Tài liệu Khảo sát quá trình lên men malolactic rượu vang chanh dây

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC RƯỢU VANG CHANH DÂY CBHD: PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH : HOÀNG THỊ KIM THOA MSSV:60604391 ĐẶNG MAI HUYỀN ANH MSSV:60604008 TP HỒ CHÍ MINH, 01/2011 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên chúng em xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn thành tốt luận văn này. Chúng em xin cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hương – người đã tận tình theo sát, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn các anh chị lớp cao học CH2008, CH2009 đã nhiệt tình giúp đỡ. Xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp HC06BSH, những người bạn đã đồng hành cùng chúng mình trong suốt những năm tháng đại học, đã quan tâm, chia sẻ, động viên, đặc biệt là luôn tạo một không khí vui vẻ để thời gian làm luận văn thật đáng nhớ. Chúng con xin cám ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên trong suốt quãng đường mà chúng con đã đi. Cám ơn các thành viên của nhóm A&T – những người bạn thân thiết nhất đã cùng nhau trải qua mọi niềm vui, nỗi buồn để đạt được kết quả như ngày hôm nay. Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sát cánh cùng chúng tôi trong thời gian qua. TP. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2010 Hoàng Thị Kim Thoa Đặng Mai Huyền Anh i TÓM TẮT Rượu vang chanh dây sau quá trình lên men rượu vẫn còn một lượng lớn acid malic làm cho rượu có vị chua gắt. Lên men malolactic là quá trình chuyển hóa acid malic thành acid lactic nhằm cải thiện chất lượng cảm quan của rượu. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình lên men malolactic ở rượu vang chanh dây bằng tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni tự do và cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC), kết quả thu được như sau: - Xác định được tỉ lệ giống vi khuẩn Oenococcus oeni thích hợp bổ sung cho quá trình lên men malolactic là 7%, thời điểm bổ sung giống thích hợp nhất là ngay sau khi kết thúc quá trình lên men rượu (ngày thứ 7 của quá trình lên men rượu), thời gian lên men malolactic thích hợp đối với rượu chanh dây là 4 ngày. - Cố định được tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni trên chất mang BC bằng hai phương pháp: bẫy – hấp phụ và nhốt chủ động. Sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định bằng phương pháp bẫy – hấp phụ sau 5 ngày ủ với mật độ là 7.1 x 109 CFU/cm3 để tiến hành lên men. Kết quả thu được cho thấy khi sử dụng chế phẩm vi khuẩn Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC để lên men malolactic đối với rượu vang chanh dây thì hiệu quả lên men vẫn đảm bảo sau 8 lần tái sử dụng. Đồng thời chúng tôi cũng khảo sát hiệu quả của quá trình lên men khi sử dụng đồng thời 2 chế phẩm cố định trên chất mang BC: nấm men Saccharomyces cerevisiae ứng dụng trong lên men rượu và vi khuẩn Oenococcus oeni ứng dụng trong lên men malolactic thì nhận thấy hiệu quả của quá trình lên men vẫn ổn định. Điều này được thể hiện thông qua độ cồn và nồng độ acid malic chuyển hóa được. - Sau khi tối ưu các điều kiện, tiến hành lên men rượu, malolactic và tàng trữ. Chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan và nhận thấy: chất lượng cảm quan của rượu đã được cải thiện, đặc biệt là về mùi vị. Rượu sau quá trình lên men malolactic có vị chua hài hòa hơn mà vẫn giữ được hương vị đặc trưng của rượu chanh dây. ii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH...................................................................................................... viii DANH MỤC SƠ ĐỒ ...................................................................................................... ix DANH MỤC ĐỒ THỊ .................................................................................................... ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về chanh dây ......................................................................................... 3 2.1.1 Nguồn gốc .......................................................................................................... 3 2.1.2 Đặc điểm sinh học .............................................................................................. 3 2.1.3 Thành phần hóa học ........................................................................................... 4 2.1.4 Ứng dụng............................................................................................................ 5 2.2 Lên men rượu vang................................................................................................ 6 2.2.1 Giới thiệu sơ lược về rượu vang ........................................................................ 6 2.2.2 Tác nhân vi sinh vật ........................................................................................... 7 2.2.3 Cơ sở hóa sinh .................................................................................................... 8 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men ...................................................... 9 2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu ......... 10 2.3 Lên men malolactic ............................................................................................. 11 2.3.1 Định nghĩa lên men malolactic ........................................................................ 11 2.3.2 Vị trí của lên men malolactic trong sản xuất rượu vang .................................. 14 2.3.3 Phân loại vi khuẩn lên men malolactic ............................................................ 14 2.3.4 Vai trò của quá trình lên men malolactic ......................................................... 18 2.3.5 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic ................................. 18 2.4 Kỹ thuật cố định .................................................................................................. 42 iii 2.4.1 Lịch sử phát triển ............................................................................................. 42 2.4.2 Định nghĩa ........................................................................................................ 43 2.4.3 Chất mang ........................................................................................................ 43 2.4.4 Phương pháp cố định ....................................................................................... 58 2.4.5 Ưu nhược điểm của cố định tế bào .................................................................. 66 2.4.6 Yêu cầu đối với vi sinh vật cố định ................................................................. 67 2.4.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định vi sinh vật ................................................. 68 2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài .................................. 69 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................... 72 3.1 Vật liệu ................................................................................................................ 72 3.1.1 Chanh dây ........................................................................................................ 72 3.1.2 Giống vi sinh vật .............................................................................................. 72 3.1.3 Môi trường nuôi cấy......................................................................................... 72 3.1.4 Vật liệu, hóa chất ............................................................................................. 74 3.1.5 Thiết bị và dụng cụ........................................................................................... 74 3.2 Phương pháp thí nghiệm ..................................................................................... 74 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm .................................................................................... 74 3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................ 76 3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm .................................................................. 82 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................................... 86 4.1 Kiểm tra đặc điểm giống vi sinh vật: ................................................................... 86 4.1.1 Saccharomyces cerevisiae ............................................................................. 86 4.1.2 Oenococcus oeni ............................................................................................ 88 4.1.3 Acetobacter xylinum ...................................................................................... 90 4.2 Lên men tạo BC ....................................................................................................... 91 iv 4.2.1 Lên men thu nhận BC ....................................................................................... 91 4.2.2 Xử lý chế phẩm BC thô ..................................................................................... 91 4.3 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng Oenococcus oeni tự do ........... 91 4.3.1 Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic .......... 91 4.3.2 Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống Oenococcus oeni trong lên men malolactic. .................................................................................................................. 95 4.3.3 Khảo sát thời gian lên men malolactic ........................................................... 101 4.4 Khảo sát các phương pháp cố định Oenococcus oeni trên chất mang BC ............ 104 4.4.1 Phương pháp bẫy- hấp phụ: ............................................................................ 104 4.4.2 Phương pháp nhốt chủ động............................................................................ 108 4.5 Lên men malolactic sử dụng chế phẩm Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC….. .......................................................................................................................... 111 4.5.1 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae tự do và lên men malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định ........................................... 111 4.5.2 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định và lên men malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định ........................................... 113 4.6 Kết quả cảm quan .................................................................................................. 115 4.7 Kết quả kiểm tra vi sinh......................................................................................... 116 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 117 5.1 Kết luận.................................................................................................................. 117 5.2 Kiến nghị ............................................................................................................... 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 119 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 124 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1: Một số nước sản xuất rượu vang hàng đầu thế giới ....................................... 6 Bảng 2. 2 Phân loại vi khuẩn Lactobacillus .................................................................. 16 Bảng 2. 3 Tốc độ phát triển của vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ .............................. 28 Bảng 2. 4: Thành phần của vang trước và sau khi lên men malolactic ......................... 31 Bảng 2. 5: Sự thay đổi hàm lượng các acid amin có trong dịch lên men vang Shiraz trước và sau khi lên men malolactic với pH ban đầu là 3.7. ......................................... 34 Bảng 2. 6: Hàm lượng acid dễ bay hơi (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic ......................................................................................................... 35 Bảng 2. 7: Hàm lượng rượu bậc cao (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic. .............................................................................................................. 37 Bảng 2. 8: Hàm lượng các ester (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic....................................................................................................................... 39 Bảng 2. 9: Hàm lượng các hợp chất chứa lưu huỳnh và nitơ (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic ...................................................................... 40 Bảng 2. 10 Ưu nhược điểm của từng loại chất mang .................................................... 46 Bảng 2. 11Cấu trúc BC của một số loài vi sinh vật....................................................... 47 Bảng 2. 12 Bảng so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào thông dụng ............................................................................................................................... 65 Bảng 2. 13 So sánh một số tính chất của việc lên men sử dụng nấm men cố định trên gel alginate và nấm men cố định trên BC...................................................................... 66 Bảng 3. 1 Thành phần môi trường Hansen .................................................................... 72 Bảng 3. 2 Thành phần môi trường MLA ....................................................................... 73 Bảng 3. 3 Thành phần môi trường MT5 ........................................................................ 73 Bảng 3. 4 Thành phần môi trường MT6 ........................................................................ 74 Bảng 3. 5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men malolactic .............................. 77 Bảng 4. 1 Kết quả lập đường chuẩn Saccharomyces cerevisiae ................................... 87 Bảng 4. 2 Sự thay đổi các yếu tố sau quá trình lên men malolactic ứng với các tỉ lệ giống khác nhau ............................................................................................................. 92 vi Bảng 4. 3 Sự biến đổi pH khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. .................................................................................. 95 Bảng 4. 4 Sự thay đổi nồng độ chất khô khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. ........................................................... 96 Bảng 4. 5 Sự thay đổi nồng độ acid tổng khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. ........................................................... 97 Bảng 4. 6 Sự thay đổi độ rượu khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. ............................................................................. 98 Bảng 4. 7 Sự thay đổi hàm lượng acid malic và acid lactic khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. ................................ 100 Bảng 4. 8 Sự thay đổi các yếu tố theo thời gian lên men malolactic .......................... 101 Bảng 4. 9 Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các chất mang BC1, BC2 và BC3 ..... 105 Bảng 4. 10 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào vi khuẩn được cố định trên chất mang BC. ............................................................................................................. 107 Bảng 4. 11 Kết quả cố định bằng phương pháp nhốt .................................................. 109 Bảng 4. 12 So sánh 2 phương pháp cố định ................................................................ 110 Bảng 4. 13 Các thông số của dịch chanh dây thí nghiệm ............................................ 111 Bảng 4. 14 Sự biến động acid malic và acid lactic sau mỗi chu kì lên men malolactic.. ..................................................................................................................................... 112 Bảng 4. 15 Các thông số của chế phẩm cố định Saccharomyces cerevisiae trên BC: 114 Bảng 4. 16 Sự biến động acid malic và acid lactic sau mỗi chu kì lên men malolactic.. .. ……………………………………………………………………………………….114 Bảng 4. 17: Kết quả kiểm tra vi sinh ........................................................................... 116 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1 Trái chanh dây ................................................................................................ 4 Hình 2. 2 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae ............................................... 7 Hình 2. 3 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconosto ........................ 14 Hình 2. 4 Hình thái vi khuẩn Oenococcus oeni ............................................................. 18 Hình 2. 5 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic. ........... 29 Hình 2. 6: Quá trình tạo diaceryl ................................................................................... 35 Hình 2. 7: Phản ứng giữa SO2 và các hợp chất carbonyl .............................................. 38 Hình 2. 8 Acetobacter xylinum ...................................................................................... 47 Hình 2. 9 A-BC được tạo ra từ môi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra từ môi trường tĩnh (b) ........................................................................................................................... 50 Hình 2. 10 Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose của thực vật (x200) ............................................................................................................... 51 Hình 2. 11 Vị trí – quá trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A. xylinum .. 54 Hình 2. 12 Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngoài ................................................... 54 Hình 2. 13 Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum ............................................... 55 Hình 2. 14 Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum ........................... 57 Hình 2. 15 Các phương pháp cố định vi sinh vật .......................................................... 59 Hình 2. 16 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang ......................................................... 59 Hình 2. 17 Cố định tế bào trong lòng chất mang .......................................................... 61 Hình 2. 18 Liên kết giữa các tế bào .............................................................................. 62 Hình 2. 19 Cố định tế bào bằng màng membrane ........................................................ 62 Hình 4. 1 Hình ảnh đại thể Saccharomyces cerevisiae trên môi trường đặc................ 86 Hình 4. 2 Hình ảnh vi thể Saccharomyces cerevisiae dưới kính hiển vi....................... 86 Hình 4. 3: Hình ảnh vi thể Oenococcus oeni dưới kính hiển vi .................................... 88 Hình 4. 4 Hình thái khuẩn lạc Acetobacter xylinum trên thạch đĩa và lớp váng vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường lỏng. ................................................................... 90 Hình 4. 5 Hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum dưới kính hiển vi........................... 90 Hình 4. 6 BC tươi sau khi lên men ................................................................................ 91 Hình 4. 7 BC sau 30 phút đầu của quá trình hấp phụ .................................................. 105 viii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2. 1 Cơ chế lên men ethanol . ................................................................................ 8 Sơ đồ 2. 2 Con đường chuyển hóa vật chất của quá trình lên men glucose nhờ vi khuẩn malolactic (Wood và Holzapfel 1995) .......................................................................... 13 Sơ đồ 2. 3: Phân loại vi khuẩn malolactic (Boulton et al 1996) .................................... 15 Sơ đồ 2. 4: Sơ đồ chuyển hóa p-coumaric acid thành 4-ethylphenol ............................ 41 Sơ đồ 2. 5 Phân loại chất mang .................................................................................... 45 Sơ đồ 3. 1 Sơ đồ thu nhận BC ....................................................................................... 78 Sơ đồ 3. 2 Xử lí BC thô ................................................................................................. 78 DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4. 1 Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae ............ 87 Đồ thị 4. 2 Đường chuẩn của nấm men Saccharomyces cerevisiae .............................. 88 Đồ thị 4. 3 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Oenococcus oeni ............................ 89 Đồ thị 4. 4 Đường chuẩn của vi khuẩn Oenococcus oeni ............................................. 89 Đồ thị 4. 5 Sự thay đổi pH sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau ....................................................................................................................... 92 Đồ thị 4. 6 Sự thay đổi nồng độ chất khô sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau. .............................................................................................. 93 Đồ thị 4. 7 Sự thay đổi nồng độ acid tổng sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau ............................................................................................... 93 Đồ thị 4. 8 Sự thay đổi độ rượu sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau ............................................................................................................. 94 Đồ thị 4. 9 Sự thay đổi nồng độ acid malic và acid lactic sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau. ................................................................... 94 Đồ thị 4. 10 Sự thay đổi pH trước và sau quá trình lên men malolactic ....................... 96 Đồ thị 4. 11 Sự thay đổi nồng độ chất khô trước và sau quá trình lên men malolactic 97 Đồ thị 4. 12 Sự thay đổi nồng độ acid tổng trước và sau quá trình lên men malolactic 98 Đồ thị 4. 13 Sự thay đổi độ rượu trước và sau quá trình lên men malolactic ............... 99 Đồ thị 4. 14 Sự thay đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trước và sau quá trình lên men malolactic. ............................................................................................................ 100 ix Đồ thị 4. 15 Sự thay đổi pH theo thời gian lên men malolactic .................................. 102 Đồ thị 4. 16 Sự thay đổi nồng độ chất khô theo thời gian lên men malolactic ........... 102 Đồ thị 4. 17 Sự thay đổi nồng độ acid tổng theo thời gian lên men malolactic .......... 103 Đồ thị 4. 18 Sự thay đổi độ rượu theo thời gian lên men malolactic .......................... 103 Đồ thị 4. 19 Sự thay đổi acid malic và acid lactic theo thời gian lên men malolactic 104 Đồ thị 4. 20 Mật độ vi khuẩn sau cố định với các kích thước khác nhau và qua các chế độ khuấy đảo khác nhau. ............................................................................................. 106 Đồ thị 4. 21 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào vi khuẩn. ......................... 108 Đồ thị 4. 22 Biến đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trong mỗi chu kì khảo sát 113 Đồ thị 4. 23 Biến đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trong mỗi chu kì khảo sát 115 x Chương 1: Mở đầu CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Rượu vang là một loại thức uống có cồn thu được từ quá trình lên men nước ép nho hoặc một số loại trái cây khác. Lên men rượu là một hình thức rất cổ xưa trong công nghệ thực phẩm trên thế giới, nó đã có cách đây hàng ngàn năm. Việc sản xuất rượu vang đã trở thành một hình thức kinh doanh toàn cầu, nó đã và đang ảnh hưởng đáng kể đến nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới (Walker, 2000). Việc lên men rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêm giống nấm men vào nước trái cây. Giống vi sinh vật tốt nhất dùng cho quá trình này là Saccharomyces cerevisiae, được sử dụng rộng rãi để chuyển hóa ethanol từ đường glucose và fructose trong nước ép nho (Klingshirn, 2002) [37]. Một nhóm vi sinh vật khác liên quan đến quá trình lên men rượu vang đó chính là vi khuẩn acid lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu lần hai hay còn gọi là lên men malolactic. Hiệu suất của quá trình lên men malolactic phụ thuộc vào đặc điểm của từng loại quả (Bozoğlu và Yurdugül, 2000), đặc biệt là lượng acid malic có trong quả. Nếu hàm lượng acid malic quá cao thì việc lên men malolactic là cần thiết để chuyển acid L-malic thành acid L-lactic, kết quả là làm giảm lượng acid trong rượu, giảm được vị chua gắt, cải thiện được hương vị của rượu vang (Steinkraus, 1992) [37]. Lên men malolactic là một quá trình quan trọng trong sản xuất rượu vang hay ít nhất là những loại rượu vang có hàm lượng acid cao ở những vùng có khí hậu mát mẻ. Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trong những loại rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượu vang nhờ sự hoạt động của vi khuẩn và ổn định hệ vi sinh vật có trong rượu vang (Bozoğlu và Yurdugül, 2000). Vi khuẩn acid lactic tham gia vào quá trình lên men malolactic được gọi là vi khuẩn malolactic, thuộc chi Leuconostoc,Pediococcus và Lactobacillus (Lonvaud-Funel, 2000; Văn Vuuren và Dicks, 1993; Versari, Parpinello, và Cattaneo, 1999), chúng có khả năng chuyển hóa trực tiếp acid malic thành acid lactic và CO2 nhờ malate carboxylase hay còn gọi là malolactic enzyme (MLE) (Bozoğlu and Yurdugül, 2000; Fugelsang, 1997; Renault et al., 1988;Salema et al., 1996). Quá trình 1 Chương 1: Mở đầu này có thể xảy ra tự phát trong thời gian lưu trữ rượu hoặc được điều khiển bởi các tác nhân vi sinh vật [37]. Ở Việt Nam, hầu hết các sản phẩm rượu vang đều chỉ trải qua 2 giai đoạn, đó là giai đoạn lên men rượu và lên men phụ nhằm lắng trong cũng như ổn định chất lượng rượu vang mà không có quá trình lên men malolactic. Chính điều này cũng đã góp phần làm hạn chế chất lượng cũng như mùi vị của sản phẩm, đặc biệt là đối với những loại quả có hàm lượng acid malic cao. Để cải tiến kỹ thuật sản xuất rượu thì một trong những kỹ thuật đang được quan tâm nhiều đó là kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật trên chất mang. Ưu điểm lớn nhất của tế bào cố định là có thể chủ động điều khiển được quá trình lên men, đồng thời tế bào sau khi cố định cũng có thể tái sử dụng nhiều lần và không lẫn vào sản phẩm. 2 Chương 2: Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về chanh dây 2.1.1 Nguồn gốc Có khoảng 400 loại chanh dây được trồng ở các nước nhiệt đới, nhưng chỉ có 30 loại ăn được. Chanh dây là loại trái cây có hình quả trứng, mọc chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt. Loài cây này có nguồn gốc ở Brazil, được nhập vào Việt Nam khoảng đầu thế kỷ 20, được trồng ở Lâm Đồng, Kontum, Gia Lai, Đắk Lắk… để lấy quả làm nước giải khát, làm cảnh và che bóng mát. Đến nay, một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như: Hậu Giang, Cần Thơ, An Giang, Kiên Giang…cũng bắt đầu phát triển trồng chanh dây để lấy quả cung ứng cho nhu cầu thị trường. 2.1.2 Đặc điểm sinh học Cây chanh dây còn gọi là dây mát, mát mát, dây lạc tiên trứng, dây chùm bao trứng, tên khoa học Passiflora edulis Sims, thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae). Chanh dây là một loại dây leo, thân nhỏ, hình trụ có rãnh dọc, nhiều lông thưa. Cây mọc leo có khi dài tới hàng chục mét. Hoa mọc ở kẽ lá, màu trắng hồng, đài 5 cánh màu xanh lục, cánh hoa dài 2 – 2.5 cm; tràng 5 cánh rời nhau, xếp xen kẽ với các lá đài; tràng phụ do 4 – 5 hàng sợi trắng, gốc tím; cuống nhụy dài 1.5cm. Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, da trơn hoặc nhăn nhăn nhẹ, rộng 4 – 6 cm, vỏ màu tím đỏ hoặc màu vàng. Bên ngoài trái cây chứa nhiều nước vị chua chua ngọt ngọt, thơm nhẹ nhàng, với vô số hạt nhỏ. 3 Chương 2: Tổng quan tài liệu Hình 2. 1 Trái chanh dây [47]. Người ta thường chỉ trồng chanh dây cho trái màu nâu tím, hoặc loại trái màu vàng, chịu được nóng. Có thể trồng cây bằng cách gieo hạt, giâm cành hoặc chiết ghép. Cây chanh dây rất dễ trồng, ưa đất khô ráo, cần ít nước, thậm chí sống được cả nơi sỏi đá hoặc đất cát. Cây đạt độ trưởng thành ở 12 tháng tuổi, có thể vươn dài tới 15 m, cho thu hoạch tốt trong vòng 5 – 6 năm, mỗi năm từ tháng 10 đến tháng 4, nhưng thường sau 4 năm người ta lại thay cây mới. 2.1.3 Thành phần hóa học Chanh dây có hàm lượng đường vừa phải (8.5g glucide/100g), thấp hơn một số loại trái cây thông thường khác (trung bình là 9 – 12g/100g), nhưng phần lớn lượng đường này là fructose có độ ngọt cao (so với đường saccharose), vì vậy chanh dây vẫn có vị ngọt, mặc dù nó còn chứa các loại axit hữu cơ, chủ yếu là axit citrique (3.9g/100g, ít chua hơn trái chanh). Ngoài ra, trong chanh dây còn có một tỉ lệ chất nhất định proteine, lipide, các chất khoáng và chất vi lượng như sắt, phốtpho, kẽm, magnesium,… nhiều loại vitamin, đặc biệt là vitamin C và nhất là chất xơ (fibre); về 4 Chương 2: Tổng quan tài liệu năng lượng cung cấp, chanh dây tương đương với xoài, sơri; về magnesium, tương đương với chuối… Các acid amin gồm có: prolin, valin, tyrosin, treonin, glycin, leucin, arginin. Hạt có chứa nhiều dầu béo ăn được. Thành phần dinh dưỡng trong 100g “thịt” quả: Ca Fe Vitamin Vitamin (mg) (mg) (mg) A (IU) 35-64 0.4-2.1 Chất xơ Protein C (mg) 4-17 Hàm P 700-2410 30-70 (g) 0.6-0.8 Glucid Lipid (g) (g) (g) 1.2-2.4 8.5-10 0.2-0.3 lượng [35] Tỷ lệ đường trong chanh dây: Thành phần (%) Loại chanh dây Fructose Glucose Saccharose Đỏ tía 33.5 37.1 29.4 Vàng 29.4 38.1 32.4 [35] Hàm lượng acid có trong chanh dây: Loại chanh Acid (%) dây citric malic lactic malonic succinic ascorbic Đỏ tía 13.1 3.86 7.49 4.95 2.42 0.05 Vàng 55 10.55 0.58 0.13 Rất ít 0.06 [35] 2.1.4 Ứng dụng Nhờ hương vị phong phú, chanh dây thường đựơc ép lấy nước để làm sirô giải khát hoặc chế biến các loại thực phẩm, thức uống… Ngoài ra, chanh dây còn có tác dụng an thần, gây ngủ nhẹ, giảm sự lo âu hồi hộp, hạ huyết áp (nhẹ), dịu các cơn co giật (trong cơn động kinh), giảm cơn đau bụng cơ năng và đau bụng kinh [52]. 5 Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.2 Lên men rượu vang 2.2.1 Giới thiệu sơ lược về rượu vang Rượu vang là loại đồ uống có cồn, tạo ra từ quá trình lên men dịch nho tươi. Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm. Đây là một thức uống có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon và có lợi cho sức khỏe con người khi dùng một cách điều độ. Ngoài thành phần chủ yếu là nước (chiếm từ 65% đến 85%), rượu nho còn chứa nhiều hợp chất khác: các hợp chất vô cơ, hợp chất hữu cơ gồm rượu (chủ yếu là rượu etylic, rượu glycerol), acid hữu cơ, polyphenol (gồm anthocyane (chất màu thực vật: xanh da trời, tím hoa cà), và chất chát), enzyme, vitamin. Hàm lượng đường của rượu biến đổi từ 4.5% đến 16%. Việc làm rượu vang bắt đầu ngay từ khi con người sống gần các cây nho hoang dã, vào khoảng 4000 năm trước công nguyên, bắt đầu ở Caucase rồi sau đó là Mésopotamie. Ngày nay rượu vang được ưa chuộng trên khắp thế giới, đặc biệt là ở các nước Châu Âu. Bảng 2. 1: Một số nước sản xuất rượu vang hàng đầu thế giới Thứ tự Nước Sản lượng (tấn) 1 France 5,329,449 2 Italy 5,056,648 3 Spain 3,934,140 4 USA 2,232,000 5 Argentina 1,564,000 6 China 1,300,000 7 Australia 1,274,000 8 South Africa 1,157,895 9 Germany 1,014,700 10 Chile 788,551 [58] 6 Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.2.2 Tác nhân vi sinh vật Lên men rượu thường được chia thành 2 giai đoạn: Lên men chính ở nhiệt độ 20-30oC khoảng 10 ngày hoặc dài hơn, quá trình lên men chính hoạt động nhờ các loại nấm men Saccharomyces và lên men phụ ở nhiệt độ 15 – 18oC, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau quá trình lên men chính. Cấu tạo của tế bào nấm men: nấm men là vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm Eukaryote, tế bào có dạng hình ovan, dạng bụi hoặc dạng bông, sinh sản bằng cách nảy mầm hoặc sinh sản tách đôi, phát triển tốt ở nhiệt độ 18 – 25oC, ức chế sinh sản ở nhiệt độ 35oC và ở 40oC thì ngưng sinh sản. pH tối thích là 4 – 6, do đó trong sản xuất rượu vang người ta thường chuẩn bị dịch quả có pH từ 3 – 3.5. Tế bào có cấu tạo rất phức tạp gồm có màng tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, nhân không bào, các hạt dự trữ như glycogen, voluten,... Trong tế bào còn có ribosome nơi tổng hợp protein và ty thể nơi xảy ra quá trình oxy hóa khử cung cấp nguồn năng lượng cho tế bào. Hình 2. 2 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae [55][57]. Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men: Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc chủng giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy. Men ép chứa trung bình 75% nước, 25% chất khô. Các chất khô của nấm men bao gồm những thành phần sau: protid 30 – 50%, glucid 24 – 40%, lipid 2 – 5%, khoáng 5 – 11% [36]. Yêu cầu của chủng nấm men trong quá trình lên men này là: phát triển nhanh trong dịch đường lên men, có thể lên men ở môi trường có nồng độ acid cao và độ cồn cao. 7 Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.2.3 Cơ sở hóa sinh Lên men rượu là một quá trình sinh học, dựa trên cơ sở hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các loại nước quả dưới tác dụng của các enzyme của nấm men, trong đó từ cơ chất ban đầu là các dạng đường lên men được sẽ chuyển hóa thành ethanol và khí CO2 thông qua hoạt động trao đổi chất của một số vi sinh vật đặc biệt (nấm men, trực khuẩn) ở điều kiện kị khí. Cơ chế của quá trình này có thể được tóm tắt theo sơ đồ sau: Sơ đồ 2. 1 Cơ chế lên men ethanol [58]. 8 Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men Ảnh hưởng của nhiệt độ Nấm men Saccharomyces cerevisiae thích hợp lên men ở nhiệt độ tối ưu là 28 – 320C. Nếu lên men ở nhiệt độ thấp 20 – 220C, thời gian lên men sẽ kéo dài. Tuy nhiên, nhiệt độ này sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. Ở nhiệt độ 33 – 350C, hoạt tính của nấm men sẽ giảm và điều kiện thuận lợi để vi khuẩn, nấm men hoang dại phát triển mạnh. Ở nhiệt độ 300C, nấm men hoang dại phát triển mạnh hơn nấm men S.cerevisiae 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 – 380C chúng phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần. Mặt khác, khi lên men rượu ở nhiệt độ cao sản phẩm sẽ tạo ra nhiều este, aldehyt, CO2…Ở 400C, phần lớn nấm men sẽ ngừng sinh trưởng [40]. Ảnh hưởng của pH Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo màng tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ hoạt động trong một trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của môi trường. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo thành ethanol là 4.5 – 5.0. Nếu tăng pH thì rất dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin sẽ tạo ra nhiều hơn, do đó sẽ làm giảm hiệu suất lên men. Khi pH < 4.2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH ở 4.5 – 5.0 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển [40]. Khi nấm men đã phát triển nhanh và đủ mạnh, ta tăng pH đến giá trị tối ưu cho nấm men phát triển về điều kiện tối ưu. Lúc này, điều kiện cũng tốt hơn cho các tạp khuẩn phát triển nhưng vì nấm men có lợi thế về số lượng nên lấn át được hơn so với các vi sinh vật tạp khuẩn khác nên không gây hại gì cho quá trình lên men. Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô ban đầu trong dịch lên men Thông thường khi hàm lượng chất khô ban đầu quá cao, hiệu suất lên men không cao. Khi nồng độ đường trong dịch lên men đạt 30 – 35% thì quá trình lên men dường như bị ngừng lại, còn ở nồng độ 25 – 30% thì nấm men phát triển rất chậm. Nồng độ tối thích cho nấm men phát triển là 10 – 18% đường. Dung dịch có nồng độ đường cao sẽ gây ra một áp suất thẩm thấu lớn, làm mất cân bằng trạng thái sinh lí bình thường của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài nấm men sẽ không sử dụng 9