (12%), ngũ cốc (8-14%) [13], [20]. Tỉ lệ tiêu hoá và hấp thu protein đối với Spirulina là rất cao (85-95%) do nó không chứa cellulose trong thành tế bào [10], [30]. Nghiên cứu của các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, chỉ cần cung cấp khoảng 36 g Spirulina hàng ngày là có thể đáp ứng đầy đủ 100% nhu cầu acid amin, dinh dƣỡng thiết yếu cho ngƣời trƣởng thành [36]. Chính vì vậy, Spirulina đƣợc chọn là nguồn dinh dƣỡng tối ƣu trong việc phòng và chữa các chứng bệnh suy dinh dƣỡng ở trẻ em nhƣ bệnh “kwashiorkor” (gây ra do hệ tiêu hoá của trẻ bị tổn thƣơng) hay đƣợc dùng là 2 thực phẩm đặc biệt cho những ngƣời bị bệnh HIV [30] [40]. Tổ chức Y tế thế giới (WHO/OMS) đã công nhận tảo Spirulina là thực phẩm bảo vệ sức khỏe tốt nhất của loài ngƣời trong thế kỉ 21 [34]. Chính vì những lợi ích to lớn này mà tảo Spirulina đã đƣợc nuôi ở nhiều nơi trên thế giới để thu sinh khối, tạo ra những sản phẩm mang lại giá trị dinh dƣỡng cao phục vụ cho con ngƣời [10]. Tuy nhiên, để nuôi Spirulina đạt đƣợc hiệu quả và chất lƣợng cao thì cần phải quan tâm, xem xét nhiều yếu tố, trong đó yếu tố về dinh dƣỡng đƣợc xem là quan trọng nhất. Trong một nghiên cứu đã chỉ ra rằng hơn 25% tổng năng suất của tảo Spirulina liên quan đến môi trƣờng nuôi cấy, chúng đóng vai trò là nguồn cung cấp chất dinh dƣỡng cho toàn bộ các quá trình sinh lý – hóa trong tế bào của tảo, đặc biệt là nitơ [19]. Nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa là thành phần tham gia vào các quá trình trao đổi chất và năng lƣợng trong tảo [19]. Trong nuôi trồng Spirulina ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm nitơ vào môi trƣờng dƣới dạng muối nitrate (NaNO3). Tuy nhiên NaNO3 có giá thành khá cao làm tăng chi phí đầu tƣ nên ảnh hƣởng đến hiệu quả kinh tế trong nuôi tảo. Mặt khác theo nhiều nhà khoa học trên thế giới thì Spirulina có khả năng hấp thụ đa dạng các nguồn nitơ khác nhau [24], do vậy nghiên cứu thay thế muối NaNO3 bằng các hợp chất cung cấp nitơ khác đang là vấn đề đƣợc quan tâm hiện nay. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng của các nguồn nitơ khác nhau lên sự sinh trƣởng và năng suất của vi tảo Arthrospira platensis”. 2. Mục tiêu đề tài - Xác định đƣợc nguồn nitơ thích hợp bổ sung vào môi trƣờng nuôi để tảo Spirulina sinh trƣởng, phát triển và cho năng suất tốt nhất. - Xác định đƣợc nồng độ tối ƣu của nguồn nitơ cung cấp để tăng tốc độ sinh trƣởng và năng suất của tảo Spirulina. 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về khả năng sinh trƣởng, phát triển của Spirulina trong những nguồn cung cấp nitơ khác nhau, từ đó làm cơ sở nghiên cứu cho việc xây dựng công thức môi trƣờng dinh dƣỡng tối ƣu cho tảo. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở để lựa chọn nguồn cung cấp nitơ xây dựng công thức môi trƣờng nuôi tối ƣu để áp dụng vào mô hình nuôi trồng Spirulina trong quy mô lớn. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TẢO SPIRULINA 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm phân loại Tảo Spirulina đƣợc biết đến là một trong những loài sinh vật sống lâu đời nhất trên Trái đất. Nó sinh trƣởng tự nhiên ở vùng nhiệt đới trong các hồ nƣớc mặn của Châu Phi, Trung và Nam Mỹ từ 3,6 tỷ năm trƣớc. Trong những năm 60 của thế kỉ XX, Brandily – một nhà nhân chủng học ngƣời Pháp đã phát hiện ra loài tảo này trong lần khảo sát sự đa dạng sinh học tại vùng hồ ở Tchad, Châu Phi. Đến năm 1973, FDA và WHO/OMS đã chính thức công nhận tảo Spirulina là nguồn dinh dƣỡng và dƣợc liệu quý cho con ngƣời và đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu đến ngày nay [21]. Tảo Spirulina là các vi sinh vật có hình xoắn, sống trong nƣớc mà ta thƣờng gọi là Tảo xoắn với tên khoa học là Spirulina platensis. Thực ra đây không phải là một sinh vật thuộc ngành Tảo (Algae) vì Tảo thuộc giới sinh vật nhân chuẩn (Eukaryotes) mà Spirulina thuộc ngành Vi khuẩn lam (Cyanobactera), chúng thuộc giới sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryotes). Những nghiên cứu mới nhất lại cho biết chúng cũng không phải thuộc chi Spirulina mà lại thuộc chi Arthrospira [20]. Chính vì vậy, về phân loại khoa học, tảo Spirulina thuộc: Giới (domain): Bacteria; ngành (phylum): Cyanobactera; lớp (class): Chroobacteria; bộ (order): Oscillatoriales; họ (family): Phormidiaceae; chi (genus): Arthrospira; loài (species): Arthrospira platensis (A. platensis). 1.1.2. Đặc điểm hình thái Tảo Spirulina có màu xanh lục, quan sát dƣới kính hiển vi điện tử thấy Spirulina có dạng xoắn lò xo, sợi tảo (trichome) có 5 – 7 vòng (có khi lên đến 27 vòng) đều nhau không phân nhánh, ở hai đầu sợi tảo thƣờng hẹp, mút lại. 5 Đƣờng kính vòng xoắn từ 35 – 50 µm, bƣớc xoắn 60 µm. Chiều dài thay đổi có thể đạt đƣợc 0,25 mm, có khi lớn hơn [37]. Spirulina là loài có khả năng vận động tiến về phía trƣớc hoặc phía sau. Sự vận động này đƣợc thực hiện bởi các lông ở sƣờn bên cơ thể. Các sợi lông này có đƣờng kính 5 –7 nm và dài 1 –2 μm nằm quanh cơ thể. Các lông này hoạt động nhƣ tay chèo giúp Spirulina di chuyển [33]. Ngoài ra tảo còn có khả năng vận động theo kiểu trƣợt xung quanh trục của nó, vận tốc có thể đạt 5 micron/giây. Sợi tảo đƣợc cấu tạo từ một sợi đa bào, mỗi tế bào của sợi tảo rộng 5µm, dài 2mm, không có màng bằng cellulose, không có tế bào dị hình và chƣa có nhân điển hình, không có không bào nhƣng lại có không bào khí, không có lục lạp mà chỉ có thilacoid phân bố trong toàn bộ tế bào [30]. Phycobiliprotein và protein liên kết đƣợc gắn vào bề mặt ngoài của thylacoid, lớp ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocianin và phần trong cùng có allophycoyanin. Màng tế bào nằm sát ngay dƣới thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm. Thành tế bào có cấu trúc nhiều lớp chứa mucopolymer, pectin và các loại polysaccharide khác. Spirulina có khả năng tạo ra các không bào khí nhỏ (gas vesicle) có đƣờng kính cỡ 70 nm và đƣợc cấu trúc từ các sợi protein bện lại [22]. Không bào khí sẽ nạp đầy khi sợi Spirulina muốn nổi lên trên bề mặt để nhận ánh sáng cho quá trình quang hợp. Đến cuối ngày là lúc tế bào tạo ra một lƣợng lớn carbohydrate, lúc đó các tế bào sẽ tụ tập lại và tạo ra một áp suất thẩm thấu cao bên trong cơ thể làm cho các không bào khí không thể duy trì đƣợc áp suất thẩm thấu lâu bên trong tế bào và chúng sẽ vỡ, giải phóng ra các khí làm cho sợi tảo chìm xuống đáy và tại đây xảy ra quá trình chuyển hoá carbohydrat thành protein [27]. Cũng nhƣ các tảo lam khác, Spirulina cũng chƣa có nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa ADN. Trong quá trình nuôi trồng, nhất là ngoài tự nhiên, tế bào có thể duỗi thẳng ra thành hai dạng: xoắn và thẳng, 6 tỷ lệ xoắn – thẳng khoảng 15 – 85. Các nghiên cứu cho thấy rằng: trong các điều kiện dinh dƣỡng khác nhau thì tốc độ sinh trƣởng của 2 dạng thẳng và xoắn nhƣ nhau; hàm lƣợng protein ở 2 dạng thẳng và xoắn gần nhƣ nhau (ở mọi điều kiện về dinh dƣỡng và ánh sáng nhƣ nhau); vào mùa hè tốc độ sinh trƣởng của dạng thẳng kém hơn dạng xoắn và nếu trong thành phần dinh dƣỡng thiếu các nguyên tố vi lƣợng, hàm lƣợng NaHCO3 thấp dẫn tới số vòng xoắn giảm và đƣờng kính vòng xoắn tăng [43]. 1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái Tảo Spirulina phân bố rộng trong các môi trƣờng khác nhau nhƣ bãi rong cỏ, các thủy vực nƣớc ngọt, lợ, mặn hay ngay cả ở suối nƣớc nóng. Tảo lơ lửng ở độ sâu có thể tới 50 cm, và trong môi trƣờng nhân tạo thƣờng nuôi ở mức nƣớc 10 –30 cm (nuôi hồ hở), hoặc có thể trong hồ đáy sâu 1 – 1,5 m (sục khí). Trong môi trƣờng sống có độ kiềm cao, Spirulina nổi lên hoặc lặn xuống ít nhất một lần trong suốt thời gian 24 giờ và sẽ thƣờng xuyên hơn nếu nhƣ có gió nhẹ trên bề mặt hồ. Spirulina sống trong môi trƣờng kiềm tính, pH thích hợp nằm trong khoảng 9 – 11, tối ƣu nhất là pH = 9,5. Ở điều kiện này khó có loài nào có thể tồn tại đƣợc ngoài tảo Spirulina. Tảo Spirulina có thể sống trong nhiệt độ nƣớc là 20 – 40oC, thích hợp nhất là 35oC. Trong tự nhiên Spirulina tập trung nhiều nhất là ở Trung Phi tại khu vực hồ Chad và Niger, ở Đông Phi dọc theo thung lũng GreaRift [7]. Việc nuôi trồng Spirulina ở qui mô lớn trên thế giới bắt đầu tại Nhật Bản vào năm 1960. Đến nay, Spirulina đã đƣợc sản xuất tại ít nhất 22 quốc gia, trong đó có Việt Nam. Ở Việt Nam, Spirulina phân bố ở các thủy vực khác nhau nhƣ: sông, ao, hồ, ruộng lúa… và đƣợc một số nơi nuôi trồng ở quy mô công nghiệp. Công ty Vĩnh Hảo (Bình Thuận) và cơ sở Bình Chánh (TP. Hồ Chí Minh) là 2 trung tâm nuôi trồng tảo lớn nhất nƣớc ta [21]. 7 1.1.4. Cách thức sinh trƣởng, sinh sản Cũng nhƣ sự phát triển chung theo quy luật tăng trƣởng của các sinh vật khác, sinh trƣởng của tảo (đƣợc xếp cùng nhóm với nhóm vi khuẩn làm) cũng trải qua 4 giai đoạn: thích nghi, tăng trƣởng, cân bằng và suy vong. Với chế độ dinh dƣỡng thích hợp và điều kiện sinh lý học thuận lợi, các quá trình ấy xảy ra nhƣ sau [1]: + Pha thích nghi (Lag phase): là giai đoạn tảo thích nghi với môi trƣờng mới. Ở giai đoạn này trong tế bào tảo diễn ra sự vô hiệu hóa các enzyme, sự giảm tốc độ trao đổi chất của tảo giống. Tế bào tảo sẽ có sự gia tăng kích thƣớc nhƣng không có sự phân chia. Một số yếu tố khuyếch tán đƣợc tạo ra do chính các tế bào thì cần cho quá trình cố định carbon. Hoạt động trao đổi chất của các tế bào Spirulina trong giai đoạn này có tác dụng ức chế sự hoạt động của các độc tố nào đó có mặt trong môi trƣờng, hay giúp Spirulina thích nghi với môi trƣờng có chứa một vài chất có nồng độ quá cao. Giai đoạn này kéo dài hay ngắn liên quan đến tính chất của môi trƣờng. Nếu tính chất hóa học của môi trƣờng mới sai khác nhiều với môi trƣờng nhân giống cũ thì giai đoạn thích nghi sẽ kéo dài. Nếu cấy tảo giống vào môi trƣờng mới lúc tảo giống đang ở giai đoạn thích nghi hay từ giai đoạn tử vong thì giai đoạn thích nghi này sẽ kéo dài. + Pha tăng trƣởng (Log phase): là giai đoạn mà tế bào phân chia rất nhanh và liên tục. Sinh trƣởng logarit là sinh trƣởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào đƣợc tổng hợp với tốc độ tƣơng đối ổn định. Tốc độ tăng trƣởng trong giai đoạn này tùy thuộc vào kích thƣớc tế bào, cƣờng độ ánh sáng và nhiệt độ và môi trƣờng dinh dƣỡng. Nếu cân bằng dinh dƣỡng hay các điều kiện môi trƣờng thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trƣởng không đồng đều. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng sang một môi trƣờng giàu dinh dƣỡng hơn 8 hoặc ngƣợc lại thì cũng có kết quả về sự sinh trƣởng không đồng đều nhƣ vậy. + Pha cân bằng (Stationary phase): khi có một vài nhân tố xuất hiện nhƣ sự giảm sút của yếu tố dinh dƣỡng nào đó, tỷ lệ cung cấp oxy và carbonic, sự thay đổi pH, sự hạn chế ánh sáng hay sự xuất hiện các yếu tố ngăn cản sự phân chia các tế bào do một chất độc nào đó...thì quá trình sinh trƣởng của tảo sẽ bị ức chế, đây là giai đoạn đầu của pha tăng trƣởng chậm. Tuy nhiên, pha này diễn ra rất nhanh với sự cân bằng đƣợc tạo ra giữa tốc độ tăng trƣởng và các nhân tố giới hạn, nó đƣợc xem là pha quân bình. + Pha suy vong (Death phase): khi các chất dinh dƣỡng trở nên cạn kiệt không đủ cung cấp cho sự sinh trƣởng và trao đổi chất đến mức trở nên độc hại, tảo sẽ bị suy tàn gọi là pha chết. Giống nhƣ giai đoạn logarit, sự tử vong của quần thể vi sinh vật cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Tổng số tế bào sống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bào chết chƣa bị phân hủy. Ở giai đoạn này, tảo chết theo phƣơng thức logarit nhƣng sau khi số lƣợng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế bào chậm lại. Đó là do một số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh. Vì điều này và những nguyên nhân khác làm cho đƣờng cong của giai đoạn suy vong có thể khá phức tạp. Tảo Spirulina sinh sản theo phƣơng thức sinh sản vô tính. Từ một sợi tảo mẹ hình thành nên các tế bào tảo con mới. Trong chu kỳ sống, khi đến giai đoạn sinh sản cấu trúc chuỗi xoắn của Spirulina sẽ bị vỡ ra và tạo thành nhiều đoạn tảo nhờ sự hình thành của những tế bào đặt biệt gọi là tế bào mắc xích (necridia). Các đoạn xoắn nhỏ ở mắc xích sẽ hình thành chuỗi ngắn có khả năng trƣợt gọi là hormogonia và sau đó sẽ hình thành chuỗi dài mới. Lúc này tế bào ở hormogonia rời khỏi vị trí đính của tế bào mắc xích, phần đầu gắn tiêu giảm dần, 2 đầu hormogonia trở nên tròn nhƣng vách tế bào vẫn có chiều 9 dày không đổi. Với tiến trình này, chuỗi đƣợc kéo dài hơn và có dạng xoắn đặc thù. Các hormogonia phát triển, trƣởng thành và chu kì sinh sản đƣợc lặp đi lặp lại một cách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời của tảo. Trong thời kì sinh sản tảo Spirulina nhạt màu, ít sắc tố xanh hơn bình thƣờng. Sự vỡ ngẫu nhiên của trichome cùng với sự phân lập necridia bảo đảm sự tăng trƣởng của quần thể tảo. Trong quá trình sinh sản nếu gặp điều kiện không thuận lợi tảo Spirulina cũng hình thành bào tử bảo vệ giống nhƣ vi khuẩn. Bào tử do những tế bào dinh dƣỡng tạo nên, tích lũy nhiều chất dự trữ, bọc màng dày ở phía ngoài và khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử chui ra khỏi màng, nảy mầm thành tảo mới. Chu kì phát triển của tảo Spirulina rất ngắn, thƣờng xảy ra trong 24 giờ (trong điều kiện phòng thí nghiệm), vì vậy có thể thu hoạch sinh khối tảo sau 5-7 ngày nuôi cấy [17] [43]. 1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA TẢO SPIRULINA Sinh trƣởng của tảo đạt cao nhất với một cƣờng độ và thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo nó là một chế độ chăm sóc, theo dõi kĩ lƣỡng để đảm bảo các chỉ tiêu ánh sáng, nhiệt độ, pH, điều kiện khuấy trộn, dinh dƣỡng... giúp cho tảo phát triển tốt nhất. Vì vậy khi nuôi tảo trong các hồ nhân tạo cần chú ý đến các yếu tố sau [43]: + Yếu tố ánh sáng [41]: Spirulina là vi sinh vật quang dƣỡng bắt buộc, chúng không thể sống hoàn toàn không có ánh sáng vì vậy ánh sáng là điều không thể thiếu giúp cho tảo quang hợp và phát triển. Sự tổng hợp các thành phần của tế bào cũng bị ảnh hƣởng mạnh bởi cƣờng độ ánh sáng. Chính vì vậy, cƣờng độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng là nhân tố quan trọng nhất ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của tảo Spirulina. Theo nghiên cứu thì tốc độ tăng trƣởng nhanh nhất khi Spirulina đƣợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng đầy đủ, tuy nhiên để đạt đƣợc chất lƣợng tốt nhất thì cƣờng độ ánh sáng phải vừa phải 10 để tránh ức chế sự phân chia tế bào. Ở điều kiện phòng thí nghiệm, khi nuôi trong bình thuỷ tinh dung tích nhỏ, ánh sáng đƣợc xác định cho sự phát triển của tảo Spirulina là 1000 – 3000 lux còn với bề nuôi lớn cƣờng độ ánh sáng là 5000 – 100000 lux [2] [7] [19]. Tuy nhiên khi nuôi Spirulina ở giai đoạn đầu nên để ở cƣờng độ ánh sáng thấp để tránh sự quang phân ly. Ngoài ra hiệu quả hấp thụ cƣờng độ ánh sáng còn phụ thuộc vào mật độ nuôi cấy của tảo, vì khi cƣờng độ ánh sáng cao mà mật độ tảo lớn thì mỗi sợi tảo vẫn nhận đƣợc cƣờng độ ánh sáng nhỏ. Nhiều loại vi tảo có cƣờng độ quang hợp bão hoà ở khoảng 33% tổng lƣợng cƣờng độ ánh sáng và Spirulina cũng nằm trong số đó. Vì vậy trong điều kiện ánh sáng có cƣờng độ cao và thời gian chiếu sáng dài, ngƣời ta thấy xuất hiện hiện tƣợng quang ức chế có thể làm tảo chết hoặc làm giảm đáng kể năng suất nuôi trồng. + Yếu tố nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển và sản xuất sinh khối của vi tảo nói chung và của Spirulina nói riêng vì nó ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sản xuất prorein và chlorophyll [18]. Ngoài ra nhiệt độ còn ảnh hƣởng đến kích thƣớc tế bào, hình thái, và nồng độ acid béo không no của Spirulina [18]. Nhiệt độ tốt nhất cho sự phát triển của tảo Spirulina nằm trong khoảng 20 – 40oC và tốc độ tăng trƣởng nhanh nhất ở 35oC. Nhiệt độ dƣới 20oC hay trên ngƣỡng 40oC tế bào tảo Spirulina sẽ bị tổn hại và ngừng phát triển [7], [19]. Nhiệt độ môi trƣờng nuôi là yếu tố cần đáp ứng liên tục, vì rất dễ bị chi phối và tác động bởi điều kiện xung quanh, mức độ và thời gian chiếu sáng. Do vậy nhiệt độ là một trong những yếu tố thƣờng xuyên đƣợc theo dõi trong công nghệ nuôi trồng vi tảo. Giữa nhiệt độ và ánh sáng có mối liên hệ với nhau trong quá trình nuôi cấy tảo, chúng đều đóng vai trò quan trọng quyết định đến năng suất và sinh khối của Spirulina [21]. + Yếu tố sục khí: sục khí là một nhân tố rất quan trọng trong sản xuất Spirulina, sự khuấy trộn môi trƣờng liên tục sẽ giúp hạn chế sự kết lắng tế 11 bào, tránh sự phân tầng nhiệt độ và đảm bảo sự phân bố đều chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi. Ngoài ra sục khí cũng giúp loại bỏ lƣợng oxy dƣ thừa trong bể nuôi giúp tảo tránh khỏi hiện tƣợng ngộ độc oxy [23] [35]. + Độ pH: Spirulina sống trong môi trƣờng kiềm tính, pH thích hợp khoảng 9 –11 tối ƣu nhất là pH = 9,5. pH đƣợc coi là yếu tố chỉ thị, phản ánh các thành phần nuôi dƣỡng cung cấp cho môi trƣờng nuôi dƣỡng tảo, chủ yếu là nguồn bicarbonat, nitơ và khí CO2 hoà tan [3]. Ngoài ra, độ pH cao trong môi trƣờng nuôi cấy còn giúp Spirulina tránh đƣợc sự tạp nhiễm của các yếu tố sinh học nhƣ loài tảo lục, động vật phù du hay các sinh vật lạ khác [6]. Ngoài các yếu tố về điều kiện nuôi cấy thì hàm lƣợng dinh dƣỡng là yếu tố đƣợc coi là rất quan trọng cần chú ý trong quá trình nuôi cấy. Nhất là đối với quá trình sinh trƣởng cũng nhƣ tích lũy các chất trong tảo. Môi trƣờng dinh dƣỡng của Spirulina cần các dƣỡng chất: Cacbon, Nitơ, các chất khoáng đa lƣợng và vi lƣợng… + Dinh dƣỡng Carbon: Spirulina đồng hóa carbon chủ yếu ở dạng vô cơ, tốt nhất là bicarbonate (HCO3-) thông qua quá trình quang hợp. Nguồn cacbon cung cấp cho Spirulina khoảng 1,2 – 16,8 g NaHCO3/lít [25]. + Dinh dƣỡng Nitơ: Spirulina có khả năng đồng hóa nitơ theo phản ứng khử nhờ enzyme nitrogenase xúc tác khi có ATP và kết quả là nitơ đƣợc tổng hợp thành protein của chúng. Spirulina là loài có khả năng cố định đạm và chuyển hóa nitơ tự do dạng khí thành amoniac, nitrit hay nitrat – là dạng mà tảo có thể hấp thụ và chuyển hóa thành protein và các acid nucleic. Tuy nhiên chúng chỉ có thể chuyển hóa khoảng 12 – 15 mg nitơ ở dạng phân tử trong không khí, vậy nên chúng sử dụng nitơ bằng cách đồng hóa các dạng nitrit (NO2-), nitrat (NO3-), amoni (NH3, (NH4)2SO4, NH4Cl, (NH2)2CO). Chính vì lý do này, các nhà khoa học đã nghiên cứu bổ sung những nguồn này vào môi trƣờng nuôi tảo Spirulina. Đặc biệt, khi sử dụng nguồn nitơ không từ nitrate 12 cần phải kiểm soát nồng độ vì có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển sinh khối của tảo, thậm chí có thể gây chết tảo [24] [26]. Các chất khoáng cần cung cấp cho môi trƣờng nuôi tảo [27]: + P: là một trong những nhân tố chính trong thành phần của tảo, có vai trò chính trong đa số các quá trình xảy ra trong tế bào đặt biệt là quá trình chuyển hoá năng lƣợng và tổng hợp acid nucleic. Tảo sử dụng chủ yếu là phospho vô cơ, đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi khoảng 90 – 180 mg/lít [14]. + K+ và Na+: xúc tiến quá trình quang hợp bằng cách thúc đẩy quá trình vận chuyển glucid từ phiến lá vào các cơ quan khác. Khi thiếu kali sự hình thành các liên kết cao năng bị chậm lại và hàm lƣợng phospho trong các acid nucleotic bị giảm. Thƣờng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng dƣới dạng kết hợp với N, P. + Mg2+: đóng vai trò tƣơng tự nhƣ P, Mg2+ rất quan trọng đối với thực vật vì nó có cấu tử trung tâm của diệp lục tố. Thiếu Mg2+ thực vật không tạo đƣợc diệp lục tố nên không quang hợp đƣợc. + Ca2+: ion Ca2+ thƣờng kết hợp với ion CO32-, HCO3-, SO42-, dạng HCO3-, dễ chuyển hoá thành CaCO3 và phóng thích CO2 cho quá trình quang hợp của thực vật phù du trong nƣớc. Ca2+ làm cho nƣớc bớt chua, làm tăng độ hoà tan, đồng hoá các chất dinh dƣỡng khác nhƣ nitơ, phospho giúp cho Spirulina hoạt động tốt hơn. + Fe [9]: cung cấp dƣới dạng muối FeSO4. Nồng độ Fe2+ bổ sung khoảng 0,56 mg/lít môi trƣờng. Chlorophyl trong tảo không thể tạo thành đƣợc nếu không có sắt. + Cl-: tảo Spirulina rất ƣa Clo vô cơ, nồng độ cung cấp từ muối NaCl khoảng 1 – 1,5 g/lít. 13 1.3. VAI TRÒ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC NGUỒN NITƠ ĐẾN SINH TRƢỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA SPIRULINA Nitơ đóng vai trò vô cùng quan trọng đối với sự sinh trƣởng, phát triển của tảo và do đó nó quyết định năng suất và chất lƣợng tảo sau thu hoạch. nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa tham gia trong các quá trình trao đổi chất và năng lƣợng trong tảo. nitơ là thành phần chính cấu tạo nên các chất: protein, acid nucleic, các hợp chất dự trữ năng lƣợng (ADP, ATP, các chất điều hoà sinh trƣởng…). Ngoài ra, nitơ trong tảo còn đƣợc dùng để cấu tạo nên các các sắc tố quang hợp, đặc biệt là phân tử chlorophyll, ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình quang hợp của tảo [4], [43]. Trong tự nhiên nitơ tồn tại ở 2 dạng: + Dạng vô cơ: dạng khí nitơ trong không khí (N2, N2O, NO, NO2) và nitơ tồn tại ở các dạng muối khoáng nhƣ ammoni (NH4+), nitrit (NO2-), nitrate (NO3-)… + Dạng hữu cơ: protein, polypeptit, acid amin…trong xác sinh vật. Tảo Spirulina là loài không có khả năng sử dụng nguồn nitơ hữu cơ mà chỉ có thể sử dụng nitơ ở dạng vô cơ. Spirulina có khả năng đồng hóa nitơ theo phản ứng khử, nhờ enzyme nitrogenase xúc tác, với sự có mặt của ATP. Nhờ đó Spirulina có thể cố định đạm và chuyển hóa các nguồn nitơ vô cơ thành amoniac, nitrit hay nitrat – là dạng mà tảo có thể hấp thụ và tổng hợp thành protein và các acid nucleic trong cơ thể. Do nitơ là thành phần chủ yếu của các protein, acid nucleic, coenzyme và nhiều thành phần khác nên năng lực đồng hoá nitrogen của tế bào là cực kỳ quan trọng. Trong quá trình nuôi trồng tảo ngƣời ta bổ sung nguồn nitơ vào môi trƣờng nuôi dựa trên nguyên lý của quá trình đồng hóa nitơ của tảo Spirulina.