Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của hai cây rau má lá sen hydrocotyle bonariensis comm. ex lam. và hydrocotyle vulgaris l. (apiaceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI CÂY RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS COMM. EX LAM. VÀ HYDROCOTYLE VULGARIS L. (APIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TÔN NỮ LIÊN HƢƠNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI CÂY RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS COMM. EX LAM. VÀ HYDROCOTYLE VULGARIS L. (APIACEAE) Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01 Phản biện 1: GS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC Phản biện 2: PGS. TS. TRẦN CÔNG LUẬN Phản biện 3: PGS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA Phản biện độc lập 1: PGS. TS. NGUYỄN MẠNH CƯỜNG Phản biện độc lập 2: TS. TRẦN THỊ MINH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. NGUYỄN NGỌC SƢƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2013 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHŨ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ***** LỜI CAM ĐOAN Luận án Tiến sĩ Khoa học Hóa học “Khảo sát thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của các cây rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam và Hydrocotyle vulgaris L., (Apiaceae)” do tôi thực hiện, các số liệu kết quả trung thực. Theo sự hiểu biết của tôi, cũng như các tài liệu tham khảo và phần mềm Scifinder, các kết quả nghiên cứu trong luận án này là mới, chưa được các tác giả khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 09 năm 2012 Nghiên cứu sinh Tôn Nữ Liên Hương i LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin ngỏ lời cảm ơn đến: - PGS.TS. Nguyễn Ngọc Sương Cô kính yêu đã tận tình hướng dẫn, quan tâm khích lệ và tạo điều kiện thuận lợi giúp cho tôi hoàn thành luận án này. - GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng Cô kính yêu đã tận tình hướng dẫn và dành thời gian sửa chữa, đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận án, luôn quan tâm động viên tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học trong nhiều năm qua. - GS.TSKH. Nguyễn Công Hào đã quan tâm và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho các chuyên đề tiến sĩ và luận án. - GS.TS. Nguyễn Minh Đức và PGS.TS. Trương Thế Kỷ đã quan tâm và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho các chuyên đề tiến sĩ và luận án. - PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh và PGS. TS. Trần Công Luận đã quan tâm và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận án. - PGS. TS. Trần Lê Quan, TS. Tôn Thất Quang, TS. Nguyễn Trung Nhân đã động viên, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện luận án . - Tất cả quý Thầy Cô trong Bộ Môn Hóa Hữu Cơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án. - Phòng NMR, Phòng Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Hóa học, Viện KHCN VN, Hà Nội, Phòng Phân Tích Trung Tâm, phòng Hợp chất Thiên nhiên và Bộ môn Sinh học phân tử thuộc trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM - Phòng Sau Đại Học trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM - Toàn thể bạn hữu trong Khoa Khoa học tự nhiên và Trường ĐH Cần Thơ và Khoa Hóa Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM - Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, luôn bên cạnh động viên, khích lệ và tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án này. Tôn Nữ Liên Hương ii MỤC LỤC Trang  MỞ ĐẦU  NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. 1 MÔ TẢ THỰC VẬT 1 1.1.1 Hydrocotyle bonariensis Comm. ex L., Cây rau má lá sen hoa chùm 1 1.2. 1.3. 1.4. 1.1.2 Hydrocotyle vulgaris L., Cây rau má lá sen hoa phân tầng 2 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 2 1.2.1 Hydrocotyle asiatica [hay Centella asiatica (L.) Urb.] 3 1.2.2 Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. 4 1.2.3 Hydrocotyle leucocephala Cham. 4 1.2.4 Hydrocotyle ramiflora Maximowicz 5 1.2.5 Hydrocotyle rannunculoides L.f 5 1.2.6 Hydrocotyle rotundifolia Roxb (water pennywort) 5 1.2.7 Hydrocotyle sibthorpioides Lam. 5 1.2.8 Hydrocotyle umbellala Linn. 6 1.2.9 Hydrocotyle vulgaris L. 6 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƢỢC TÍNH 15 1.3.1 Hydrocotyle asiatica L. 16 1.3.2 Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. 20 1.3.3 Hydrocotyle nepalensis Hook. 20 1.3.4 Hydrocotyle sibthorpioides Lam. 20 1.3.5 Hydrocotyle umbellata Linn. 20 1.3.6 Hydrocotyle vulgaris L. 20 1.3.7 Các loài Hydrocotyle khác 21 NHẬN XÉT 21 1.4.1 Nhận xét về thành phần hoá học 21 1.4.2 Nhận xét về hoạt tính sinh học 21 iii 1.4.3 Phân tích đánh giá tình hình nghiên cứu trong nƣớc CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 2.2 2.3 21 22 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22 2.1.1 Hóa chất và thiết bị dùng trong tách chiết, cô lập chất 22 2.1.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong thử nghiệm hoạt tính sinh học 23 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Tách chiết, cô lập và định danh các hợp chất hữu cơ 24 2.2.2 Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các nhóm hợp chất hữu cơ 25 THỰC NGHIỆM 28 2.3.1 Khảo sát nguyên liệu 28 2.3.2 Điều chế các loại cao 29 2.3.3 Khảo sát tinh dầu 30 2.3.4 Trích ly, cô lập một số hợp chất hữu cơ trong hai loài Hydrocotyle 31 2.3.5 Khảo sát hoạt tính sinh học 45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HOÁ HỌC 52 3.1.1 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất alkaloid 52 3.1.2 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất cerebroside và chất béo 56 3.1 3.1.3 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất coumarin, dioxolane, lignan 73 3.2 3.1.4 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất flavonoid 81 3.1.5 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất carbohydrate 91 3.1.6 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất steroid 95 3.1.7 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất terpenoid 110 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÁC TINH DẦU 116 3.2.1 Khảo sát thành phần hoá học của tinh dầu cây H. bonariensis 117 3.2.2 Khảo sát thành phần hoá học của tinh dầu cây H. vulgaris 120 3.2.3 Nhận xét thành phần hoá học của tinh dầu hai cây H. bonariensis và H. vulgaris 3.3 121 KẾT LUẬN VỀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA HAI CÂY THUỘC CHI HYDROCOTYLE iv 122 3.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC 125 3.4.1 Thử nghiệm Brine-shrimp 125 3.4.2 Thử nghiệm gây độc tế bào ung thƣ (in vitro) 126 3.4.3 Thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định 128 3.4.4 Thử nghiệm khả năng làm lành vết thƣơng trên chuột 129 3.4.5 Thử nghiệm khả năng kháng oxy hoá 129 3.4.6 Nhận định chung về hoạt tính của nhóm chất trích từ rau má lá sen 130 3.5 NHẬN XÉT VỀ HOÁ THỰC VẬT CỦA CHI HYDROCOTYLE CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 131 135 KẾT LUẬN 135 KIẾN NGHỊ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 139  DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 140  TÀI LIỆU THAM KHẢO 149  PHỤ LỤC v CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN [α]D : năng lực triền quang (Specific Optical Rotation) CTPT : công thức phân tử CS : cell survival, tế bào còn sống DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO : DiMethyl SulfOxid EI-MS : (Ionization by Electron Impact) khối phổ ion hóa bằng va chạm điện tử FT-MS : (Fourier transform-Mass Spectroscopy) khối phổ biến đổi Fourier GC-MS : (Gas Chromatography-Mass Spectroscopy) sắc ký khí ghép khối phổ H-H COSY : (H-H COrrelation SpectroscopY) tương quan giữa H-H HMBC : (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) tương quan giữa H-C qua 2, 3 nối HSQC : (Heteronuclear Single Quantum Coherence) tương quan giữa H-C qua một nối HR-ESI-MS : (High Resolution ElectroSpray Ionization-Mass Spectrometry khối phổ ion hóa bằng kỹ thuật phun điện phân giải cao IR : (Infrared Spectrocospy), phổ hồng ngoại LC-MS : (Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy) sắc ký lỏng ghép khối phổ M : khối lượng phân tử NMR : (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) phổ cộng hưởng từ hạt nhân OD : (optical density) mật độ quang vi RP-18 : (Reversed Phase C-18), silica gel pha đảo SKC : sắc ký cột SKLM : sắc ký lớp mỏng UV-Vis : (Ultraviolet visible Spectroscopy), phổ tử ngoại- khả kiến Các ký hiệu mũi s : (singlet), mũi đơn brs : (broad singlet), mũi đơn rộng d : (doublet), mũi đôi dd : mũi đôi đôi (doublet – doublet) t : (triplet), mũi ba dt : (doublet – triplet), mũi đôi ba m : (multiplet), mũi đa J : (coupling constant), hằng số ghép Các giá trị thử nghiệm EC50 : (50% Eliminatory Concentration), nồng độ loại trừ 50% IC50 : (50% Inhibitory Concentration), nồng độ ức chế 50% LC50 : (50% Lethality Concentration), nồng độ gây chết 50% Các gốc hóa học Ara : Arabinose Glc : Glucose GlcA : Glucuronic Acid Rha : Rhamnose Tig : Tigloyl Các từ cùng nghĩa carbon thủ tính : carbon bất đối, tâm chiral chi phương : mạch hở hữu triền : quay phải tả triền : quay trái vii DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Trang  HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hydrocotyle bonariensis Comm. ex L., Cây rau má lá sen hoa chùm 2 Hình 1.2. Hydrocotyle vulgaris L., Cây rau má lá sen hoa phân tầng 2 Hình 2.1. Cây Hydrocotyle bonariensis 28 Hình 2.2. Cây Hydrocotyle vulgaris 28 Hình 2.3. Xử lý chuột để thử nghiệm hoạt tính làm lành vết phỏng (cấp độ 2) 47 Hình 3.1. Cấu trúc hoá học và năng lực triền quang của leucocerebroside -Lb4 và của mucusoside Hình 3.2. 58 Hình ảnh minh hoạ sự phân mảnh nhờ phổ FT-MS của hợp chất Hb-Ea5 59 Hình 3.3. Hình ảnh minh hoạ sự phân mảnh khi thủy phân hợp chất Hb-Ea6 64 Hình 3.4. Sắc ký bản mỏng của hợp chất Hb-Ea6 trong các hệ giải ly khác nhau 69 Hình 3.5. Sắc ký bản mỏng của hợp chất Hb-Ea5 (vết bên trái) so với Hb-Ea6  SƠ ĐỒ 69 Sơ đồ 2.1. Qui trình điều chế các cao và cô lập chất từ toàn cây H. bonariensis 49 Sơ đồ 2.2. Qui trình điều chế các cao và cô lập chất từ lá cây H. bonariensis 50 Sơ đồ 2.3. Qui trình điều chế các cao và cô lập chất từ toàn cây H. vulgaris 51  BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Độ ẩm của các bộ phận của hai cây H. bonariensis và H. vulgaris 29 Bảng 2.2. Khối lượng và thu suất của các loại cao (so với nguyên liệu khô ban đầu) của hai cây khảo sát 30 Bảng 2.3. Sắc ký cột cao ether dầu hỏa của toàn cây H. bonariensis, sơ đồ 2.1 35 Bảng 2.4. Sắc ký cột cao chloroform của toàn cây H. bonariensis, sơ đồ 2.1 35 Bảng 2.5. Sắc ký cột cao ethyl acetate của toàn cây H. bonariensis, sơ đồ 2.1 36 Bảng 2.6. Sắc ký cột cao methanol của toàn cây H. bonariensis, sơ đồ 2.1 36 viii Bảng 2.7. Sắc ký cột cao ether dầu hỏa của lá cây H. bonariensis, sơ đồ 2.2 40 Bảng 2.8. Sắc ký cột cao chloroform của lá cây H. bonariensis, sơ đồ 2.2 40 Bảng 2.9. Sắc ký cột cao ethyl acetate của lá cây H. bonariensis, sơ đồ 2.2 40 Bảng 2.10. Sắc ký cột diaion cao butanol của lá cây H. bonariensis, sơ đồ 2.2 41 Bảng 2.11. Sắc ký cột cao ether dầu hỏa của lá cây H. vulgaris, sơ đồ 2.3 44 Bảng 2.12. Sắc ký cột cao chloroform của lá cây H. vulgaris, sơ đồ 2.3 44 Bảng 2.13. Sắc ký cột cao ethyl acetate của lá cây H. vulgaris, sơ đồ 2.3 44 Bảng 2.14. Sắc ký cột diaion cao butanol của lá cây H. vulgaris, sơ đồ 2.3 45 Bảng 2.15. Sắc ký cột pha đảo phân đoạn V.B4 của cao butanol (3,74 g) của lá cây H. vulgaris, sơ đồ 2.3 Bảng 3.1. 45 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb C1.1 so sánh với tetrahydropalmatin 54 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb Flaw3 so sánh với (S)-xylopinine 56 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của Hb-Ea5 so sánh với cerebroside (2) có cùng CTPT (C48H93O10N) và với leucocerebroside-Lb4 (C49H95O10N) có cùng gốc đường Bảng 3.4. 60 Số liệu phổ NMR của Hb-Ea6 so sánh với serratula-cerebroside (*) có cùng CTPT (C40H77O9N) Bảng 3.5. 64 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Ea11 so sánh với leucocerebroside -Lb1 có cùng CTPT (C45H87O9N) 60 Bảng 3.6. Kết quả thăm dò [M+ Na]+ từ phổ LC-MS của m u Hb-T4 70 Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của các hợp chất cerebroside đã cô lập 72 Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hv-PE5 so sánh với hinokinin 74 Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Clo so sánh với hinokinin và savinin 77 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-A3 và phổ mô phỏng 79 Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Flaw1 so sánh với esculetine 80 Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Bu1 so sánh với quercetin 82 Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Flaw2 so sánh với kaempferol 84 ix Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của Hb-Bu2, Hv-A1 so sánh với quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside (hyperoside) 86 Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của Hb-Bu3 so sánh với astragalin 88 Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của Hv-Bu3 so sánh với hesperidin 90 Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của Hv-Ch4 so sánh với etyl β-D-glucopyranoside 92 Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của Hb-M1 so sánh với sucrose 94 Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của Hb-PE so sánh với β -sitosterol 96 Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của Hb-EA1.4 so sánh với spinasterol 98 Bảng 3.21. Số liệu phổ NMR của Hv-PE4, Hb-C2 so sánh với stigmasterol 99 Bảng 3.22. Số liệu phổ NMR của Hb-C3 so sánh với stigmastan-3,6-dione 102 Bảng 3.23. Số liệu phổ NMR của Hb-C10, Hv-C5 so sánh với daucosterol 103 Bảng 3.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Ea8 và các chất so sánh 106 Bảng 3.25. Số liệu phổ NMR của Hb-M5 so sánh với dioscin 109 Bảng 3.26. Số liệu phổ NMR của Hb-Eter so sánh với squalene 111 Bảng 3.27. Số liệu phổ NMR của Hb-A1 so sánh với lupeol 112 Bảng 3.28. Số liệu phổ NMR của Hb-C11 so sánh với ursolic acid 115 Bảng 3.29. Tính chất vật lý và thu suất (%) so với nguyên liệu tươi ban đầu của tinh dầu hai cây H. bonariensis và H. vulgaris 116 Bảng 3.30. Các cấu phần cuả tinh dầu của các bộ phận trong cây H.bonariensis 118 Bảng 3.31. Các cấu phần cuả tinh dầu của các bộ phận trong cây H. vulgaris 114 Bảng 3.32. Giá trị LC50 của các m u trong thử nghiệm Brine-shrimp 126 Bảng 3.33. Kết quả thử nghiệm độc tính với tế bào ung thư (in vitro) của tinh dầu, cao trích và chất cô lập được từ H. bonariensis và H. Vulgaris 127 Bảng 3.34. Kết quả thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu hai cây 128 x LỜI NÓI ĐẦU Ngày nay nhiều kỹ thuật hiện đại được ứng dụng trong phân tích hóa hữu cơ, sinh hóa đã góp phần hữu hiệu cho việc nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, do vậy, ngày càng có nhiều kết quả nghiên cứu mới giải quyết tiếp những vấn đề trước đây chưa hoàn chỉnh và phục vụ tốt hơn cho cuộc sống. Trong số nhiều loài thực vật, chúng tôi lưu ý đến các cây thuộc chi Hydrocotyle, chẳng những vì sự phong phú về chủng loại mà còn vì tính năng đa dụng của chúng trong đời sống. Một số cây thuộc chi Hydrocotyle mọc dễ nơi ẩm mát và còn được trồng phổ biến làm rau ăn không những ở nước ta và ở nhiều nước khác cùng có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm. Một số cây trong chi này còn có khả năng phát triển ở những nơi khí hậu giá lạnh như Canada, ở những nơi khô cằn như miền duyên hải nước Úc… Một số cây thuộc chi này vừa là thực phẩm vừa là dược phẩm - không chỉ theo các tài liệu y học cổ truyền mà cả trong các y văn hiện đại. Các nghiên cứu hóa học và dược học trên nguồn cây này đã được tiến hành từ rất sớm và cho đến thời gian gần đây theo hướng tập trung chuyên sâu trên một vài cây có nhiều công dụng, điển hình như Hydrocotyle asiatica, Hydrocotyle sibthorpioides. Trong những năm gần đây, ở vùng đồng bằng sông Cửu Long có các loài rau má lá tròn gần giống lá sen, có hương thơm, vị đắng thường được trồng làm kiểng, sử dụng lá làm rau ăn, được gọi là rau má lá sen, rau má Nhật, rau má Thái. Các loài này có tên khoa học là Hydrocotyle bonariensis Comm ex. Lam và Hydrocotyle vulgaris L., chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Với ý định tìm hiểu về chi thực vật rất gần gũi với cuộc sống này chúng tôi chọn thực hiện đề tài khảo sát thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của các cây rau má lá sen, Hydrocotyle bonariensis Comm ex. Lam và Hydrocotyle vulgaris L. thuộc chi Hydrocotyle, (Apiaceae). xi Nội dung chính được thực hiện trong luận án này là khảo sát thành phần hóa học của hai cây, phân tích xác định các hợp chất hữu cơ bậc hai và thành phần tinh dầu. Bên cạnh đó, một vài thử nghiệm hoạt tính sinh học cũng được thực hiện trên các cao trích, tinh dầu và một vài hợp chất tinh khiết cô lập được. Chúng tôi chọn thử nghiệm hoạt tính gây độc trên một vài dòng tế bào ung bướu, tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và sơ bộ khảo sát khả năng làm lành vết thương (in vivo) nhằm góp phần tìm hiểu về tiềm năng sử dụng của các cây này, căn cứ theo hoạt tính đã biết của các cây rau má đã được nghiên cứu. Việc khảo sát thành phần hóa học của các cây rau má lá sen, Hydrocotyle bonariensis Comm ex. Lam và Hydrocotyle vulgaris L. góp phần làm sáng tỏ hóa– thực vật của chi Hydrocotyle, hiện có rất ít thông tin. xii CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT Đề tài nghiên cứu trên 2 loài cây thuộc chi Hydrocotyle chưa được khảo sát kỹ về thành phần hóa học, gồm: Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L. Chi Hydrocotyle, thuộc họ Ngò, Apiaceae, là tập hợp hơn 30 loài, có những đặc điểm chung là cây thảo, lá tròn hoặc có khía, thân bò và phân nhánh từ đốt rễ. Theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ, Đỗ Tất Lợi, Võ Văn Chi, Trần Hợp,[1,4,6] ở Việt Nam có hơn mười loài của chi này. Trong số các loài thuộc chi Hydrocotyle, gần đây người dân vùng đồng bằng sông Cửu long quen dần với sự xuất hiện của các loài rau má với đặc điểm lá tròn như lá sen và có khía tai bèo, cuống lá màu trắng ở giữa tâm lá, có hương thơm nhẹ. Chúng tôi đã thu thập được hai loài rau má lá sen có hình thái thực vật rất gần nhau, chỉ khác biệt về hoa, được gọi tên thường là rau má lá sen phiến lớn, hoa chùm và rau má lá sen phiến nhỏ, hoa phân tầng. Hai loài này đã được nhận danh là Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vugaris L. bởi Dược sĩ Phan Đức Bình, công tác ở ban Biên tập Tạp chí Thuốc và Sức khỏe, Thành phố Hồ Chí Minh, và Thạc sỹ Nguyễn Thị Kim Huê, bộ môn Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. Mô tả chi tiết của các cây này giúp dễ phân biệt được chúng, như sau. 1.1.1 Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam., Cây rau má lá sen phiến lớn [85] Tên khoa học: Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. (Hình 1.1) Tên thông thường: Rau má lá sen phiến lớn, rau má Thái. Cỏ lưu niên, dạng thân rễ, mọc bò, tại mỗi đốt có nhiều rễ và cho ra 1–2 lá vươn thẳng lên, cọng lá nhẵn dài 15–20 cm. Lá hình lọng, phiến tròn, mỏng, rộng 3–12 cm, có thuỳ cạn, mép lá khía tai bèo, cuống lá đính ở giữa chứ không phải ở mép như các cây khác. Tán hoa đường kính 1–6 cm gồm nhiều tia tụ tạo vòng rộng, cọng cuống chính có thể dài tới 40 cm; cuống nhỏ dài 0,2–2 cm. Hoa nhỏ, 5 cánh màu trắng hoặc vàng kem, lá đài nhọn màu lục. Cây này sống dễ nơi ẩm ướt nhưng cũng chịu được môi trường khô. 1 Xuất xứ ở nam Mỹ, Úc. Loài này có hương thơm đặc trưng, vị đắng và được người dân vùng đồng bằng sông Cửu Long dùng làm rau ăn. 1.1.2 Hydrocotyle vulgaris L. Cây rau má lá sen phiến nhỏ, hoa tán phân tầng [6] Tên khoa học: Hydrocotyle vulgaris L. (Hình 1.2) Tên thông thường: Rau má lá sen phiến nhỏ, rau má Nhật. Cỏ lưu niên, sống trong môi trường ẩm ướt, tập trung thành quần thể lớn. Phiến lá hình tròn, đường kính khoảng 0,8–3,5 cm, có khía tai bèo, có 6–9 gân lá chính, xoè ra từ chỗ nối của lá với cuống lá, ngay tâm lá. Hoa lưỡng tính, màu trắng, hồng nhạt, hoặc hơi xanh, đường kính 1 mm. Trong một cụm hoa có từ 3–6 hoa đơn, mỗi hoa cách nhau khoảng 3 mm, đôi lúc có 1–3 vòng hoa bên dưới. Cây thích hợp với môi trường ẩm ướt hoặc đất sét. Xuất xứ: Châu Âu, Châu Phi, vùng bắc Mỹ. Ở nước ta cây này thường được trồng làm kiểng, lá không thơm như loài rau má lá sen phiến lớn. Hình 1.1: Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. Cây rau má lá sen phiến lớn, hoa chùm tán Hình 1.2: Hydrocotyle vulgaris L. Cây rau má lá sen hoa tán phân tầng 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC Chi Hydrocotyle thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), gồm nhiều loài lưu niên, thường có mùi thơm với thân cây rỗng, sống dễ trong môi trường ẩ m. Cho đến nay, chỉ có một số ít loài trong chi Hydrocotyle được nghiên cứu thành phần hóa học như: rau má mơ – Hydrocotyle asiatica L. (Centella asiatica Linn.), rau má 2 nhỏ – H. sibthorpioides Lam., H. rotundifolia Roxb., rau má Nam Mỹ – H. ranunculoides L. f., H. ramiflora Maxim., H. umbellata Linn. Trong số này, loài Hydrocotyle asiatica L. được quan tâm nghiên cứu nhiều về mặt hóa học cùng hoạt tính sinh học và có nhiều kết quả được ứng dụng rộng rãi. Do cả hai loài Hydrocotyle bonariensis và Hydrocotyle vulgaris đều chưa được nghiên cứu thành phần hóa học ở Việt Nam, và trên thế giới chỉ có một vài công bố về thành phần flavonoid của Hydrocotyle vulgaris, nên chúng tôi đã tìm hiểu thành phần hóa học của vài loài khác thuộc chi Hydrocotyle qua các công trình đã công bố ở trong và ngoài nước để làm tiền đề định hướng nghiên cứu. 1.2.1 Hydrocotyle asiatica L. (hay Centella asiatica Linn.) Thành phần hóa học của cây có ít nhiều thay đổi theo từng vùng phân bố.[1,6] Các hợp chất chi phương, mạch carbon dài với 2 liên kết ba trong phân tử (nhóm chất acetylenic) đã được cô lập từ loài cây này. Năm 1973, Schulte K.E.[60] cô lập được các hợp chất mạch thẳng có cấu trúc diyn (acetylenic) như: pentadeca1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol (1); 10-acetoxypentadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol (2); 3,8-diacetoxypentadeca-1,9-dien-4,6-diyn (3); 1-acetoxypentadeca-2,9-dien-4,6- diyn-1-ol (4). Năm 1975, Bohlmann Ferdinand và cộng sự[13] đã phát hiện thêm 14 hợp chất dẫn xuất acetylenic khác (5–18). Theo tài liệu của Jacinda T. James,[31] nhiều hợp chất triterpenoid có trong cây đã được cô lập và đề nghị cấu trúc: Trong những năm 1959-1967, với nguyên liệu thu ở Madagasca những nghiên cứu của Pinhas H., của Polonsky J. cùng cộng sự[54] đã cô lập được acid asiatic (45), acid madecassic (46) và các saponin gọi là asiaticoside (cấu trúc không mô tả rõ), madecassoside (65). Ngoài ra, từ nguyên liệu ở Ấn độ, năm 1963-1969, Rastogi R.P. cô lập các hợp chất triterpenic như methyl asiatate (58), brahmol (66), cùng với acid brahmic (tên gọi khác của acid madecassic, 46) và brahminoside (tên gọi khác của madecassoside, 65); và năm 1968, Dutta T. và cộng sự cô lập được acid isothankunic (48). Năm 1989, Sahu Niranjan và cộng sự[59] cô lập acid terminolic (51) và xác định cấu trúc asiaticoside A (57), asiaticoside B (68). Năm 1995, Muslim Tanvir và 3 cộng sự,[50] cô lập được acid 2α,3β-dihydroxy-5-hydroxymethy-24-norolean-12-en28-oic (52). Năm 2001, từ nguyên liệu ở Sri Lanka, Hisashi Matsuda cùng cộng sự[26] cô lập, xác định cấu trúc acid madasiatic (47), acid 3β,6β,23-trihydroxyolean12-en-28-oic (53), hai saponin có aglycon là acid madecassic gọi là centellasaponin B, C (63, 64) và hai saponin khung oleanan với nối đôi tại C-13 và C-18, gọi là centellasaponin A, D (70, 71). Năm 2005, Jiang Z.Y. và cộng sự[33] cô lập các saponin với cấu trúc aglycon là acid asiatic đặt tên là asiticoside C, D, E, F (59, 60, 61, 62). Năm 2007, Yu Q.L. và cộng sự [79] cô lập được scheffuloside B (67) là saponin có mạch aglycon là acid 2α,3β, 23-trihydroxyurs-20-en-28-oic (49). Theo Đỗ Tất Lợi,[2] từ loài này, năm 1960, Rastogi R.P. đã cô lập được quercetin (33), quercetin 3-O-glucoside (35), kaempferol (37), kaempferol 3-Oglucoside (38). Trong cây còn chứa tannin, carotenoid, vitamin C, acid glutamic, serin, alanin và alkaloid (C22H33O8N, do Chopra và cộng sự cô lập năm 1956, gọi tên là hydrocotylin, tuy nhiên không tìm được tài liệu gốc mô tả cấu trúc hợp chất). Tinh dầu của cây thu ở Malaysia[9] có 41 cấu tử, trong đó các sesquiterpene là thành phần chính (80%) với germacrene-D (101) chiếm 10%, ngoài ra có các monoterpene, camphor (107), α-selinene (111) và caryophylen oxide (120). Nghiên cứu với cây mọc ở Sri Lanca,[49] tinh dầu có trans-β-farnesene (109; 53,0%), α-copaene (115; 14,0%), β-caryophyllene (102; 12,5%) và α-humulene (112; 9,0%). Ngoài ra, năm 1996, Srivastava R. và cộng sự[69] cô lập được stigmasterol (96) và hai hợp chất khác là 11-oxoheinicosanylcyclohexan (99) và acid dotriaconta-8-en-1-oic (100). 1.2.2 Hydrocotyle bonariensis Hydrocotyle bonariensis chủ yếu được khảo sát về thực vật học,[24] và gần đây có một khảo sát hóa học đã cô lập sáu saponin triterpenoid (86)-(91).[70] 1.2.3 Hydrocotyle leucocephala Cham. Năm 2006, Freddy R. và cộng sự[22] công bố trong cây H. leucocephala có chứa các hợp chất acetylenic, monoterpenoid, ceramide và cerebroside. Ba hợp chất acetylenic là (8R,9R,10R)-heptadeca-1-en-4,6-diyn-3,8,9,10-tetraol 4 (17); (8R,9R,10R)-8-acetoxyheptadeca-1-en-4,6-diyn-3,9,10-triol (18); (8R,9R,10R)-9acetoxyheptadeca-1-en-4,6-diyn-3,8,10-triol (19). Hỗn hợp leucoceramide gồm bảy hợp chất (20)-(26), hỗn hợp leucocerebroside gồm sáu hợp chất (27)-(32). 1.2.4 Hydrocotyle ramiflora Maximowicz Năm 1998, Kwon H.C. và cộng sự[40] cô lập được từ H. ramiflora M. hai hợp chất là (2S,3R)-1-O-(7Z,10Z,13Z-hexadecatrienoyl)-3-O-β-galactopyranosylglycerol (93) và (2S,3R)-1-O-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-3-O-β-galactopyranosyl glycerol (94); bên cạnh đó còn cô lập được spinasterol (97) và 3-acetoxycapsidiol (118). 1.2.5 Hydrocotyle ranunculoides L.f. Năm 1994, Della Greca và cộng sự[19] cô lập được từ H. ranunculoides các triterpen có khung sườn oleanan với nhiều nhóm hydroxyl là: 3-oxo-15α,16α, 21β, 22α,28-pentahydroxyoleana-12-en (54); 3-oxo-15α,16α,21β,22α,28-pentahydroxy oleana-1,12-dien (55) và acid 22,23-dihydroxy-3-oxo-17,22-secooleana-12,16-dien28-oic (56). Năm 1994-1995,[20] nhóm của ông còn cô lập và xác định cấu trúc bảy hợp chất oleanan glycoside khác gọi tên là các ranuncoside 1-7 (79)-(85). 1.2.6 Hydrocotyle rotundifolia Roxb., (water pennywort) Năm 2002, Minija Janardhanan và cộng sự[48] cho biết tinh dầu của H. rotundifolia chiếm hàm lượng 0,05% cây tươi, trong đó hợp chất myristicin (104) chiếm 16,66% lượng tinh dầu. 1.2.7 Hydrocotyle sibthorpioides Lam. Đối với loài H. sibthorpioides, cho đến nay có ít nhất 3 nhóm hợp chất hóa học được tìm thấy gồm: các flavonoid, tinh dầu và saponin triterpene. Năm 1982, Shigematsu Nobuharu và cộng sự[64] cô lập được quercetin (33), isorhamnetin (34), quercetin 3-O-galactoside (36), và quercetin 3-O- -D-(6"caffeoyl)galactoside (40). Năm 2004, Li Jiang và cộng sự[41] xác định được lượng flavone tổng trong cây H. sibthorpioides var. sibthorpioides Lam và H. sibthorpioides Lam var. batrachium (Hance). 5 Loài này có mùi thơm nên đã có nhiều nghiên cứu tinh dầu được thực hiện. Năm 1982, Asakawa Yoshinori và cộng sự[9] cho biết thành phần chính trong tinh dầu H. sibthorpioides là trans β-farnesene (109). Năm 2002, Minija J. và cộng sự[48] nghiên cứu cây H. sibthorpioides L. thu hái ở Ấn độ cho biết những thành phần chính trong tinh dầu toàn cây, với hàm lượng theo thứ tự giảm dần, là dillapiole (103), fenchone (105), anisole (106), α-humulene (112), α-bergamotene (113), βeudesmene (116), α-bisabolol (117), globulol (119). Năm 2005, Yu-Kuan Chou[85] khảo sát tinh dầu cây H. sibthorpioides thu hái ở Đài loan định danh được 34 cấu tử gồm các monterpenoid, sesquiterpenoid và thành phần chính là các sesquiterpene (31,74%), trong đó hợp chất α-santalene (114) chiếm hàm lượng cao nhất (11,94%). Năm 2003, Yukimi Sasaki và cộng sự[80] đã cô lập và xác định cấu trúc của 7 hợp chất saponin có khung sườn oleanan, đặt tên là các hydrocotyloside I-VII (72)-(78), cùng với hợp chất saponin gọi tên là udosaponin B (69), {acid 3-O-β-Dgalactopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranoside]-olean-12-en-28-oic 28-O-β-Dglucopyranoside}. 1.2.8 Hydrocotyle umbellata Linn. Năm 2005, Warinthorn Chavasiri và cộng sự[84] cô lập được một triterpene glycoside là methyl oleanolate 3-O-[-β-D-glucopyranosyl-(1→6)][-β-D-gluco pyranosyl-(1→6)][-β-D-glucopyranoside] (92) cùng hai hợp chất sterol là stigmasterol (96) và stigmasta-7,25-dien-3-ol (98). 1.2.9 Hydrocotyle vulgaris L. Năm 1981, Voigt Gabriele và cộng sự[25,73] cô lập được từ cây tươi H. vulgaris các flavonol glycoside là: quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside (36), quercetin 3-O-robinobioside (hay quercetin 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)][-βD-galactopyranoside) (41), quercetin 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→6)][-β-Dgalactopyranoside] (43), kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside (39), kaempferol 3-O-robinobioside (42) và kaempferol 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→6)][-β-Dgalactopyranoside] (44). 6