Tài liệu Khảo sát quy trình thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ việc nuôi cấy tế bào hai loài drosera

LỜI CAM ĐOAN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những kết quả trong nghiên cứu này hoàn toàn chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác. NCS. Quách Ngô Diễm Phương Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang i LỜI CẢM ƠN Lôøi caûm ôn Coâng trình naøy laø keát quaû hôn 3 naêm hoïc taäp vaø nghieân cöùu cuûa toâi taïi Boä moân Coâng ngheä Sinh hoïc Thöïc vaät vaø Chuyeån hoaù Sinh hoïc thuoäc Khoa Sinh, tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân vôùi raát nhieàu söï daïy baûo, quan taâm vaø giuùp ñôõ. Ñaàu tieân, toâi xin baøy toû loøng kính troïng vaø bieát ôn saâu saéc ñeán PGS. TS. Bùi Văn Lệ, ngöôøi ñaõ ñeà ra höôùng nghieân cöùu thu nhaän hôïp chaát thöù caáp treân ñoái töôïng caây baét ruoài ôû Vieät Nam baèng coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo thöïc vaät vaø taän tình chæ daïy cuõng nhö ñaõ taïo moïi ñieàu kieän thuaän lôïi ñeå toâi ñöôïc thöïc hieän, hoaøn thaønh luaän aùn naøy. Ñoàng thôøi, toâi cuõng xin baøy toû loøng bieát ôn chaân thaønh ñeán GS. TS. Nguyễn Kim Phi Phụng – Khoa Hoùa, tröôøng ÑH Khoa hoïc Töï nhieân. Coâ laø ngöôøi ñaõ ñaët neàn moùng ñaàu tieân cho khoái kieán thöùc Hoùa hoïc maø toâi coù ñöôïc ñeå öùng duïng trong luaän aùn naøy. Maëc duø khoâng laø ngöôøi höôùng daãn, nhöng Coâ luoân ôû beân caïnh, ñoác thuùc, hoã trôï tinh thaàn cho toâi trong luùc thöïc hieän luaän aùn. Thôøi gian laøm thöïc taäp sinh ôû nöôùc ngoaøi ñaõ giuùp toâi tröôûng thaønh hôn trong chuyeân moân, trong taùc phong hoïc taäp vaø nghieân cöùu. Xin chaân thaønh caùm ôn Bộ Giáo dục Đào tạo và Chương trình trao đổi hợp tác Danida (ENREKA). Beân caïnh ñoù, cho pheùp toâi ñöôïc ñaëc bieät baøy toû loøng bieát ôn chaân thaønh ñeán PGS. TS. Ole Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ii LỜI CẢM ƠN Vang, ngöôøi ñaõ höôùng daãn, daïy baûo toâi, luoân taïo ñieàu kieän cho toâi hoïc taäp vaø nghieân cöùu trong suoát quaõng thôøi gian toâi ôû Ñan Maïch. Cho toâi ñöôïc noùi lôøi caùm ôn ñeán taát caû Thaày Coâ, baïn beø ôû Lab Molecular Mechanisms of Dietary Components; Khoa Science, Systems and Models; Tröôøng ÑH Roskilde, Ñan Maïch ñaõ höôùng daãn nhöõng thao taùc ñaàu tieân khi toâi vaøoLab cuõng nhö ñaõ taïo neân nhöõng tình caûm aám aùp, thaân thieän. Toâi cuõng xin göûi lôøi caùm ôn ñeán caùc baïn du hoïc sinh Vieät Nam ôû Roskilde; ñaëc bieät laø chị Thảo Trân, Tuyết Phương, Thu An, Như Ngọc, Thành Tâm ñaõ chia seõ cuoäc soáng vaø giuùp ñôõ toâi nhö gia ñình ôû nôi xa xöù. Cho toâi ñöôïc göûi lôøi caùm ôn ñeán Thầy Cô GS. Trần Thanh Vân vaø hoïc boång Odon Vallet. Caùm ôn caùc Thầy Cô Bộ môn Sinh hóa ñaõ quan taâm tìm hieåu vaø xeùt duyeät ngay khi yù töôûng cuûa luaän aùn ñöôïc hình thaønh. Traân troïng caùm ôn caùc Thầy Cô tham gia Hội đồng, Thầy Cô tham gia phản biện kín ñaõ daønh thôøi gian xem xeùt, ñaùnh giaù cuõng nhö goùp yù ñeå luaän aùn ñöôïc chænh chu, hoaøn thieän hôn. Caùm ôn toaøn theå Thầy Cô đồng nghiệp cuûa toâi taïi Khoa Sinh, Tröôøng ÑH Khoa hoïc Töï nhieân, TP. HCM ñaõ daïy doã töø nhöõng ngaøy toâi môùi chaäp chöõng böôùc vaøo giaûng ñöôøng ñaïi hoïc cho ñeán ngaøy hoâm nay cuõng nhö ñaõ coå vuõ tinh thaàn vaø hoã trôï khi caàn thieát ñeå toâi hoaøn thaønh luaän aùn. Ñaëc bieät xin ñöôïc caùm ôn Cô Phượng, anh Huy, KPNam ñaõ goùp yù vaø söõa chöõa baøi vôû giuùp toâi. Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iii LỜI CẢM ƠN Caùm ôn toaøn theå caùc em ñang hoïc taäp vaø laøm vieäc taïi phoøng Coâng ngheä Sinh hoïc Thöïc vaät B23. Cho toâi ñöôïc ñaëc bieät caùm ôn: Lan Anh, Caåm Tuù, Voøng BínhLong, Löu Ly, Xuaân Sôn, Höõu Hoaøng, Minh Tuaán, Thanh Minh, Aí Hieàn ñaõ hoã trôï baát cöù luùc naøo toâi caàn. Göûi lôøi caùm ôn ñeán: Bích Chieâu, Bích Tuyeàn, Hoaøng Thò Thu, Phöông Thy, Thanh Minh, Bích Thuøy, Phi Yeán, nhöõng “ngöôøi baïn hoïc troø” cuûa Coâ ñaõ doác heát taâm huyeát ñeå cuøng Coâ nghieân cöùu luaän aùn naøy. Göûi lôøi caùm ôn ñeán caùc baïn cuøng khoùa Cao hoïc Sinh hoùa K13 ñaõ thöôøng xuyeân quan taâm vaø ñoäng vieân toâi cho ñeán giôø phuùt naøy. Ñaëc bieät, cho toâi noùi lôøi caùm ôn ñeán Thieân Hoaøng, chò Nhö, anh Nhöùt. Cuoái cuøng, toâi xin pheùp ñöôïc daâng taëng thaønh quaû cuûa coâng trình naøy cho gia ñình toâi, choã döïa vöõng chaéc nhaát cuûa toâi trong nhöõng naêm qua. Caùm ôn Ba Mẹ ñaõ taïo moïi ñieàu kieän toát nhaát veà vaät chaát vaø tinh thaàn ñeå toâi coù theå hoïc taäp, nghieân cöùu khoa hoïc vaø ñaït ñöôïc keát quaû naøy. Caùm ôn anh chò hai vaø vôï choàng uùt ñaõ luoân ôû beân caïnh, giuùp ñôõ, coå vuõ. Gia ñình thöïc söï ñaõ giuùp toâi coù theå toaøn taâm toaøn yù vôùi luaän aùn naøy. Chaân thaønh caùm ôn. Quaùch Ngoâ Dieãm Phöông. Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iv DANH MỤC MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i Lôøi caûm ôn .......................................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................................... v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ........................................................... x DANH MỤC BẢNG....................................................................................................... xiii DANH MỤC HÌNH........................................................................................................ xvi MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 3 1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera ..................................................................... 3 1.1.1 Đặc điểm phân loại...........................................................................................3 1.1.2 Đặc điểm phân bố.............................................................................................5 1.1.3 Đặc điểm hình thái ...........................................................................................6 1.1.4 Đặc tính sinh học ............................................................................................11 1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112] ....................................................13 1.1.6 Thành phần hóa học .......................................................................................14 1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng ...............................................................................17 1.1.8 Tình hình nghiên cứu .....................................................................................20 1.2 Tăng năng suất thu nhận hợp chất trong nuôi cấy tế bào thực vật ............ 22 1.2.1 Nuôi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) ................................................22 1.2.2 Tối ưu khả năng tích lũy hợp chất của tế bào thực vật ..................................24 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang v DANH MỤC 1.2.3 Can thiệp vào con đường sinh tổng hợp hoạt chất .........................................29 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP ............................................................................... 35 2.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu ....... 35 2.1.1 Vật liệu ...........................................................................................................35 2.1.2 Phương pháp...................................................................................................35 2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera ............................................................................. 38 2.2.1 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học được sử dụng để sàng lọc phân đoạn cao chứa hoạt chất .................................................................................38 2.2.2 Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro của hai loài Drosera .......................................................................................41 2.2.3 Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập được ...................................42 2.2.4 Xác định cấu trúc và hàm lượng hợp chất......................................................49 2.2.5 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này ...................................................51 2.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh ........................................................... 51 Vật liệu ......................................................................................................................51 Phương pháp..............................................................................................................52 2.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở Drosera ........................................................................................................................52 2.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con .............................................................................................52 2.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con ..................................................................................................................53 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vi DANH MỤC 2.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con .....................................................................................54 2.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng trưởng và sự tích lũy hoạt chất .......................................................................54 2.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất ............................................................................................55 2.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát ..................................55 2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ........................................................ 56 Vật liệu ......................................................................................................................56 Phương pháp..............................................................................................................56 2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào .............................................................................56 2.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ......................................................................59 2.5 Xử lý thống kê .................................................................................................. 62 3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN ..................................................................................... 63 3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu ....... 63 3.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy .....................................................................63 3.1.2 Nhân giống bằng chồi bên..............................................................................63 3.1.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào .................................66 3.1.4 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước (Improved 2-step Liquid Culture System) trong việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển thành cây con hoàn chỉnh [24]..............................................................................................69 3.1.5 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh ........................................................72 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vii DANH MỤC 3.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera ............................................................................. 72 3.2.1 Xử lý mẫu và điều chế các loại cao chiết .......................................................72 3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa ...............................74 3.2.3 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào in vitro .....84 3.2.4 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này .................................................100 3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh ......................................................... 101 3.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii .......................................................................................................102 3.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin trong cây con tái sinh .................................................................104 3.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất .........109 3.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất (phenylalanine và tyrosine) lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin ......................................................111 3.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất ..........................................................................113 3.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất ..........................................................................................120 3.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát ................................122 3.4 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ............................................. 123 3.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào ...........................................................................123 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang viii DANH MỤC 3.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ....................................................................134 4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 14 4.1 Kết luận ........................................................................................................... 14 4.2 Đề nghị ............................................................................................................ 1 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ....................................................... 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 15 PHỤ LỤC ............................................................................................................................ a Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ix DANH MỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid 4E-BP1 : the Eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) Binding Protein 1 ABS : Absorbent AFM : Atomic Force Microscopy AI : hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất (%) AOS : Active oxide species BA : 6-benzylaminopurine BHA : butylate hydroxy aldehyde BSA : Bovine Serum Albumine COSY : COrelation SpectroscopY DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DLD-1 : dòng tế bào ung thư ruột kết ở người DMSO : Dimethyl sulphoxide DTT : 1, 4-DiThioTreitol DW : Dry weight (trọng lượng khô) FBS : Fetal Bovine Serum FTC : Ferric thyociante FW : Fresh weight (trọng lượng tươi) GB5 : Gamborg B5 HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation. HMQC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation. HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) I : tỷ lệ ức chế sự tăng sinh tế bào (%) IAA : indoleacetic acid IBA : 3-indolebutyric acid IC50 : Inhibitory Concentration of 50% growth Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang x DANH MỤC IR : Infrared KN : Kinetine LB : Luria – Bertani MS : Murashige & Skoog, 1962 mTOR : mammalian Target Of rapamycin mTORC1/2 : mammalian TOR Complex 1/ 2 NAA : Naphthalene Acetic Acid NMR : Nuclear Magnetic Resonance OD : Optical Density PAL : Phenylamine ammonia lysase PBS : Phosphate Buffer Saline PDK : Protein Dependent Kinase PDK1/ 2 : Phosphoinositide-Dependent Kinase 1/ 2 PI : Protease Inhibitor PI3K : PhosphoInositide 3-Kinase PIP2 : PhosphatidylInositol (4,5)-BiPhosphate PIP3 : PhosphatidylInositol (3,4,5)- TriPhosphate PKB : Protein Kinase B PKC : Protein Kinase C pmTOR : phosphor mTOR PTEN : Phosphatase and TENsin homolog PVDF : PolyVinylidene DiFluoride PVP : Poly Vinyl Pyrrolidone Raptor : Regulatory Associated Protein of mTOR Rheb : Ras Homolog Enriched in Brain Rictor : rapamycin-Insensitive Companion of mTOR ROS : Reactive Oxygen Spices S6K1 : p70-S6 Kinase 1 SAR : Systemic Acquired Resistance Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xi DANH MỤC SRB : SulfoRhodamine B TAL : Tyrosine ammonia lyase TBA : ThioBarbituric Acid TBS : Tris Buffered Saline TCA : Trichloroacetic acid TMS : TetraMethylSilane TSC1/ 2 : Tuberous Sclerosis Complex1/ 2 TTC : TriphenylTetrazolium Chloride UV : Ultra Violet vitE : Vitamin E KÍ HIỆU J : Hằng số ghép cặp MHz : Megahertz s, d, t : Singlet (mũi đơn), Doublet (mũi đôi), Triplet (mũi ba) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xii DANH MỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone .......15 Bảng 1.2. Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin và 7-methyljuglone .............15 Bảng 1.3. Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera .....................15 Bảng 1.4. Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera ......18 Bảng 1.5. Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây nhất của D. burmanii ..........19 Bảng 1.6. Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera .......................20 Bảng 1.7. Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera .......................21 Bảng 2.1. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn và lỏng 37 Bảng 2.2. Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D .....61 Bảng 3.1 . Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự nhân chồi bên .....................................64 Bảng 3.2 . Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự tạo chồi bất định từ phát hoa .............67 Bảng 3.3. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn, lỏng .....70 Bảng 3.4. Phần trăm nước của hai loại nguyên liệu tươi Drosera in vitro ............72 Bảng 3.5. Thu suất các loại cao từ bột cây Drosera ................................................73 Bảng 3.6. Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các loại cao theo phương pháp Yen và Duh (1993) ....................................................74 Bảng 3.7 . Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. indica ............76 Bảng 3.8. Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các phân đoạn theo phương pháp Yen và Duh (1993) ..................................................77 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp FTC ..............80 Bảng 3.10. Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp TBA ............81 Bảng 3.11. Tỷ lệ % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của các hoạt chất khảo sát ....82 Bảng 3.12. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các cao chiết (100µg/ml).........................................84 Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. burmanii ......86 Bảng 3.14. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn (100µg/ml) ......................................86 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xiii DANH MỤC Bảng 3.15. Kết quả sắc ký cột phân đoạn 3 của bảng 3.14......................................87 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên sự tăng sinh của tế bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng ...........................................................89 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên kích thước của tế bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng...............................................................91 Bảng 3.18. Nồng độ protein tổng của sinh khối tế bào khi bị cảm ứng bởi hợp chất B và rapamycin theo thời gian .......................................................................94 Bảng 3.19. Ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu hiện của protein mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian ...............................................................96 Bảng 3.20. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HMBC của hợp chất B ..............................99 Bảng 3.21. Kết quả định lượng quercetin và plumbagin trong Drosera bằng HPLC ......................................................................................................................101 Bảng 3.22. Các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii ........................................102 Bảng 3.23. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây ..........................................................................104 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin trong cây con ................................................................................................105 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây .......................................................................................107 Bảng 3.26. Ảnh hưởng mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con....................................................................108 Bảng 3.27. Ảnh hưởng NAA lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con ................................................................................................................109 Bảng 3.28. Ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con ................................................................................111 Bảng 3.29. Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con ................................................................................113 Bảng 3.30. Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tích lũy plumbagin ở hai bộ phận rễ và lá D. burmanii .........................................................................................116 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xiv DANH MỤC Bảng 3.31. Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con ................................................................................117 Bảng 3.32. Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin ở lá và rễ của D. burmanii ..................................................................................................119 Bảng 3.33. Ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy plumbagin của D. burmanii .........................................................................120 Bảng 3.34. Kết quả định lượng plumbagin trong cây con D. burmanii in vitro đã được ứng dụng các kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng HPLC............................................................................................................123 Bảng 3.35. Ảnh hưởng của nền khoáng, nồng độ đường lên khả năng sống của lớp mỏng tế bào ............................................................................................123 Bảng 3.36 . Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá và rễ D. burmanii.....................................125 Bảng 3.37. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA ......127 Bảng 3.38. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA ......128 Bảng 3.39. Hàm lượng plumbagin tích lũy trong các loại mô khác nhau..............134 Bảng 3.40. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đến thời gian tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào rễ Drosera .............................................135 Bảng 3.41. Ảnh hưởng ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng trưởng và tích lũy plumbagin.....................................................................................................137 Bảng 3.42. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào ..................................................................................139 Bảng 3.43. Ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D. burmanii ...............................142 Bảng 3.44.Ảnh hưởng của acid salicylic lên lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào .........................................................145 Bảng 3.45. Kết quả định lượng plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D. burmanii đã được ứng dụng kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng HPLC............................................................................................................146 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xv DANH MỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên trình tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome ..........................4 Hình 1.2. Sự phân bố Drosera trên thế giới (vùng có màu xanh lá) .........................5 Hình 1.3. Các dạng cấu trúc thân của Drosera .........................................................6 Hình 1.4. Các hình dạng khác nhau của lá và lông tuyến Drosera ..........................7 Hình 1.5. Màu sắc đa dạng của hoa Drosera ...........................................................9 Hình 1.6. Mặt cắt ngang của hoa Drosera.................................................................9 Hình 1.7. Các dạng nang chứa hạt của Drosera ....................................................10 Hình 1.8. Hình thái hạt Drosera .............................................................................10 Hình 1.9. Phương tiện và cơ chế bắt côn trùng của D. indica L. ............................12 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinoneglucoside tách chiết từ các loài Drosera . .....................................................16 Hình 1.11. Một số flavonoid và flavonoid glucoside có trong Drosera ...................16 Hình 1.12. Một số hình thái lạ mắt của Drosera ....................................................19 Hình 2.1 . Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bên .......................................36 Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bất định ................................37 Hình 2.3. Con đường truyền tín hiệu mTOR và những cơ chất có liên quan .........46 Hình 2.4. Phương pháp Western Blot ......................................................................46 Hình 2.5. Buồng đếm tế bào và quy tắc đếm trong 1 ô lớn có thể tích 0,1mm3 .......59 Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera ..64 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D. indica L. sau 5 tuần .................................................................................................................65 Hình 3.3. Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D. burmanii sau 5 tuần .................................................................................................................65 Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera ..67 Hình 3.5 . Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. indica sau 5 ngày ...........68 Hình 3.6. Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. burmanii ..........................68 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xvi DANH MỤC Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của việc ứng dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2 bước lên khả năng tạo chồi của Drosera (trái: D. indica, phải: D. burmanii) ........................................................................................................................70 Hình 3.8. Cây con Drosera hoàn chỉnh với đầy đủ các bộ phận, kể cả rễ trên môi trường MS lỏng (trái: D. indica, phải: D. burmanii) ....................................72 Hình 3.9. Biểu đồ biễu diễn năng lực khử của các loại cao chiết theo phương pháp của Den và Duh (1993) ..................................................................................74 Hình 3.10. Năng lực khử của các loại cao chiết theo phương pháp của Den và Duh ........................................................................................................................74 Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm Yen & Duh ......................................................................................................77 Hình 3.12 Năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm Yen & Duh ............77 Hình 3.13 .Tinh thể hình kim của hợp chất A ...........................................................78 Hình 3.14. Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 500nm để theo dõi động học của phản ứng ...........................................................................................80 Hình 3.15. Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 532nm để theo dõi động học của phản ứng ...........................................................................................81 Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất cô lập so với vitE và BHA ở cả hai phương pháp FTC và TBA ....................................82 Hình 3.17. Biều đồ thể hiện tỷ lệ % ức chế tăng sinh tế bào DLD-1 của các loại cao chiết ................................................................................................................85 Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào DLD-1sau khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn ...............................................................86 Hình 3.19. Cô lập và thu nhận hoạt chất B ..............................................................88 Hình 3.20. Đường cong tăng sinh tế bào DLD-1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của hợp chất B ở các nồng độ khác nhau .............................................................89 Hình 3.21. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào của hợp chất ở các nồng độ khác nhau (trái: sau 24 giờ cảm ứng, phải: sau 48 giờ cảm ứng) ...........89 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xvii DANH MỤC Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hoạt chất lên kích thước của tế bào DLD-1 ............................................................................................................92 Hình 3.23. Tế bào DLD-1 dưới ảnh hưởng của hợp chất B sau 48 giờ cảm ứng được quan sát dưới kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10x..........................93 Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hợp chất B (4µM) và rapamycin (0,5µM) lên hàm lượng protein tổng của lysate tế bào DLD-1 .....................95 Hình 3.25. Biều đồ thể hiện ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu hiện của protein mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian ...................................97 Hình 3.26. Tín hiệu phát quang của kháng thể bắt cặp với các protein mTOR, pmTOR, và S6K ..............................................................................................98 Hình 3.27. Biểu đồ thể hiện các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii..............102 Hình 3.28. Các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii nuôi cấy in vitro ............102 Hình 3.29. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây ..........................................................................104 Hình 3.30. Ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây. Trong đó, ở MS1/8 và MS0 các chồi con không có dấu hiệu tăng sinh và chết............................................................................104 Hình 3.31. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây .................................................................................105 Hình 3.32. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự tăng trưởng của D. buramnii in vitro ......................................................................................................................106 Hình 3.33. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây ..........................................................................107 Hình 3.34. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tăng trưởng của D. buramnii in vitro. Từ trái sang phải: pH5,2; pH5,8; pH6,4 ...........................................107 Hình 3.35. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con ......................................108 Hình 3.36. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của NAA lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con ................................................................................109 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xviii DANH MỤC Hình 3.37. Ảnh hưởng của NAA lên sự phát triển của rễ và sự tăng trưởng của cây in vitro ..........................................................................................................110 Hình 3.38. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên sự tích lũy plumbagin của cây con ................................................................................112 Hình 3.39. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của salicylic acid lên khả năng tăng trưởng và sự tich lũy plumbagin ..............................................................................114 Hình 3.40. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng của salicylic acid đến sự tích lũy plumbagin trong cây con D. burmanii ...114 Hình 3.41. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của D.burmanii .............................................................117 Hình 3.42. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin trong cây con D. burmanii ....118 Hình 3.43. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên khối lượng cây tươi .........................................................................................................120 Hình 3.44. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên hàm lượng plumbagin.....................................................................................................120 Hình 3.45. Biều đồ thể hiện ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả năng sống của lớp mỏng tế bào ...................................................................124 Hình 3.46. Hình thái mô sẹo được tạo thành từ lá D.burmanii .............................126 Hình 3.47. Hình thái mô sẹo được tạo thành từ rễ D.burmanii .............................126 Hình 3.48. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo dưới ảnh hưởng của 2,4-D, NAA, KN ................................................................................................................128 Hình 3.49. Hình thái mô sẹo dưới tác động kết hợp của 3 loại hormone ..............129 Hình 3.50. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo ................................131 Hình 3.51. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào ..132 Hình 3.52. Tế bào D. burmanii bắt màu hồng khi nhuộm TTC. ...........................133 Hình 3.53. Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D. burmanii có mật độ tế bào ban đầu khác nhau ................................................................135 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xix DANH MỤC Hình 3.54. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin ..................................................................137 Hình 3.55. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và tích lũy plumbagin.....................................................................................................140 Hình 3.56. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng trưởng và tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D. burmanii .......143 Hình 3.57. Con đường tổng hợp plumbagin từ tiền chất tyrosine thông qua các đơn vị acetate .....................................................................................................144 Hình 3.58. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào ............................................145 Hình 3.59. Sinh tổng hợp plumbagin ở Drosera và một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp .......................................................................................147 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xx