BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ THỊ BẠCH
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG
KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN
(Euphorbia hirta L.) VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 9.44.01.14
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Bùi Thị Bửu Huê
2. PGS. TS. Lê Tiến Dũng
Cần Thơ – 2020
i
LỜI CAM ĐOAN
----------
Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Bùi Thị Bửu Huê và PGS.TS. Lê Tiến Dũng.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa được công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
TP. Cần Thơ, tháng 05 năm 2020
Tác giả luận án
Lê Thị Bạch
ii
LỜI CẢM ƠN
---------Trong suốt quá trình thực hiện luận án, tôi đã học hỏi thêm được rất nhiều kiến
thức, kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn bổ ích, thiết thực từ quý thầy cô và bạn bè.
Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gởi lời trân trọng cảm ơn đến:
+ PGS.TS Bùi Thị Bửu Huê, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên,
Trường Đại học Cần Thơ
+ PGS.TS Lê Tiến Dũng, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam
là hai Thầy Cô trực tiếp hướng dẫn, đã dành nhiều thời gian, công sức để truyền
đạt cho tôi những kiến thức quý báu, hướng dẫn tận tình, giúp tôi định hướng con đường
nghiên cứu của mình trong suốt quá trình thực hiện luận án.
+ GS. Joëlle Quetin-Leclercq, Trường Đại học Catholique de Louvain, Bỉ
đã dành nhiều thời gian hướng dẫn khoa học cho tôi trong thời gian nghiên cứu
tại Bỉ cùng những kinh nghiệm, góp ý quý báu của GS dành cho tôi.
+ Trân trọng cám ơn GS. Kaeko Kamei và GS. Kenji Kanaori ở Viện Công nghệ
Kyoto, Nhật Bản
đã hỗ trợ hóa chất, dụng cụ trong quá trình thực hiện thí nghiệm ở Viện Kyoto
cũng như đã giúp đỡ việc đo phổ NMR, HRMS của các chất sạch phân lập được.
+ Chân thành cám ơn dự án AQUABIOACTIVE, ARES – dự án hợp tác giữa
các trường Đại học ở Bỉ và Đại học Cần Thơ
đã hỗ trợ kinh phí giúp tôi hoàn thành luận án.
+ Quý Thầy - Cô: GS.TS Nguyễn Cửu Khoa, PGS.TS Trần Ngọc Quyển, TS.
Nguyễn Hoàng Duy, TS. Lại Thị Kim Dung, TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy, TS Nguyễn
Đại Hải… Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam
là những Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu, đã giảng dạy,
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành các học phần, các chuyên đề.
iii
+ Quý Thầy, Cô cùng các Anh, Chị, Em ở Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự
nhiên, Trường Đại học Cần Thơ đặc biệt là anh Nguyễn Trọng Tuân và em Mai Văn
Hiếu
là những người bạn đồng môn đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
+ Xin cám ơn hai bạn đồng nghiệp Trương Quỳnh Như và Nguyễn Lê Anh Đào
đã đồng hành, hỗ trợ cho các thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
+ Xin cám ơn các em sinh viên lớp Hóa học và Hóa dược K39, K40 đã đồng hành
cùng tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện luận án.
+ Chân thành cám ơn gia đình đã luôn quan tâm và san sẻ khó khăn.
* Xin gởi lời chân thành cám ơn đến các cấp lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng và Trường Đại học Cần Thơ đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành chương trình đào tạo bậc tiến sĩ.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn.
Cần Thơ, tháng 05 năm 2020
Lê Thị Bạch
iv
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................viii
DANH MỤC PHỤ LỤC ........................................................................................... xi
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
Giới thiệu về chi Euphorbia .................................................................................. 3
Đặc điểm thực vật của chi Euphorbia ........................................................ 3
Hoạt tính sinh học của chi Euphorbia ........................................................ 4
Thành phần hóa học của chi Euphorbia ..................................................... 7
Tổng quan về Cỏ sữa lá lớn................................................................................. 21
Đặc điểm thực vật .................................................................................... 21
Công dụng trong dân gian ........................................................................ 22
Hoạt tính sinh học của Cỏ sữa lá lớn ........................................................ 23
Thành phần hóa học của Cỏ sữa lá lớn ..................................................... 26
Tổng quan về miễn dịch ...................................................................................... 36
Miễn dịch và miễn dịch học ..................................................................... 36
Các loại miễn dịch ................................................................................... 37
Lysozyme ................................................................................................ 38
Bổ thể ...................................................................................................... 38
Kháng thể ................................................................................................ 39
Miễn dịch học ứng dụng trong cá............................................................. 39
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 41
Mẫu thực vật, hóa chất và thiết bị ....................................................................... 41
Mẫu thực vật............................................................................................ 41
Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 41
Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 42
Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng .................................................... 42
Xác định hàm lượng tổng polyphenol và flavonoid .................................. 42
Phương pháp phân lập các hợp chất ......................................................... 42
v
Phương pháp xác định cấu trúc và định danh ........................................... 43
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học ............................................ 43
THỰC NGHIỆM............................................................................... 51
Sàng lọc các đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt tính tăng cường hệ miễn
dịch trên cá tra ........................................................................................................... 51
Chiết tách, phân lập các hợp chất từ Cỏ sữa lá lớn .............................................. 52
Xử lý nguyên liệu và điều chế các cao phân đoạn .................................... 52
Phân lập các hợp chất .............................................................................. 52
Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ Cỏ sữa lá lớn 60
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 63
Kết quả sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra của 20 cao chiết . 63
Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần của Cỏ sữa lá lớn ............... 66
Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập ......................................................... 67
Hợp chất Eup16 (chất mới) ...................................................................... 67
Các hợp chất flavonoid ............................................................................ 71
Các hợp chất phenol ................................................................................ 92
Các hợp chất triterpenoid ......................................................................... 95
Hợp chất steroid .................................................................................... 104
Hợp chất diterpenoid ............................................................................. 106
Hợp chất khác........................................................................................ 108
Kết quả đánh giá hoạt tính tăng cường miễn dịch .............................................. 112
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ............................................................ 115
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa.......................................................... 119
Hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH và ABTS•+ ............... 119
Kết quả đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6 .................. 120
Khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress ............................................. 125
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 129
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN.................. 132
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 134
vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Tiếng Anh
Diễn giải
13C-NMR
Carbon
(13)
Resonance
Nuclear
Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
carbon 13
1D-NMR
one-Dimensional
Resonance
Nuclear
Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
chiều
1H-NMR
Proton Nuclear Magnetic Resonance
2D-NMR
two-Dimensional
Resonance
ABTS
2,2-azino-bis(3-ethylbenzo thiazoline-6sulphonic acid)
BHT
Butylated hydroxytoluene
br s
Broad singlet
Tín hiệu đơn rộng
CC
Column chromatography
Sắc ký cột
Nuclear
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton
Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2
chiều
CD3COCD3
CH3COCH3 đã thế hydro (H)
bằng deuteri (D)
CD3OD
CH3OH đã thế hydro (H) bằng
deuteri (D)
CHCl3
Chloroform
CDCl3
CHCl3 đã thế hydro (H) bằng
deuteri (D)
COSY
Correlation Spectrocopy
Phổ COSY
d
Doublet
Mũi đôi
DCM
Dichloromethane
dd
Doublet of doublets
DEPT
Distortionless
Enhancement
Polarization Transfer
DMSO
Dimethylsulfoxyde ((CH3)2SO)
DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
Dulbecco’s
Modified
Medium
DMEM
Mũi đôi đôi
by Phổ DEPT
Eagle Môi trường nuôi cấy tế bào
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu Long
ĐTĐ
Đái tháo đường
EtOAc
Ethyl acetate
ER
Endoplasmic reticulum
Fourier transform-infrared spectroscopy
FT-IR
Mạng nội chất
Phổ hồng ngoại
vii
HMBC
HR-ESI-MS
Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua
nhiều liên kết
High Resolution Electrospray Ionization Phổ khối lượng ion hóa phân
giải cao
Mass Spectrum
Single
Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân trực
tiếp H→C
HSQC
Heteronuclear
Coherence
Hz
Hertz
IC50
Inhibitory concentration at 50%
Đơn vị đo tần số
Nồng độ ức chế 50% đối
tượng thử nghiệm
Hằng số ghép spin
m
Multiplet
Mũi đa
MeOH
Methanol
MIC
Minimum Inhibitory Concentration
Nồng độ ức chế tối thiểu
MIN6
Mouse Insulinoma 6
Tế bào tụy tạng
MS
Mass Spectroscopy
Khối phổ
BuOH
n-butanol
NOESY
Nuclear Overhauser Effect Spectrocopy
Phổ NOESY
ppm
parts per million
Phần triệu
J
Peak
Mũi tín hiệu
q
Quartet
Rf
Retention factor
RNS
Reactive nitrogen species
Phần tử hoạt động chứa nitơ
ROS
Reactive oxygen species
Phần tử hoạt động chứa oxi
TOCSY
Total Correlated Spectrocopy
Phổ TOCSY
s
Singlet
Mũi đơn
t
Triplet
Mũi ba
TLC
Thin layer chromatography
Sắc ký bản mỏng
TMS
Tetramethylsilane
H
Proton chemical shift
C
Carbon chemical shift
UV-Vis
Ultraviolet - visible spectroscopy
Mũi bốn
Độ dịch chuyển hóa học của
proton (ppm)
Độ dịch chuyển hóa học của
carbon (ppm)
Phổ tử ngoại - khả kiến
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Danh sách các loài thực vật thuộc chi Euphorbia ở Việt Nam ...................... 3
Bảng 1.2 Các hợp chất được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn và các loài khác thuộc chi
Euphorbia.................................................................................................................. 32
Bảng 3.1 Danh sách các cao chiết ethanol tổng thu được ........................................... 51
Bảng 4.1 Kết quả sàng lọc các chỉ tiêu miễn dịch trên cá tra của 20 cao chiết............ 65
Bảng 4.2 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup16 và số liệu tham khảo ............... 70
Bảng 4.3 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup01 và số liệu tham khảo ............... 73
Bảng 4.4 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup02 và số liệu tham khảo ............... 74
Bảng 4.5 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup04 và số liệu tham khảo ............... 76
Bảng 4.6 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup05 và số liệu tham khảo ............... 78
Bảng 4.7 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup08 và số liệu tham khảo ............... 80
Bảng 4.8 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup09 và số liệu tham khảo ............... 81
Bảng 4.9 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup11 và số liệu tham khảo ............... 83
Bảng 4.10 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup14 và số liệu tham khảo ............. 85
Bảng 4.11 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup15 và số liệu tham khảo ............. 87
Bảng 4.12 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup19 và số liệu tham khảo ............. 89
Bảng 4.13 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup21 và số liệu tham khảo ............. 91
Bảng 4.14 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup10 và số liệu tham khảo ............. 92
Bảng 4.15 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup12 và số liệu tham khảo ............. 93
Bảng 4.16 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup13 và số liệu tham khảo ............. 94
Bảng 4.17 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup06 và số liệu tham khảo ............. 96
Bảng 4.18 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup07 và số liệu tham khảo ............. 98
Bảng 4.19 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup17 và số liệu tham khảo ........... 101
Bảng 4.20 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup03 và số liệu tham khảo ........... 103
Bảng 4.21 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup20 và số liệu tham khảo ........... 105
Bảng 4.22 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup23 và số liệu tham khảo ........... 107
Bảng 4.23 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup18 và số liệu tham khảo ........... 109
Bảng 4.24 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn ........................... 110
Bảng 4.25 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết .................................... 117
Bảng 4.26 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của chất phân lập và kháng sinh đối chứng
................................................................................................................................ 118
Bảng 4.27 Kết quả MIC của các mẫu thử ................................................................ 119
Bảng 4.28 Hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS•+ của các mẫu thử ........... 120
ix
Bảng 4.29 Khả năng gây độc tế bào của Cỏ sữa lá lớn ............................................. 121
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Hình lá và hoa, mẫu tiêu bản của Cỏ sữa lá lớn........................................... 22
Hình 2.1 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH của chất kháng oxi hóa...................... 46
Hình 2.2 Phản ứng hình thành gốc tự do ABTS• ...................................................... 47
Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn ME 2.6 và ME 4 từ cao methanol
.................................................................................................................................. 54
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn ME 2.5 và ME 5 từ cao methanol
.................................................................................................................................. 54
Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất của cao chiết n-butanol từ Cỏ sữa lá lớn ......... 56
Hình 3.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn EE 2, 5, 6 từ cao ethyl acetate . 58
Hình 3.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn EE 7, 8, 9 từ cao ethyl acetate . 58
Hình 3.6 Sơ đồ phân lập các hợp chất của cao chiết n-hexane từ Cỏ sữa lá lớn ......... 59
Hình 4.1 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên hoạt tính lysozyme của (A) tế bào máu và
(B) tế bào thận cá tra so với đối chứng DMSO........................................................... 63
Hình 4.2 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên hoạt tính bổ thể của (A) tế bào máu và
(B) tế bào thận cá tra so với đối chứng DMSO........................................................... 64
Hình 4.3 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên tổng kháng thể của (A) tế bào máu và (B) tế
bào thận cá tra so với đối chứng DMSO .................................................................... 65
Hình 4.4 Công thức cấu tạo của 12-hydroxy jasmonic acid ....................................... 69
Hình 4.5 Các tương quan HMBC chính của hợp chất Eup16 .................................... 69
Hình 4.6 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup16 ...................................................... 70
Hình 4.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup01 và Eup02 ........................................ 75
Hình 4.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup04 và Eup05 ........................................ 77
Hình 4.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup08 và Eup09 ........................................ 82
Hình 4.10 Tương quan HMBC trong vòng B của hợp chất Eup14 ............................ 86
Hình 4.11 Tương quan HMBC trong vòng A của hợp chất Eup14 ............................ 86
Hình 4.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup11, Eup14 và Eup15 ......................... 88
Hình 4.13 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup19 và Eup21 ...................................... 90
Hình 4.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup10, Eup12 và Eup13 ......................... 94
Hình 4.15 Tương quan HMBC của hợp chất Eup06.................................................. 96
Hình 4.16 Tương quan HMBC của hợp chất Eup17................................................ 101
Hình 4.17 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup06, Eup07 và Eup17...................... 102
x
Hình 4.18 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup03 và Eup20 .................................. 106
Hình 4.19 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup23 và Eup18 .................................. 109
Hình 4.20 Hoạt tính lysozyme của tế bào bạch cầu cá tra ........................................ 113
Hình 4.21 Hoạt tính bổ thể của tế bào bạch cầu cá tra ............................................. 114
Hình 4.22 Hoạt tính tổng kháng thể của tế bào bạch cầu cá tra ................................ 114
Hình 4.23 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến tế bào MIN6 ..................................... 122
Hình 4.24 Ảnh hưởng của cao chiết đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6 do H2O2 gây ra
................................................................................................................................ 123
Hình 4.25 Ảnh hưởng của rutin, quercitrin, taraxerol đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6
do H2O2 gây ra ......................................................................................................... 123
Hình 4.26 Ảnh hưởng của luteolin, quercetin, caffeic acid đến khả năng bảo vệ MIN6
do H2O2 gây ra ......................................................................................................... 125
Hình 4.27 Ảnh hưởng của cao chiết đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6 do TG gây ra
................................................................................................................................ 126
Hình 4.28 Ảnh hưởng của rutin, quercitrin, taraxerol đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6
do TG gây ra ............................................................................................................ 126
Hình 4.29 Ảnh hưởng của luteolin, quercetin, caffeic acid đến khả năng bảo vệ tế bào
MIN6 do TG gây ra.................................................................................................. 127
xi
DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Các phổ của hợp chất Eup16 (sodium β-D-glucopyranosyl 12
hydroxyjasmonate) .................................................................................................. 160
Phụ lục 2: Các phổ của hợp chất Eup01 (quercitrin) ............................................... 186
Phụ lục 3: Các phổ của hợp chất Eup02 (rutin) ....................................................... 195
Phụ lục 4: Các phổ của hợp chất Eup04 (avicularin)............................................... 202
Phụ lục 5: Các phổ của hợp chất Eup05 (astragalin) ............................................... 206
Phụ lục 6: Các phổ của hợp chất Eup08 (luteolin) .................................................. 209
Phụ lục 7: Các phổ của hợp chất Eup09 (quercetin) ................................................ 212
Phụ lục 9: Các phổ của hợp chất Eup14 (afzelin) ................................................... 221
Phụ lục 10: Các phổ của hợp chất Eup15 (myricitrin) ............................................. 227
Phụ lục 11: Các phổ của hợp chất Eup19 (hymenoxin) ........................................... 234
Phụ lục 12: Các phổ của hợp chất Eup21 (cynaroside) ........................................... 241
Phụ lục 13: Các phổ của hợp chất Eup10 (caffeic acid) .......................................... 246
Phụ lục 14: Các phổ của hợp chất Eup12 (protocatechuic acid) .............................. 249
Phụ lục 15: Các phổ của hợp chất Eup13 (gallic acid) ............................................ 251
Phụ lục 16: Các phổ của hợp chất Eup06 (taraxerol) .............................................. 253
Phụ lục 17: Các phổ của hợp chất Eup07 (taraxerone) ............................................ 260
Phụ lục 18: Các phổ của hợp chất Eup17 (cycloart -23-ene-3β,25-diol).................. 264
Phụ lục 19: Các phổ của hợp chất Eup03 (3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien19-al) ....................................................................................................................... 273
Phụ lục 20: Các phổ của hợp chất Eup20 (campesterol) ......................................... 277
Phụ lục 21: Các phổ của hợp chất Eup23 (2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane) ....... 281
Phụ lục 22: Các phổ của hợp chất Eup18 (1-O-benzyl-rutinoside) ......................... 289
1
MỞ ĐẦU
Ngành thủy sản Việt Nam gần đây đã phát triển mạnh mẽ và giữ vai trò quan
trọng trong xuất khẩu. Tuy nhiên, đi đôi với việc phát triển nuôi trồng thủy sản thì dịch
bệnh cũng bùng phát mạnh mẽ và gây thiệt hại đáng kể. Việc sử dụng thuốc và hóa chất
sẽ gây ra nhiều trở ngại cho nghề nuôi như sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng
nhiều, ô nhiễm môi trường nuôi, sự tồn lưu thuốc trên cá thương phẩm ảnh hưởng đến
sức khoẻ của người tiêu dùng và cũng là rào cản cho các doanh nghiệp Việt Nam trong
xuất khẩu thủy sản. Để hạn chế dịch bệnh cũng như việc sử dụng thuốc và hóa chất trong
nuôi trồng thủy sản, một số giải pháp được nhiều người quan tâm và áp dụng trong các
mô hình nuôi thủy sản hiện nay như sử dụng các chất tăng cường miễn dịch, sử dụng
vaccine, chế phẩm sinh học hay các sản phẩm nâng cao miễn dịch không đặc hiệu…
Trong đó, sử dụng thảo dược để thay thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho vật
nuôi và kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm thủy sản… đang là hướng đi mới cho ngành
thủy sản.
Với sự khác biệt lớn về khí hậu, từ vùng gần xích đạo tới giáp vùng cận nhiệt đới,
cùng với sự phân hóa cao về địa hình đã góp phần tạo nên sự đa dạng về hệ sinh thái nói
chung cũng như hệ thực vật nói riêng ở Việt Nam. Theo các nhà khoa học, Việt Nam có
khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, 800 loài rêu và 600 loài nấm; trong đó, hơn 5.000
loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh, đặc biệt hơn là gần 90% trong số
chúng là cây thuốc mọc tự nhiên. Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong những quốc gia
có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng
cường sức khỏe. Đây là một nguồn hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được
nghiên cứu về mặt hóa học và hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất có thể phát triển
thành thuốc phục vụ cho đời sống và hướng nghiên cứu này đang được nhiều nhà khoa
học quan tâm.
Cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), theo Đông y có tác dụng thanh nhiệt, giải
độc, thông sữa, chống ngứa, được dân gian dùng làm thuốc hạ sốt, làm mát cơ thể, trị
ho, cảm lạnh, sổ mũi, viêm phổi và hen suyễn nhờ tác dụng làm giãn phế quản... Theo
kết quả sàng lọc ban đầu của chúng tôi trên tác dụng tăng cường hệ miễn dịch cá tra của
20 loài dược thảo, Cỏ sữa lá lớn thể hiện hoạt tính khá tốt, nhưng các nghiên cứu về
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này ở Việt Nam chưa nhiều. Do vậy
2
đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích hệ miễn dịch của Cỏ
sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) vùng Đồng bằng sông Cửu Long trên đối tượng cá
tra” được thực hiện nhằm đóng góp thêm những hiểu biết về thành phần hóa thực vật
cũng như tác dụng sinh học của loài Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam.
Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh
học của Cỏ sữa lá lớn, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản
phẩm ứng dụng trong thủy sản nói riêng hay cuộc sống nói chung.
Nội dung luận án bao gồm:
1. Sàng lọc các loài dược thảo có hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra;
2. Phân lập các hợp chất từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn thu hái tại thành phố Cần Thơ;
3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp
vật lý và hóa học;
4. Đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, hoạt tính kháng khuẩn,
kháng oxi hóa và hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 khỏi ER stress của các cao chiết và một
số hợp chất sạch phân lập được.
3
TỔNG QUAN
Giới thiệu về chi Euphorbia
Đặc điểm thực vật của chi Euphorbia
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae, còn gọi là họ Đại kích) là một họ lớn của thực vật
có hoa với khoảng 240 chi và 6000 loài. Phần lớn là cây thân thảo, nhưng ở khu vực
nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi hoặc cây thân gỗ. Một số loài cây chứa nhiều nước
và tương tự như các loài xương rồng. Họ này phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới, với
phần lớn các loài tập trung trong khu vực sinh thái Đông Dương Indomalaya và sau đó
là khu vực nhiệt đới châu Mỹ. Tại khu vực nhiệt đới Châu Phi cũng có nhiều loài, giống,
thứ, nhưng không đa dạng như hai khu vực kể trên [1].
Một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu là Euphorbia với khoảng 2000
loài [2]. Các loài thuộc chi Euphorbia có lá mọc so le với các lá kèm, hiếm khi mọc đối.
Hình dạng lá chủ yếu là lá đơn, nhưng cũng có loài có lá phức, chủ yếu là loại dạng chân
vịt, không thấy dạng lông chim. Các lá kèm có thể bị suy thoái thành gai, lông tơ hay
các tuyến nhỏ. Với một họ lớn như họ Thầu dầu, chắc chắn sẽ có sự đa dạng lớn về cấu
trúc hoa. Hoa thường có dạng đối xứng xuyên tâm và đơn tính, với hoa đực và hoa cái
thường cùng trên một cây. Quả thường là loại quả nứt, đôi khi là quả hạch. Loại quả nứt
là một loại quả nang với ba hoặc nhiều hơn các ô, mỗi ô tách ra khi chín thành các phần
riêng biệt [1, 3].
Theo GS. Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam có khoảng 30 loài thuộc chi Euphorbia
(Bảng 1.1) phân bố ở nhiều vùng miền khác nhau [4].
Bảng 1.1 Danh sách các loài thực vật thuộc chi Euphorbia ở Việt Nam
STT
1
2
3
4
Tên khoa học
Euphorbia
tirucalli L.
Euphorbia
pulcherrima
Willd.
Euphorbia
cyathophora
Murr.
Euphorbia
heterophylla L.
Tên loài
Xương khô
STT
16
Trạng nguyên
17
Tiểu trạng
18
Cỏ mủ
19
Tên khoa học
Euphorbia
lathyris L.
Euphorbia
coudercii
Gagnep.
Euphorbia hirta
L.
Tên loài
Tục tùy
Euphorbia
hypericifolia L.
Cỏ sữa lá ban
Cỏ mộc nhẵn
Cỏ sữa lá lớn
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Euphorbia
antiquorum L.
Euphorbia
neriifolia Roxb.
Euphorbia edulis
Lour.
Xương rồng ông
20
Xương rồng
21
Xương
ngọc lân
22
Euphorbia nivula
Buch.
Euphorbia trigona
Mill.
Euphorbia milii
Desmoul
Euphorbia
arenarioides
Gagnep.
Euphorbia atoto
Forst.
Euphorbia
capillaris Gagnep.
Giang lâm
23
Xương
rồng
cảnh
Xương rắn
24
Cỏ sữa
26
Đại kích biển
27
Cỏ sữa rừng còi
28
Euphorbia
Đại kích sóng
cristata Heyne ex
Roth.
Euphorbia
Cỏ sữa lông
chrysocoma Lévl. vàng
et Vaniot
29
rồng
25
30
Euphorbia
indica Lamk.
Euphorbia laeta
Jacq.
Euphorbia
heyneana
Sprengl.
Euphorbia
prostrata Ait.
Euphorbia rosea
Retz.
Euphorbia
sessiflora Roxb.
Euphorbia
maculate L.
Cỏ sữa Ấn
Cỏ sữa sáng
Cỏ sữa tròn
Cỏ sữa nằm
Cỏ sữa hồng
Cỏ sữa hoa
không cuống
Đại kích điểm
Euphorbia
Cỏ sữa lá nhỏ
thymifolia L.
Euphorbia
Cỏ sữa rừng
vachellii Hook. khô
et Arn.
Euphorbia
harmvàii Gagn.
Euphorbia
linearifolia
Heyne ex Roth.
-
Hoạt tính sinh học của chi Euphorbia
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các loài thực vật họ Thầu dầu, đặc biệt là các loài
thuộc chi Euphorbia, có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý như: hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm, kháng virus, kháng viêm giảm đau, kháng oxi hóa, hoạt tính hạ glucose máu,
bảo vệ thần kinh, điều hòa miễn dịch và nhất là hoạt tính chống ung thư rất tốt.
Loài Euphorbia tibetica đã được nghiên cứu tác dụng ức chế đối với sự phát triển
tế bào ung thư phổi ở người A-549 [5]. Loài Euphorbia connate Boiss. được sử dụng
nhiều trong dân gian ở Iran để điều trị các bệnh ung thư. Các hợp chất diterpene được
phân lập từ phần trên mặt đất của loài này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng
tế bào ung thư vú ở người MDA-MB và MCF-7 [6]. Các cao chiết phân đoạn và một số
hợp chất phân lập được từ rễ của loài Euphorbia fischeriana có hoạt tính gây độc tế bào
đối với hai dòng tế bào ung thư gan Hep-3B và ung thư phổi A-549 [7]. Một nghiên cứu
5
khác cũng trên loài này đối với chuột đã cho thấy tiềm năng để điều trị giảm đau, an
thần [8]. Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc, một số hợp chất
phân lập được từ rễ của loài Euphorbia ebracteolata Hayata đã thể hiện hoạt tính gây
độc tế bào đối với năm dòng tế bào ung thư ở người đó là: HL-60, SMMC-7721, A-549,
MCF-7 và SW-480 [9]. Một số hợp chất phân lập được từ loài Euphorbia kansui cũng
thể hiện tốt hoạt tính gây độc tế bào đối với hai dòng tế bào ung thư gan và phổi ở người:
Hep-G2 và A-549 [10]. Các hợp chất jatrophane diterpene polyester đã được phân lập
từ loài Euphorbia pubescens thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào
ung thư ở người: MCF-7, NCI-H460 và SF-268 [11]. Từ rễ của loài Euphorbia
ebrateolata các hợp chất diterpen đã được phân lập và cũng chứng minh được hoạt tính
gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư: ANA-1, B-16 và Jurkat của các hợp chất
này [12]. Các hợp chất được phân lập từ loài Euphorbia esula, E. davidii có khả năng
ức chế sự tăng sinh của các dòng tế bào: B-16, KB, SMMC, BGC, HeLa, Ishikawa, A431, A-2780 và MCF-7 [13-15]. Ngoài ra, các cao chiết từ toàn thân của các loài
Euphorbia esula, E. peplus, E. Salicifolia, E. Serrulata, E. exigua và E. lagascae cùng
các hợp chất phân lập được đã thể hiện khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung
thư [16-18]. Các hoạt chất phân lập được từ E. helioscopia và E. alatavica có khả năng
gây độc các dòng tế bào HL-60, HeLa, MCF-7, A-431, A-2780 và A-549 [19, 20].
Các hợp chất phân lập được từ Euphorbia peplis cho thấy hoạt tính kháng nấm
và kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Mycobacterium tuberculosis và nấm Cvàida albicans, Cvàida parapsilosis, Cvàida
glabrata và Cryptococcus neoformans [21]. Guyoniain C và D phân lập từ Euphorbia
guyoniana kháng vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus và Staphylococcus aureus) và
vi khuẩn Gram âm (Serratia sp. và Pseudomonas sp.) [22]. Cao chiết (chiết Soxhlet và
chiết ngâm dầm) từ loài E. heliscopa kháng lại B. cereus với giá trị MIC lần lượt là 1.25
và 0.5 mg/mL [23].
Avila và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của cao chiết và hai diterpene phân lập
được từ mủ của loài E. laurifolia và E. lactea lên hoạt động HIV-1 ở tế bào Jurkat-LATGFP. Kết quả cho thấy hợp chất 3,12-di-O-acetyl-8-O-tigloommeol, thu được từ E.
lactea, đã chứng tỏ hoạt động HIV-1 phụ thuộc vào nồng độ với EC50 = 0.5 μg/mL [24].
Tian và cộng sự đã thử nghiệm khả năng kháng virus của các diterpene phân lập từ E.
6
micractina, kết quả đã khẳng định lathyra 15- (cinnamoyloxy) 5,12-dien-3-ol-14-one có
thể chống lại HIV-1 (IC50 = 8.2 µM) trong thử nghiệm in vitro [25]. Một nghiên cứu
khác cho thấy hợp chất jatrophane diterpene được phân lập từ Euphorbia hyberna, có
khả năng kháng virus đáng kể thông qua việc điều hòa thụ thể HIV-1 [26]. Ngoài ra, cao
chiết của E. spinidens có hàm lượng phenol và flavonoid cao cùng với tác dụng kháng
virus HSV-1 [27].
Nhóm nghiên cứu của Xu và cộng sự đã công bố tác dụng bảo vệ thần kinh của
19 hợp chất diterpene phân lập từ rễ của loài E. prolifera. Kết quả chỉ ra rằng tất cả các
hợp chất khảo nghiệm đều có tác dụng bảo vệ thần kinh do MPP+ (ion 1-methyl-4phenylpyridinium) gây chết tế bào SH-SY5Y [28]. Ngoài ra, 2α-O-isobutyryl
3β,5α,7β,10,15β-penta-O-acetyl-14α-O-benzoyl-10,18-dihydromyrsinol
và
isobutyryl-3β-O-propionyl-5α,7β,10,15β-tetra-O-acetyl-10,18-dihydromyrsinol
2α-Ophân
lập từ rễ của E. prolifera đều có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh [29].
Paraliane và pepluane diterpene, hai thành phần của Euphorbia paralias, đã được
chứng minh có tác dụng kháng viêm tốt [30]. Năm 2010, Chang cùng các cộng sự đã
chứng minh tác dụng kháng viêm với STAT3 gây ra bởi IL-6 đã bị ức chế bởi
kansuinines A và B - hai hợp chất phân lập được từ Euphorbia kansui [31].
Hai triterpenoid là betulin và (3β, 23E)-cycloarta-23-ene-3,25-diol phân lập từ
phần trên mặt đất của E. spinidens có khả năng điều hòa miễn dịch qua sự tăng sinh của
tế bào lympho máu ngoại vi người được kích hoạt bởi PHA [32]. Ở liều 400 mg/kg/ngày
trọng lượng cơ thể, cao chiết từ lá của loài Euphorbia neriifolia Linn có khả năng điều
hòa miễn dịch ở thử nghiệm trên chuột [33].
Dịch chiết của Euphorbia heyneana đã thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa in vitro
thông qua khả năng ức chế gốc tự do superoxide và hydroxyl tương ứng từ 43.17% đến
91.22% và từ 32.54% đến 78.34%; lần lượt với giá trị IC50 = 68.11; 67.55 µg/mL (so
với giá trị IC50 của vitamin C là 62.27; 55.24 µg/mL) [34]. Hoạt tính kháng oxi hóa của
các cao chiết ethanol, acetone và petroleum ether của ba loài Euphorbia acanthothamnos
Heldr, Euphorbia macroclada Boiss và Euphorbia rigida Bieb đã được tiến hành. Kết
quả cho thấy cao chiết ethanol của E. acanthothamnos đã thể hiện hiệu quả cao nhất
theo phương pháp DPPH. Cao chiết acetone của E. macroclada cho hoạt tính kháng oxi
hóa cao hơn BHT và α-Tocopherol dựa trên phương pháp khử Fe2+ [35]. Mười hợp chất
7
phân lập được từ phần trên mặt đất của loài E. petiolata đã được thử nghiệm hoạt tính
kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH, kết quả chỉ ra rằng các dẫn xuất của kaempferol,
quercetin và myricetin là những hợp chất cho kết quả kháng oxi hóa tốt [36].
Dịch chiết ethanol của loài Euphorbia neriifolia với liều dùng 200 và 400 mg
chiết xuất/kg thể trọng có tác dụng hạ đường huyết đáng kể sau 15 ngày với thử nghiệm
trên chuột bị bệnh đái tháo đường gây ra bởi alloxan [37]. Cao nước và methanol của
Euphorbia thymifolia với liều dùng 250 và 500 mg chiết xuất/kg thể trọng có tác dụng
hạ đường huyết, nồng độ HbA1c, urê và tổng protein trên chuột bị bệnh đái tháo đường
gây ra bởi streptozotocin-nicotinamide sau 28 ngày [38].
Thành phần hóa học của chi Euphorbia
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Euphorbia cho thấy có rất nhiều
hợp chất có cấu trúc lý thú trong chi này bao gồm các nhóm diterpenoid, triterpenoid,
coumarin, flavonoid, hợp chất phenol và các hợp chất khác.
Các hợp chất diterpenoid
Các công bố nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Euphorbia
cho thấy hầu hết các loài của chi này đều chứa thành phần diterpenoid.
Năm 2016, Shao Nan Liu và cộng sự đã cô lập được ba hợp chất ent-rosane
diterpenoid gồm: euphomilone A (1), euphomilone B (2) và euphomianol A (3) từ phần
trên mặt đất của loài Euphorbia milii [39].
O
HO
H
H
H
HO
O
1
H
O
HO
HO
2
H
OH
3
Cũng vào năm 2016, Yi Kuang và cộng sự đã cô lập được hai ent-atisane
diterpenoid mới từ toàn cây Euphorbia wallichii đó là ent-atisane-16β,17-isopropyliden
edioxy-19-ol-3-one (4) và ent-atisane-16β,17-isopropylidenedioxy-11β,18-dihydroxyl3-one (5) [40].
8
Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học của loài Euphorbia connata Boiss
bởi Shadi S và cộng sự vào năm 2014 đã tách được ba diterpenoid: 3,7,14,15-tetraacetyl5-propanoyl-13(17)-epoxy-8,10(18)-myrsinadiene
(6);
3,7,10,14,15-pentaacetyl-5-
butanoyl-13,17-epoxy-8-myrsinene (7) và 5,6-epoxy-8,9,15-triacetyl-3-benzoyl-14oxo-jatropha-11(E)-ene (8) [6].
Từ rễ của loài Euphorbia fischeriana, sáu diterpenoid đã được phân lập bao gồm:
ent-kaurane-3-oxo-16β,17-acetonide
(9);
jolkinolide
B (10);
ent-(3α,5β,8β,9α,
10β,12β)-3-hydroxyatis-16-en-14-one (11); ent-atisane-3α,16β,17-triol (12); entkaurane-3-oxo-17β-ol (13) và 12-deoxyphorbaldehyde-13-hexadecanoate (14) [7].
- Xem thêm -