Tài liệu Khảo sát khả năng tiêt khảo sát khả năng tiêt enzyme exo cellulase của các chủng nâm trichodermaenzyme

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG TRẦN THỊ CẨM NHỤY KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME EXO-CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA Luận văn tốt nghiệp Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Cần Thơ, 2010 TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Tên ñề tài: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME EXO-CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA Giảng viên hướng dẫn: ThS. Dương Minh Ks. ðào Thị Hồng Xuyến Ks. Tô Huỳnh Như Sinh viên thực hiện: Trần Thị Cẩm Nhụy MSSV: 3064959 Lớp: BVTV K32 Cần Thơ, 2010 i TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Chứng nhận ñã chấp thuận luận văn với ñề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME EXO-CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA” Do sinh viên TRẦN THỊ CẨM NHỤY thực hiện và ñề nạp. Kính trình hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp xem xét. Cần Thơ, ngày ….. tháng ..... năm 2010 Cán bộ hướng dẫn ThS. DƯƠNG MINH ii TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp ñã chấp thuận luận văn với ñề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME EXO-CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA” Do sinh viên TRẦN THỊ CẨM NHỤY thực hiện và bảo vệ trước hội ñồng ngày….. tháng….. năm 2010. Luận văn ñã ñược hội ñồng chấp thuận và ñánh giá ở mức:…………………… Ý kiến hội ñồng:……………………………………………………………….. ………………………………………………………………………………………... ……………………………………………………………………………………….. Cần Thơ, ngày ….. tháng ….. năm 2010 DUYỆT KHOA Chủ tịch hội ñồng Trưởng khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng iii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì luận văn nào trước ñây. Tác giả luận văn (ký tên) Trần Thị Cẩm Nhụy iv LÝ LỊCH CÁ NHÂN Sinh viên: Trần Thị Cẩm Nhụy. Sinh ngày 04 tháng 02 năm 1984. Tại xã Phú Hữu, huyện An Phú, tỉnh An Giang. Con Ông: Trần Văn Ơn. Và Bà: Trần Thị Bé. ðã tốt nghiệp tại trường Phổ thông trung học Tân Châu, huyện Tân Châu, tỉnh An Giang, năm 2003. Vào trường ðại học Cần Thơ năm 2006, theo học ngành Bảo Vệ Thực Vật, khóa 32. Tốt nghiệp Kỹ sư Nông Nghiệp chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật năm 2010. v LỜI CẢM TẠ Kính dâng! Ba mẹ những người suốt ñời tận tụy vì chúng con, xin cảm ơn những người thân ñã giúp ñỡ, ñộng viên con trong suốt thời gian qua. Thành thật biết ơn Thầy Dương Minh, Ks. ðào Thị Hồng Xuyến, Ks. Tô Huỳnh Như, Ks. Phan Thị Mỹ Phúc, Ks. Phan Quốc Kiệt và Ks. Trần Minh Tài ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ và ñộng viên em trong suốt thời gian làm và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Chân thành cảm tạ thầy cố vấn học tập Lê Văn Vàng, cùng toàn thể quý thầy cô khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng vì những kiến thức mà quý thầy cô ñã truyền dạy cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. ðây sẽ là hành trang vững chắc giúp em bước vào ñời. Xin gửi lời cảm tạ ñến: - Các anh chị trong Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật ñã ñóng góp những ý kiến quý báu và tạo ñiều kiện thuận lợi cho em hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. - Các bạn cùng khóa và tập thể lớp Bảo Vệ Thực Vật khoá 32 ñặc biệt là bạn Phúc, Duy, Diện, Thúy và Xuyến... ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Xin cảm ơn sự hỗ trợ và ñộng viên của các bạn. Trân trọng! vi MỤC LỤC Lời cam ñoan Lý lịch cá nhân Lời cảm tạ Mục lục Danh sách bảng Danh sách hình Tóm lược MỞ ðẦU Chương 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về ñặc ñiểm chung của Trichoderma 1.1.1 ðặc ñiểm phân bố của Trichoderma 1.1.2 ðặc ñiểm sinh thái của Trichoderma 1.2 Khả năng tiết enzyme trong quá trình ñối kháng của Trichoderma 1.3 Khả năng phân hủy chất hữu cơ của Trichoderma 1.4 Khả năng kích thích sự phát triển cây trồng của Trichoderma 1.5 Sự phân giải cellulose Chương 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện 2.1.1 Thời gian và ñặc ñiểm 2.1.2 Vật liệu thí nghiệm 2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.1 Mục ñích 2.2.2 Thí nghiệm 2.2.3 Bố trí thí nghiệm 2.2.4 Chỉ tiêu theo dõi 2.2.4.1 Xác ñịnh giá trị protein trong mẫu dịch trích 2.2.4.2 Khảo sát hoạt tính exo-cellulase Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ghi nhận tổng quát 3.2 Kết quả thí nghiệm 3.2.1 Khả năng tiết exo-cellulase của các chủng Trichoderma 3.2.2 Giá trị protein trong dịch trích của các chủng Trichoderma 3.2.3 Sinh khối khô của các chủng Trichoderma Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 ðề nghị vii Trang iv v vi vii ix ix x 1 2 2 2 3 3 5 6 7 8 8 8 8 10 10 10 10 10 10 11 13 13 13 13 15 16 20 20 20 Tài liệu tham khảo Phụ chương 21 viii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 ðộ hấp thu OD của exo-cellulase trong dịch trích của các chủng Trichoderma sau 7 ngày và 10 ngày nuôi lắc (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2009 - 2010). 14 3.2 ðộ hấp thu OD của protein trong dịch trích của các chủng Trichoderma sau 7 ngày và 10 ngày nuôi lắc (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2009 - 2010). 16 3.3 Sinh khối khô (g/lít) của các chủng Trichoderma sau 10 ngày nuôi lắc trong môi trường TSM lỏng (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2009 - 2010). 18 DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 1 Bố trí thí nghiệm trên máy lắc ngang. 19 2 Trichoderma sau 7 ngày nuôi lắc. 19 3 Chuẩn bị mẫu ño ñộ hấp thu OD của exo-cellulase bằng Spectrophotometer. 19 4 Máy ño ñộ hấp thu quang phổ Spectrophotometer. 19 ix Trần Thị Cẩm Nhụy, 2010. “Khảo sát khả năng tiết enzyme exo-cellulase của các chủng nấm Trichoderma”. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường ðại học Cần Thơ. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ TÓM LƯỢC ðề tài “Khảo sát khả năng tiết enzyme exo-cellulase của các chủng nấm Trichoderma” ñược thực hiện từ tháng 8/2009 ñến tháng 3/2010 nhằm chọn lọc các chủng Trichoderma có khả năng tiết nhiều exo-cellulase cao trong ñiều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả ñạt ñược sẽ góp phần hữu ích trong việc phân hủy rơm rạ trên ñồng ruộng, giúp hạn chế ngộ ñộc hữu cơ cho cây lúa theo hướng sinh học. Thí nghiệm ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm, bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường ðại học Cần Thơ từ tháng 8/2009 ñến 3/2010, bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại. Ba mươi chủng Trichoderma ñược nuôi cấy trong bình tam giác (250 ml) chứa 100 ml môi trường TSM lỏng có CMC (5g/lít) với mật số 106 bào tử/ml, lắc trong 7 và 10 ngày với tốc ñộ 140 vòng/phút (rpm). Dịch trích các mẫu ñược lọc qua giấy Whatman # 5, trữ ở 40C và xác ñịnh hoạt tính của exo-cellulase theo phương pháp Ghose (1987), giá trị protein theo phương pháp Bradford (1976). Kết quả thí nghiệm cho thấy: - Sinh khối khô của các chủng T-VTa4c (0,950 g/l), T-LM3a (0,935 g/l), TVTu3g (0,930 g/l) ñạt cao nhất khi nuôi trong môi trường TSM lỏng (có CMC) sau 10 ngày nuôi lắc, kế ñến là các chủng ñạt sinh khối khá cao là T-VTa1a (0,788 g/l) và T-VTa3a (0,763 g/l). - Hai chủng T-TTAG3b và T-VTu3g có hoạt tính exo-cellulase cao nhất (0,2058 và 0,1913) sau 7 ngày nuôi lắc; còn ở 10 ngày sau khi chủng thì T-VTa3a, T-VTa4b và T-BM2a là cao nhất (0,2108; 0,2078 và 0,2060). - Chủng T-VTu3g có hoạt tính exo-cellulase cao ở cả hai thời ñiểm 7 và 10 ngày nuôi lắc (có hệ số OD ở 2 thời ñiểm tương ứng là 0,1913 và 0,1895). - Chủng Trichoderma T-VTa3a có khả năng tiết exo-cellulase và giá trị protein cao sau 10 ngày nuôi lắc. Bên cạnh ñó, T-VTa3a cho sinh khối cao sau 10 ngày nuôi lắc. Từ kết quả này, các chủng Trichoderma ñược chọn là T-TTAG3b, T-VTu3g và T-VTa3a tiết ra nhiều exo-cellulase sẽ tiếp tục ñược thử nghiệm trong ñiều kiện thực tế ñể ñánh giá khả năng phân hủy cellulose và chọn lọc ra những chủng nấm có hiệu quả nhất phục vụ việc phân hủy chất hữu cơ. x MỞ ðẦU Trong những năm gần ñây, nền nông nghiệp Việt Nam có những bước tiến vượt bậc nhất là khi Việt Nam gia nhập vào tổ chức WTO, nước ta bắt ñầu chú trọng nhiều ñến sản xuất nông nghiệp theo hướng sinh thái bền vững, tăng số và nâng cao chất nông sản. Với tập quán canh tác của nông dân là loại bỏ rơm rạ khỏi ñồng ruộng với mục ñích làm chất ñốt hoặc thức ăn cho gia súc. ðiều này ñã làm giảm chất dinh dưỡng trả lại cho ñất từ rơm rạ, ảnh hưởng xấu ñến môi trường, làm suy kiệt ñất ñai và khả năng tăng năng suất lúa trong tương lai. ðể tận dụng nguồn phế thải này vào sản xuất nông nghiệp nhưng không làm ô nhiễm môi trường. Vì vậy, việc xử lý chất thải hữu cơ bằng vi sinh vật ñể làm phân bón ñã ñược quan tâm ở nhiều nước. Phân hữu cơ không những cung cấp chất dinh dưỡng cho ñất mà còn góp phần bảo vệ môi trường sinh thái (Nguyễn Lan Hương và Hoàng ðình Hoà, 2003). Sử dụng Trichoderma cho việc ủ phân hữu cơ hiện nay ñược ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Quy trình ủ phân với Trichoderma làm thúc ñẩy nhanh hơn tiến trình phân hủy rác thải nông nghiệp từ 6 tháng giảm xuống trong 4 tuần, sản phẩm phân hữu cơ ñược tạo ra từ việc ủ với Trichoderma có tỷ số C/N khoảng 11,6 (Alexander, 2006, trích từ Phan Quốc Kiệt và Nguyễn Minh Hùng, 2009). Trichoderma có khả năng ñối kháng ñược với nhiều loại nấm bệnh như Rhizoctonia, Fusarium, Phytophthora, Pythium… (Wells, 1993). Nấm có nhiều cơ chế ñể kiểm soát bệnh hại thực vật như là cạnh tranh dinh dưỡng, ký sinh, tạo chất kháng sinh hay tiết các enzyme thủy phân vách tế bào ký chủ như: glucanases, chitinases, cellulases… là loại nấm hoại sinh ñóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy hữu cơ trong ñất (Cao Cường và Nguyễn ðức Lượng, 2003). Trước những triển vọng mà Trichoderma mang lại, việc nghiên cứu và ứng dụng loài nấm thiên ñịch này trong phòng trừ bệnh hại cây trồng là ñiều rất cần thiết. Trên cơ sở ñó, ñề tài “Khảo sát khả năng tiết enzyme exo-cellulase của các chủng nấm Trichoderma” nhằm chọn lọc các chủng Trichoderma có khả năng tiết nhiều exo-cellulase và có khả năng cho sinh khối cao trong ñiều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả ñạt ñược sẽ góp phần ñể chọn các chủng nấm có khả năng phân hủy các dư thừa thực vật có chứa cellulose cao góp phần vào việc phục vụ sản xuất nông nghiệp ở ñồng bằng sông Cửu Long. 1 Chương 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT VỀ ðẶC ðIỂM CHUNG CỦA NẤM TRICHODERMA 1.1.1 ðặc ñiểm phân bố của Trichoderma Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998) thì Trichoderma thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm Bất Toàn (Deuteromyces), bộ nấm Bông (Moniliales), họ Moniliaceace và chi Trichoderma. Bùi Xuân ðồng (1986) cho rằng Trichoderma thuộc nhóm Hyphomycetes, phân nhóm Euhyphomycetidae. Nấm này có giai ñoạn sinh sản hữu tính thuộc lớp Ascomycetes, bộ Hyporcaelos, chi Hypocrea (Agrios, 1997). Sợi Trichoderma có tỷ lệ phân nhánh cao, bào tử không có vách ngăn, khá tròn và có màu xanh lục. Lúc ñầu, sợi nấm có màu trắng về sau chuyển dần sang màu xanh, hình dạng bào tử của mỗi loài Trichoderma cũng khác nhau (Cook và Baker, 1989). Có nhiều loài khác nhau trong chi Trichoderma, Gams và Bissett (1998) ñã mô tả chi tiết ñặc ñiểm của 33 loài Trichoderma và tùy theo loài nấm mà chúng có hình dạng, kích thước và màu sắc khác nhau. Trichoderma là loại nấm có khu vực phân bố rất rộng, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, ñất nông nghiệp, ñồng cỏ, rừng… (Wells, 1993). ðặc biệt, loài Trichoderma thường hiện diện trong xác bã thực vật, trên bề mặt rễ và vỏ cây mục nát (Klein và Eveleigh, 1998; Harman, 1996). Tùy theo từng loài Trichoderma mà chúng sẽ thích nghi với ñiều kiện khí hậu và các tầng ñất hữu cơ khác nhau (Domsch và ctv., 1980; Roiger và ctv., 1991; Wardle và ctv., 1993). Turner và ctv. (1997) ñã ghi nhận loài Trichoderma longibrachiatum thường hiện diện ở Châu Phi và Ấn ðộ, cũng như loài Trichoderma citrinoviride ở ðông Nam Á và loài Trichoderma pseudokoningi ở New Zealand và miền ñông nước Úc. Theo Papavizas (1985), sự phân bố và ñiều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau. Nhìn chung, các loài Trichoderma hiện diện ở các vùng ñất axit nhiều hơn vùng ñất trung tính và kiềm. Trichoderma thường sống trong ñất có ẩm ñộ cao nhưng chúng cũng sống ñược ở vùng ñất khô ráo (Cook và Baker, 1989). Ở nước ta, Trichoderma là loại nấm thường xuất hiện trên các loại ñất giàu dinh dưỡng hoặc trên các tàn dư thực vật (Phạm Thị Thùy, 2004). ðặc trưng của Trichoderma là sống hoại sinh, ñồng thời nó còn sống ký sinh trên nấm gây bệnh cây trồng (Cook và Baker, 1989). Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng gây hại cho vi khuẩn gây bệnh cây trồng (Hadar và ctv., 1984). 2 1.1.2 ðặc ñiểm sinh thái của Trichoderma Hầu hết các loài Trichoderma ñều phát triển nhanh ở nhiệt ñộ 25 - 300C (Klein và Eveleigh, 1998). Theo McCray (2002), ở giai ñoạn ñầu của sự phát triển khuẩn lạc của các loài Trichoderma có màu trắng khi ñược nuôi cấy trên môi trường PDA (potato dextrose agar) hoặc trong suốt khi ñược nuôi cấy trên môi trường CMA (corn meal agar). Trong quá trình phát triển nấm thường tiết ra sắc tố vàng vào môi trường nhất là trên môi trường PDA. Một vài loài Trichoderma còn tỏa ra mùi hương cơm dừa ñặc trưng nên dễ dàng ñược nhận ra trong ñất (Collins và Halim, 1972; Kikuchi và ctv., 1974; Moss và ctv., 1975). McCray (2002) cho rằng ña số các loài Trichoderma ñều có khả năng sinh bào tử áo (chlamydospore). Bào tử áo thường có hình cầu ñến hơi bầu dục và thường ở dạng ñơn bào. Ở một vài loài như T. viride bào tử áo có thể ở dạng ña bào. 1.2 KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME TRONG QUÁ TRÌNH ðỐI KHÁNG CỦA NẤM TRICHODERMA Trichoderma là loài nấm sống hoại sinh nhưng ñồng thời cũng sống ký sinh trên nhiều loại nấm, vi khuẩn và tuyến trùng gây bệnh cho cây trồng (Cook và Baker, 1989). Trong quá trình tác ñộng lên nấm gây bệnh, ngoài tác dụng ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với nấm gây bệnh tiết ra các chất kháng sinh. Trichoderma còn tiết enzyme ngăn cản sự xâm nhập và gây bệnh của nấm gây hại cây trồng (Trần Thị Thuần và ctv., 2000) Cơ chế quá trình ñối kháng của Trichoderma gồm hai giai ñoạn: Giai ñoạn thứ nhất là bao quanh và cuộn tròn sợi nấm gây bệnh, giai ñoạn thứ hai là cơ chế hóa học, nấm Trichoderma tiết ra các loại enzyme thủy phân (Kredics và ctv., 2003) phân hủy chất nguyên sinh của sợi nấm gây bệnh làm cho sợi nấm chết. Theo Gayal và Khandeparkar (1998), cơ chế quan trọng giúp Trichoderma ñối kháng có hiệu quả với nấm gây bệnh cây là nhờ vào ñặc tính có khả năng tiết ra nhiều chất tiết của Trichoderma. Trong ñó, enzyme là nhân tố quan trọng giúp Trichoderma có khả năng ñối kháng dễ dàng lên cơ chất cũng như tấn công trực tiếp lên nấm bệnh. Với cấu trúc phức tạp của vách tế bào nấm gồm các polysaccharide như βglucan (trong ñó có β-1,3; β-1,4 và β-1,6-glucan) và chitin, ngoại trừ lớp nấm Oomycetes là không có chitin (Inglis và Kawchuck, 2002) cho nên enzyme thủy phân chitinase và β-glucanase (nhất là β-1,3-glucanase) ñóng vai trò quan trọng (Cruz và ctv., 1995). Trichoderma còn có thể tiết ra nhiều enzyme khác như exo-glucanase hay cellobiase, endo-glucanase và chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào nấm. 3 Enzyme thủy phân cellulase do Trichoderma tiết ra có tầm quan trọng trong việc làm mềm vách tế bào nấm gây bệnh (Nguyễn Thân, 2004). Theo Margolles-Clark và ctv. (1995), các enzyme ñược tiết ra từ Trichoderma thì chitinases và glucanases ñóng vai trò chủ ñạo trong hoạt ñộng ký sinh của Trichoderma. Do vách tế bào của hầu hết các loài nấm ñều ñược cấu tạo bởi chitin và glucan nên tác ñộng ñồng thời của endo-chitinase và glucanase lên vách tế bào nấm bệnh sẽ làm tăng khả năng ñối kháng của Trichoderma. Cao Cường và Nguyễn ðức Lượng (2003) cho rằng khả năng tiết cellulase của Trichoderma tăng lên khi sử dụng cơ chất là CMC (carboxyl methyl cellulose) hoặc bột cellulose. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Nghĩa (2007) cho thấy việc bổ sung thêm CMC, β-1,3-glucan và nấm Phytophthora palmivora vào môi trường TSM lỏng ñể nuôi cấy các chủng T-BM2a, T-CB8c, T-CTTG6b, T-OM9e ñã giúp tăng cường khả năng tạo sinh khối khuẩn ty. ðặc biệt, chủng T-CTTG6b phát triển tốt nhất và cho sinh khối cao nhất khi ñược bổ sung thêm CMC. Một vài nghiên cứu ñã chứng minh Trichoderma tăng khả năng ñề kháng của cây ký chủ, ñiển hình loài T. viride tiết ra cellulase làm tăng phản ứng phòng vệ (phản ứng siêu nhạy cảm) trên cây nho (Calderon và ctv., 1993). Trichoderma có khả năng tiết enzyme chitinase cắt chitin của vách tế bào nấm bệnh thành glucosamine (ñơn phân tử của chitin) làm nền tạo chất kích kháng bệnh cho cây trồng, các chủng Trichoderma ñược sử dụng như tác nhân ñối kháng hiệu quả với nấm Fusarium solani gây hại cây trồng (Lafontaine và Benhamou, 1996). Thêm vào ñó, Dương Minh và ctv. (2003) ñã khẳng ñịnh các dòng Trichoderma spp. có khả năng tiết chitinase cao ñều có khả năng ñối kháng với nấm bệnh Fusarium solani gây bệnh thối rễ trên cam quít. Enzyme β-1,3-glucanase ñược phân lập từ loài T. harzianum cũng có khả năng ức chế sự nẩy mầm của ñộng bào tử và kìm hãm sự phát triển sợi nấm của Phytophthora capsici trong ñiều kiện phòng thí nghiệm (Ahmed và ctv., 1999). Theo Clark và ctv. (1995), loài T. reesei cũng sản xuất số lượng lớn enzyme glucanase và cellulase tạo thuận lợi cho biểu hiện của endo-chitinase. Trong quá trình ñối kháng bên cạnh việc tiết enzyme thì khả năng tạo sinh khối, tốc ñộ phát triển của Trichoderma có ý nghĩa quan trọng ñối với nấm gây bệnh cây trồng (Mehrotra, 2000). Trichoderma không chỉ ñối kháng với nấm mà chúng còn có khả năng ñối kháng với vi khuẩn (Hadar và ctv., 1984), nhờ hoạt ñộng của những enzyme như protease, NAGase (β-1,4-N-acetyl-glucansaminidase), muramidase có khả năng phân hủy tế bào vi khuẩn (Kredics và ctv., 2003). Theo Nguyễn Lân Dũng (1983) thì Weindling (1932) cho biết chất gliotoxin do T. viride sinh ra có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Streptococies viridans. 4 Theo Angelica (2001), cơ chế kiểm soát nấm bệnh gián tiếp của Trichoderma là sự cạnh tranh về dinh dưỡng (Zimand và ctv., 1995) và không gian sống (Dubos và ctv., 1982), sự hiện diện của T. harzianum làm thay ñổi môi trường phát triển của Botrytis cenerea. Sự tăng trưởng nhanh của Trichoderma làm khả năng cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian mạnh ức chế sự phát triển của Cladosporium herbarum khi nuôi cấy hai loại nấm này trong cùng môi trường. Trichoderma bên cạnh phòng trừ bệnh chết rạp cây con, còn có khả năng tạo sinh khối trong ñất bảo vệ hệ rễ cây bằng cách cạnh tranh, ký sinh hoặc ñối kháng sinh học ñối với nấm bệnh (Hadar và ctv., 1984, trích từ Phan Văn Phấn, 2005). Theo Schneider (1982), cách tốt nhất ñể ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh là giới hạn nguồn dinh dưỡng trong ñất. Khi trong ñất không có dinh dưỡng dư thừa thì mầm bệnh không thể phát triển tốt, thậm chí chúng sẽ suy yếu dần. ðiều này cho thấy sự cạnh trạnh dinh dưỡng giữa các loài nấm ký sinh như Trichoderma sống gần rễ với mầm bệnh cũng là một nhân tố quan trọng ñể khống chế nguồn bệnh trong ñất. 1.3 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHẤT HỮU CƠ CỦA NẤM TRICHODERMA Ngoài khả năng ñối kháng, tiết enzyme, tiết kháng sinh ñể ñối phó và ức chế nấm gây bệnh. Trichoderma còn có khả năng phân hủy chất hữu cơ (Gams và Bissett, 1998; Phạm Văn Kim, 2000). Bên cạnh ñó, nấm còn góp phần tích cực trong việc chuyển hóa chất hữu cơ tạo ñộ phì nhiêu cho ñất và giúp duy trì hoạt ñộng sản xuất của ñồng ruộng (Cook và Baker, 1989). Trichoderma có vai trò quan trọng trong việc phân hủy xác bã thực vật có trong ñất (Kredics và ctv., 2003). Trong quá trình sống nấm ñã tiết ra nhiều enzyme thủy phân như: cellulase, glucanase… giúp cho những chất hữu cơ trong ñất ñược thủy phân nhanh hơn, ñẩy mạnh quá trình hóa dinh dưỡng trong ñất giúp cây trồng dễ hấp thu và có ñiều kiện sinh trưởng tốt trên nền ñất có nhiều chất hữu cơ, do ñó có khả năng ñề kháng bệnh cũng tăng (Nguyễn Văn Tuất và Lê Văn Thuyết, 2000). Dương Minh và ctv. (2003) Trichoderma có khả năng phân hủy tốt một số loại xác bã thực vật, hữu dụng trong quá trình ủ phân hữu cơ. Chẳng hạn, sau 9 tuần xử lý 7 loại dư thừa thực vật như: lục bình, thân ñậu nành, thân và lá bắp, thân chuối, rơm và vỏ trấu bằng Trichoderma thì các dư thừa thực vật ñều bị phân hủy cao tới 25,9%. Qua kết quả thử nghiệm của Bowen và Harper (1990) cho thấy Trichoderma viride có thể phân hủy 20% cellulose của cọng rơm nguyên sau 84 ngày xử lý. Khi các nguồn thực vật từ bắp, cỏ, rơm, lục bình… có chủng Trichoderma thì quá trình hoai mục tăng nhanh (Nguyễn Văn Bạc, 2002). Qua quá trình nghiên cứu của Lynch và Harfer (1985) cho rằng các loài Trichopderma có vai trò quan trọng trong nông nghiệp vì chúng phân giải cellulose của rơm rạ còn lại sau vụ mùa chuyển hóa chúng thành ñường ñồng thời còn có khả 5 năng ký sinh và tiêu diệt một số loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Những ñường do sự phân hủy rơm rạ ñược tạo ra, lại trở thành dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn yếm khí cố ñịnh ñạm Clostridium butyrium. Sự phát triển C. butyrium làm gia tăng hàm lượng ñạm trong ñất. Hàm lượng ñạm này sẽ ñược tái cung cấp cho Trichoderma phát triển nhanh lên và tiếp tục thúc ñẩy mạnh phân giải cellulose nhiều hơn, ñể cuối cùng cung cấp chất ñạm cần thiết cho cây trồng. 1.4 KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SỰ PHÁT TRIỂN CÂY TRỒNG CỦA TRICHODERMA Theo Chet và ctv. (2006), Trichoderma có khả năng tồn tại nhiều năm trên bề mặt rễ và thâm nhập vào biểu bì rễ, chúng tiết ra những cơ chất khác nhau có tác dụng kích thích cục bộ, tạo ra phản ứng ñề kháng nội hấp, kích thích sự biến ñổi về hình thái và sinh hóa của cây, kích thích sức ñề kháng bên trong cây khỏe mạnh. Nghiên cứu của Yedidia và ctv. (2001) cho rằng sau khi ký sinh lên rễ cây trồng Trichoderma sẽ xâm nhập vào mô cây, kích thích một chuỗi thay ñổi về hình thái và sinh hóa trong cây như sự thay ñổi cấu trúc polymer lignin và hydroxyproline làm gia tăng nồng ñộ chất hữu cơ trong vách tế bào cây chủ, gia tăng khả năng sản xuất hormone, tăng khả năng tiết ra các phytolaecxin của cây. Nhìn chung, sự hiện diện của Trichoderma có lợi cho cây trồng, ngoài tác ñộng ñối kháng với nấm bệnh hại cây, Trichoderma còn kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây. Loài Trichoderma harzianum kích thích hạt tiêu nẩy mầm sớm, thúc ñẩy sự ra hoa ở cây dừa cạn, gia tăng số lượng hoa trên cây, tăng chiều cao và trọng lượng ở những cây trồng khác (Cook và Baker, 1989). Theo Harman (1996) sự hình thành bào tử Trichoderma trên bề mặt rễ cũng sẽ thúc ñẩy sự sinh trưởng và phát triển của rễ, tăng khả năng hình thành chồi ngọn và sức chịu ñựng ñể chống lại stress, tăng ñộ hấp thu và sử dụng dinh dưỡng. Qua kết quả thí nghiệm của Harman (2000) chứng minh rằng nòi T 1290-22 của loài T. harzianum còn làm gia tăng số chồi và rễ bắp ngọt trong nhà lưới 66% so với ñối chứng. Hầu hết các loài Trichoderma ñều có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, do ñó khi áp dụng Trichoderma vào cây trồng sẽ nâng cao năng suất. Cây trồng giảm khả năng bị bệnh khi có sự hiện diện của nhiều loài Trichoderma tập trung (Gams và Bissett, 1998). Theo Bailey và Lumsden (1998), khi tưới huyền phù T. harzianum vào trong ñất làm tăng sự nẩy mầm, tăng khả năng ra hoa, tăng trọng lượng tươi và chiều cao của ớt, hoa cúc, bắp, cà chua, thuốc lá. Harman (2000) cho biết số lượng Trichoderma phù hợp sinh sống ở vùng rễ sẽ làm tăng số lượng rễ và bảo vệ chúng khỏi các nấm ký sinh gây bệnh ñồng thời cũng làm tăng sinh khối cây trồng. Mattner (2001) ñã chứng minh rằng tác ñộng kích thích ñối với sự sinh trưởng của cây trồng và ức chế nấm gây bệnh của Trichoderma có liên quan ñến chất allclochemical mà nó tiết ra. 6 1.5 SỰ PHÂN GIẢI CELLULOSE Cellulose là một polysaccharide có trong xác bã thực vật (nhất là trong thân & rễ), chiếm khoảng 50 - 80% trọng lượng khô (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2007). Theo Phạm Văn Kim (2000), cellulose ñược cấu tạo bởi các phân tử glucose nối với nhau nhờ cầu nối β-1,4. Mỗi phân tử cellulose gồm từ 2000 ñến trên 10.000 phân tử glucose, thậm chí lên ñến 15.000 phân tử glucose. Cellulose có cấu tạo dạng sợi, cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi ñơn vị là một monosaccharide gọi là cellobiose. Cellobiose có cấu trúc từ 2 phân tử glucose. Cấu trúc bậc 2 và bậc 3 rất phức tạp tạo thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết hydro. Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, bởi vậy cellulose là hợp chất khó phân giải (Trần Cẩm Vân, 2005). Cellulase thuộc lớp Hydrolases (phản ứng thủy phân), tổ Glycosidases (thủy phân liên kết glucoside), nhóm hydrolyzing O-glycosyl compounds (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007). Cellulase là các enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hoá cellulose thành các sản phẩm hòa tan là enzyme thủy phân cellulose (Nguyễn ðức Lượng và Cao Cường, 2003). Theo Gielkens và ctv. (1999); Parry và ctv. (1983), cellulase có thể phân loại trong ba kiểu: - Endo-cellulase (endo-ß-1,4-glucanase) có khả năng cắt ñứt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 bên trong phân tử tạo thành những chuỗi ngắn (Siddiqui và ctv., 2000). Kết quả là các polymer nhanh chóng giảm chiều dài. - Exo-cellulase hoặc cellobiohydrolase (exo-ß-1,4-glucanase) giúp phân giải các chuỗi trên ra từng ñoạn tạo thành disaccharides hay gọi là các ñơn vị cellobiose (Han và ctv., 1995; Akiba và ctv., 1995).Sau ñó, exo-cellulase thủy phân cellobiose thành glucose. Endo-cellulase Exo-cellulase Exo-cellulase Cellulose Cellulose Cellobiose glucose tự nhiên ñịnh hình 7 Chương 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHƯƠNG TIỆN 2.1.1 Thời gian và ñịa ñiểm ðịa ñiểm: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường ðại học Cần Thơ. Thời gian: Thí nghiệm ñược thực hiện từ tháng 8/2009 ñến tháng 3/2010. 2.1.2 Vật liệu thí nghiệm 2.1.2.1 Thiết bị - Nồi thanh trùng ướt hiệu Sibata (Nhật), model KL300. - Tủ cấy hiệu Dalton (Nhật), model FAP1300AN. - Cân ñiện tử: Hiệu Sibata (Nhật), model JPN-200W và hiệu Sartorius (ðức), model BL1500. - Máy ño pH hiệu Oaklon. - Máy ño quang phổ (Lnicam UV mC2 spectrometry). - Máy lắc hiệu Vortex Stuart SA6, Uk. 2.1.2.2 Dụng cụ - Bình tam giác 250 ml. - ðĩa petri ñường kính ñáy 9,5 cm, nắp 10 cm. - Lamme ñếm hồng cầu (Haemocytometer) hiệu Malassez (ðức). - Thùng giữ lạnh và nước ñá. 1.1.2.3 Hóa chất - Bovine Serum Albumin (Sigma). - Coomassie Brilliant Blue G250 (Sigma). - Các hóa chất dùng xác ñịnh hoạt tính của enzyme: Carboxyl methyl cellulose CMC (Merck), Na-Ktartarate (Merck), 3,5-dinitro-salicylic acid (Sigma), Na metabisufite, acid acetic, Na-acetate, Citric acid. - Các hóa chất cần thiết khác: Ethanol, phosphoric acid, NaOH, phenol, nước cất. 2.1.2.4 Nguồn nấm Ba mươi chủng Trichoderma (T) ñược nhận từ bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường ðại học Cần Thơ, gồm có: - Huyện Vị Thủy (Hậu Giang) có 15 chủng: T-VTa1a, T-VTa1d, T-VTa2b, TVTa2d, T-VTa3a, T-VTa3d, T-VTa3e, T-VTa4b, T-VTa4c, T-VTa5a, T-VTa5d, TVTa5e, T-VTa7a, T-VTa7b và T-VTa14c. - Huyện Long Mỹ (Hậu Giang) có 10 chủng: T-LM1b, T-LM1f, T-LM1g, TLM1h, T-LM3a, T-LM3c, T-LM3d, T-LM7a, T-LM7c và T-LM7e. - Huyện Bình Minh (Vĩnh Long) có 3 chủng: T-BM2a, T-BM5c và T-BM6b. 8 - Huyện Vị Thủy (Hậu Giang) có chủng: T-VTu3g. - Huyện Tri Tôn (An Giang) có chủng: T-TTAG3b. 2.1.2.5 Môi trường nuôi cấy Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) (Shurfleff và Averre III, 1997). Khoai tây Dextrose Agar Nước cất vừa ñủ pH 200 g 20 g 20 g 1000 ml 6,5 - 6,8 Môi trường TSM lỏng (Trichoderma Selective Medium Broth) (Elad và Chet, 1983). MgSO4.7H2O K2HPO4 KCl NH4NO3 Glucose Nước cất vừa ñủ pH CMC (carboxyl methyl cellulose) 0,2 g 0,9 g 0,15 g 1g 1g 1000 ml 6,5 5g Chuẩn bị hoá chất: - Chất nền: 15 mM cellobiose trong 0,05 M citrate buffer, pH 4,8. - Citrate buffer 1M: 210 g Citric acid ngậm nước (C6H8O7.H2O) Nước cất 750 ml Thêm NaOH cho ñến pH = 4,3 - Cellobiose 15 mM: Cellobiose 15 mM Citrate buffer 0,05 M, pH = 4,8 2,565 g 500 ml - Thuốc thử Dinitro-salicylic acid (DNS): Hỗn hợp Nước cất 3,5-Dinitro-salicylic acid NaOH Hòa tan tất cả, sau ñó thêm: Na-Ktartarate Na-metabisufite Phenol (nóng chảy ở 500C) 1416 ml 10,6 g 19,8 g 306 g 8,3 g 7,6 ml 9