Tài liệu Khảo sát khả năng chịu ngập úng và phân hủy rơm của các chủng nấm trichiderma thu thập từ vĩnh long và cần thơ trong điều kiện phòng thí nghiệm

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG CHÂU THỊ THANH THÚY KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỊU NGẬP ÚNG VÀ PHÂN HỦY RƠM CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA THU THẬP TỪ VĨNH LONG VÀ CẦN THƠ TRONG ðIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Luận văn tốt nghiệp Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Cần Thơ, 2010 TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Ngành: Bảo Vệ Thực Vật ðề tài KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỊU NGẬP ÚNG VÀ PHÂN HỦY RƠM CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA THU THẬP TỪ VĨNH LONG VÀ CẦN THƠ TRONG ðIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Giáo viên hướng dẫn: ThS. Dương Minh KS. Phan Quốc Kiệt Sinh viên thực hiện: CHÂU THỊ THANH THÚY MSSV: 3064978 Lớp: Bảo Vệ Thực Vật K32 Cần Thơ, 2010 i TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Chứng nhận ñã chấp thuận luận văn với ñề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỊU NGẬP ÚNG VÀ PHÂN HỦY RƠM CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA THU THẬP TỪ VĨNH LONG VÀ CẦN THƠ TRONG ðIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM” Do sinh viên: CHÂU THỊ THANH THÚY thực hiện và ñề nạp. Kính trình hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp xem xét. Cần Thơ, ngày ….. tháng ..... năm 2010 Cán bộ hướng dẫn ThS. Dương Minh ii TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp ñã chấp thuận luận văn với ñề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỊU NGẬP ÚNG VÀ PHÂN HỦY RƠM CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA THU THẬP TỪ VĨNH LONG VÀ CẦN THƠ TRONG ðIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM” Do sinh viên: CHÂU THỊ THANH THÚY thực hiện và bảo vệ trước hội ñồng ngày…..tháng…..năm 2010. Luận văn ñã ñược hội ñồng chấp thuận và ñánh giá ở mức: …………………… Ý kiến hội ñồng: ………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………... ……………………………………………………………………………………….. Duyệt khoa Cần Thơ, ngày ….. tháng ….. năm 2010 Trưởng khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng Chủ tịch hội ñồng iii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì luận văn nào trước ñây. Tác giả luận văn (ký tên) Châu Thị Thanh Thúy iv LÝ LỊCH CÁ NHÂN Sinh viên: CHÂU THỊ THANH THÚY Sinh ngày 20 tháng 10 năm 1987. Tại xã Trung Ngãi, huyện Vũng Liêm, tỉnh Cửu Long. Con Ông: Châu Văn Vui. Sinh năm: 1961. Và Bà: Nguyễn Thị Chính. Sinh năm: 1964. ðã tốt nghiệp tại trường Trung học phổ thông cấp 2-3 Vũng Liêm, thị trấn Vũng Liêm, huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long. Vào Trường ðại học Cần Thơ năm 2006, theo học Ngành Bảo Vệ Thực Vật, khóa 32. Tốt nghiệp Kỹ sư Nông Nghiệp chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật năm 2010. v LỜI CẢM TẠ Kính dâng Ba Mẹ, những người suốt ñời tận tụy vì chúng con, xin cảm ơn những người thân ñã giúp ñỡ, ñộng viên con trong suốt thời gian qua. Thành thật biết ơn thầy Dương Minh, KS. Phan Quốc Kiệt ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian làm và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Chân thành cảm tạ thầy cố vấn học tập Lê Văn Vàng, cùng toàn thể quý thầy cô khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng vì những kiến thức mà quý thầy cô ñã truyền ñạt cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. ðây sẽ là hành trang vững chắc giúp tôi bước vào ñời. Gởi lời cảm ơn ñến các anh chị trong Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, cùng các bạn lớp Bảo Vệ Thực Vật 32 ñã ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài. Châu Thị Thanh Thúy vi Châu Thị Thanh Thúy, 2010. “Khảo sát khả năng chịu ngập úng và phân hủy rơm của các chủng nấm Trichoderma thu thập từ Vĩnh Long và Cần Thơ trong ñiều kiện phòng thí nghiệm”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường ðại Học Cần Thơ. TÓM LƯỢC ðề tài “Khảo sát khả năng chịu ngập úng và phân hủy rơm của các chủng nấm Trichoderma thu thập từ Vĩnh Long và Cần Thơ trong ñiều kiện phòng thí nghiệm” ñược thực hiện nhằm chọn ra các chủng Trichoderma có khả năng phân huỷ rơm nhanh trong ñiều kiện ngập úng. Thí nghiệm ñược thực hiện từ tháng 11 năm 2009 ñến tháng 04 năm 2010, tại phòng thí nghiệm Bệnh Cây, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường ðại Học Cần Thơ. Thí nghiệm ñược bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố, bốn lần lặp lại ñể ñánh giá khả năng phân huỷ rơm của 40 chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên. Mỗi lặp lại là một bình tam giác (250 ml) chứa 3 g rơm sấy khô + 200 ml nước cất, thanh trùng, sau ñó chủng Trichoderma (105 bào tử/ml) và ñặt ở hai ñiều kiện ñể yên và lắc (140 vòng/phút) trong 16 ngày ở nhiệt ñộ phòng. Kết quả sau 16 ngày xử lý Trichoderma cho thấy: - Tất cả các chủng Trichoderma thí nghiệm ñều có khả năng phân huỷ rơm và chịu ñựng ñược ñiều kiện ngập úng. - Ở ñiều kiện ñể yên (yếm khí), 3 chủng Trichoderma có khả năng phân huỷ rơm hiệu quả cao là T-BM4i, T-TB2d và T-TO3b. Từ kết quả thí nghiệm, các chủng Trichoderma có triển vọng sẽ tiếp tục thử nghiệm trong thực tế ñể ñánh giá chính xác hơn khả năng phân huỷ rơm trong ñiều kiện ngập úng. Từ ñó, có thể chọn lọc ra những chủng Trichoderma có khả năng phân huỷ nhanh rơm rạ trong ñiều kiện ngập úng. vii MỤC LỤC Chấp nhận ñề tài của cán bộ hướng dẫn Chấp nhận ñề tài của hội ñồng Lời cam ñoan Lý lịch cá nhân Lời cảm tạ Tóm lược Mục lục Danh sách bảng Danh sách hình MỞ ðẦU CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Sự phân bố của Trichoderma 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng của Trichoderma 1.2.1 Ảnh hưởng của oxy và cacbonic 1.2.2 Ảnh hưởng của pH 1.2.3 Ảnh hưởng của ñiện thế oxy hóa – khử (Eh) 1.3 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên sự sinh trưởng và phát triển của Trichoderma 1.3.1 Nguồn cacbon (C) 1.3.2 Nguồn ñạm (N) 1.3.3 Tỉ số C/N 1.4 Khả năng phân hủy chất hữu cơ của Trichoderma CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện 2.1.1 Thời gian và ñịa ñiểm thí nghiệm 2.1.2 Nguồn nấm 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 2.2 Phương pháp thí nghiệm CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ghi nhận tổng quát 3.2 Kết quả pH của các chủng Trichoderma 3.3 Kết quả ño ñiện thế oxy hóa - khử (Eh) của các chủng Trichoderma 3.4 Sinh khối của các chủng Trichoderma 3.5 Mật số bào tử tạo thành của các chủng Trichoderma 3.6 Khả năng phân huỷ rơm của các chủng Trichoderma 3.7 Thảo luận chung CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 ðề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ CHƯƠNG Trang i ii iii iv v vi vii viii ix 1 2 2 2 2 3 3 4 4 5 5 6 8 8 8 8 8 8 8 11 11 11 13 15 18 21 24 26 26 26 27 viii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Kết quả pH ñợt 1 (16 ngày) của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên Kết quả pH ñợt 2 (7 ngày) của các Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên Kết quả pH ñợt 3 (7 ngày) của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên Kết quả Eh (mV) ñợt 1 (16 ngày) sau khi chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên Kết quả Eh (mV) ñợt 2 (7 ngày) của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên Kết quả Eh (mV) ñợt 3 (7 ngày) của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên Sinh khối khô (g/l) của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc (140 vòng/phút) và ñể yên (ñợt 1) Sinh khối khô (g/l) của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc (140 vòng/phút) và ñể yên (ñợt 2) Sinh khối khô (g/l) của các chủng trong ñiều kiện lắc (140 vòng/phút) và ñể yên (ñợt 3) Mật số bào tử tạo thành (x 105 bào tử/ml) của các chủng Trichoderma ở 16 ngày sau khi chủng nấm trong ñiều kiện lắc và ñể yên (ñợt 1) Mật số bào tử tạo thành (x 105 bào tử/ml) của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên (ñợt 2) Mật số bào tử tạo thành (x 105 bào tử/ml) của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc và ñể yên (ñợt 3) Phần trăm (%) trọng lượng rơm giảm của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc (140 vòng/phút) và ñể yên (ñợt 1) Phần trăm (%) trọng lượng rơm giảm của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc (140 vòng/phút) và ñể yên (ñợt 2) Phần trăm (%) trọng lượng rơm giảm của các chủng Trichoderma trong ñiều kiện lắc (140 vòng/phút) và ñể yên (ñợt 3) 11 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 12 12 13 14 14 15 16 17 18 19 20 21 24 22 ix DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 3.1 Bình tam giác có chủng Trichoderma (a) T- TO3b và (b) ñối chứng sau 16 ngày bố trí thí nghiệm (BTTN) Bình tam giác có chủng Trichoderma: (a) T- TO3b, (b) TTTAG3b sau 16 ngày bố trí thí nghiệm (BTTN) Rơm bị phân hủy ở nghiệm thức ñược chủng Trichoderma: (a) T-TB2d, (b) T-TB4c sau 16 ngày bố trí thí nghiệm (BTTN) 25 3.2 3.3 25 25 1 MỞ ðẦU Sản xuất nông nghiệp bền vững ñang là hướng ñi của nhiều quốc gia trên thế giới. Với tiêu chí tạo ra sản phẩm sạch, an toàn và bảo vệ môi trường (trong ñó có bảo vệ nguồn nước và bảo tồn tài nguyên ñất). Việc khai thác, sử dụng chất hữu cơ là một giải pháp ñể bảo tồn tài nguyên ñất trong sản xuất nông nghiệp bền vững. Vì vậy, chất hữu cơ ñóng vai trò quan trọng ñược xem là thước ño chỉ thị cho sự bền vững trong sản xuất nông nghiệp và là yếu tố ảnh hưởng ñến ñộ phì nhiêu của ñất bởi vì nó ñiều hòa các tiến trình lý, hóa và sinh học trong ñất (Chong, 2005). ðồng bằng sông Cửu Long (ðBSCL) là vựa lúa lớn của cả nước. Tuy nhiên, việc sản xuất lúa 3 vụ/năm ñã gây ra những trở ngại ảnh hưởng ñến quá trình canh tác: thời gian cách vụ ngắn ñất không ñược cày ải, mầm bệnh dễ lưu tồn ... Ngoài ra, nông dân ðBSCL thường có thói quen cày vùi rơm rạ trong ñất. Việc cày vùi rơm rạ tươi vào ñất sẽ gây ra tình trạng cố ñịnh ñạm (N) và tăng lượng metan (CH4) phóng thích trong ñất gây hại cho cây trồng. ðặc biệt, các vi sinh vật trong ñất có thể sản sinh ra nhiều chất có tiềm năng gây ngộ ñộc cho rễ cây trồng; có thể làm chậm sự vươn dài của rễ, hạn chế sự hấp thu dưỡng chất và làm giảm sự phát triển thân lá (Võ Thị Gương, 2007). Ngày nay, Trichoderma ñược xem như là nhân tố trong phòng trừ sinh học. Trichoderma hiện diện khắp nơi trong ñất; trong quá trình sống chúng ñã sản sinh ra các chất kháng sinh, ñộc tố,… ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh trong ñất. ðặc biệt, Trichoderma còn có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ ñể cung cấp dưỡng chất cho ñất (Cook và Baker, 1989). Trước thực trạng sản xuất nông nghiệp hiện nay, việc tìm ra giải pháp phân hủy nhanh lượng rơm rạ trên ñồng ruộng góp phần hạn chế những ảnh hưởng bất lợi cho cây lúa cũng như trả lại cho ñất một lượng hữu cơ trên cơ sở tận dụng nguồn hữu cơ có sẵn có ý nghĩa rất quan trọng trong sản xuất lúa. Do ñó ñề tài “Khảo sát khả năng chịu ngập úng và phân hủy rơm của các chủng nấm Trichoderma thu thập từ Vĩnh Long và Cần Thơ trong ñiều kiện phòng thí nghiệm” ñược thực hiện nhằm chọn lọc ra những chủng nấm có khả năng phân hủy rơm nhanh, chịu ñựng ñược ñiều kiện ngập úng. 2 CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 SỰ PHÂN BỐ CỦA TRICHODERMA Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), Trichoderma thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), bộ nấm bông (Moniliales), họ Moniliaceae và chi Trichoderma. Bùi Xuân ðồng và ctv. (1982), xếp Trichoderma vào lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), nhóm Hyphomycetes, phân nhóm Euhyphomycetidae và thuộc chi Trichoderma. Trichoderma có mặt ở ñất canh tác nông nghiệp và tùy loài mà nó thích nghi với mọi ñiều kiện khí hậu. Trong ñất có thể tìm thấy Trichoderma ở tầng ñất hữu cơ hoặc tầng ñất mặt. ðặc trưng của Trichoderma là sống hoại sinh; ñồng thời nó cũng sống ký sinh trên nấm gây bệnh cho cây trồng (Cook và Baker, 1989). Gams và Bissett (1998) cho rằng Trichoderma là nấm phân bố khắp nơi, nó có trong ñất, gỗ mục… Các loài Trichoderma thường gặp phần lớn ở trong ñất có môi trường sống rất rộng, hầu hết nấm thường có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Cây trồng giảm khả năng bị bệnh khi có sự hiện diện của nhiều loài Trichoderma. 1.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ðẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TRICHODERMA 1.2.1 Ảnh hưởng của oxy và cacbonic O2 và CO2 cũng ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng và phát triển của Trichoderma. Mặc dù là những sinh vật hiếu khí nhưng Trichoderma spp. có khả năng tồn tại ở những nơi có hàm lượng oxy rất thấp. Nguồn oxy và hoạt ñộng của khuẩn ty là các yếu tố quan trọng trong việc ñiều tiết sự thành lập enzyme cellulase (Abrahao- Neto và ctv., 1995 trích từ Kubicek- Pranz, 1998). Thông thường, nhiều loài Trichoderma spp. bị ức chế bởi CO2, phụ thuộc vào mức pH, sự ức chế mạnh nhất ở môi trường trung tính và môi trường kiềm nhẹ (Danielson và Davey, 1973). Một số loài Trichoderma spp. có thể chịu ñựng sự tích lũy CO2 cao hơn những loài nấm khác. Schneider (1982) chứng minh rằng Trichoderma spp. có khả năng cố ñịnh CO2 bằng một ñặc tính phụ của chúng. Trái lại, Desgranges và Durand (1990) cho rằng ngay khi nồng ñộ CO2 dưới 2% cũng ức chế sự tạo khuẩn ty của Trichoderma viride. Sự chịu ñựng CO2 có thể do ñặc tính cá biệt của từng loài. 3 1.2.2 Ảnh hưởng của pH Theo Zaldívar và Velásquez (2001), pH có ảnh hưởng ñến sự phát triển và khả năng ký sinh lên nấm gây bệnh cũng như hiệu quả của Trichoderma trong việc phòng trừ sinh học bệnh cây. Nồng ñộ ion H+ có ảnh hưởng mạnh mẽ lên tốc ñộ phát triển của Trichoderma vì nhiều loại dinh dưỡng (như ñường, amino acid) ñược hấp thu cùng chiều với ion H+. Hầu hết, các loài Trichoderma có thể phát triển tốt trong môi trường pH từ 4,0 - 6,5 chỉ có một vài loài Trichoderma chịu ñựng ñược pH < 3,0 (Kubicek- Pranz và ctv., 1998). Trichoderma có thể phát triển và tiết enzyme tốt với khoảng pH môi trường khá rộng từ 2,0 - 6,0 nhưng tốt nhất là 4,0 (Kredics và ctv., 2003). Theo Dasgupta (1994), khoảng pH thích hợp cho quá trình sinh bào tử ít biến ñộng hơn so với sự phát triển, pH thích hợp cho sự hình thành bào tử cho hầu hết các loài Trichoderma từ 5,0 - 5,8 và tùy mức pH khác nhau mà nấm có thể tạo ra các dạng bào tử có cấu trúc khác nhau. Thêm vào ñó, Lejeune và ctv. (1995), khi nghiên cứu tác ñộng của pH lên sự hình thành bào tử cho rằng khoảng pH dao ñộng từ 2,2 - 7,6 không ảnh hưởng ñến sự hình thành bào tử của Trichoderma . ða số các chủng Trichoderma phát triển tối hảo ở pH = 4,6 - 6,8 do ñó giúp tăng sinh khối nên có ý nghĩa trong quá trình ñối kháng. Quá trình tiết enzyme của Trichoderma ñối với pH = 5,0 thích hợp cho việc tiết β-glucosidase, cellobiohydrolase và β-1,4-N-cetyl-glucosaminidase (NAGase), ở pH = 3,0 tiết βxylosidase, pH = 6,0 tiết trypsin và ở pH = 6,0 - 7,0 thích hợp cho việc tiết ra những enzyme phân hủy protein (Kredics và ctv., 2003). Theo Srinivas và Panda (1998), trong cùng một loài Trichoderma nhưng tùy theo chủng hoang dại hay ñột biến mà có khoảng pH thích hợp khác nhau, như Trichoderma reesei chủng QM 9414 thích hợp ở pH = 4,3 trong khi chủng M14 thích hợp ở pH = 5,7 ñể tiết enzyme endoglucanase. Trong môi trường pH chua, sự phân giải cellulose vẫn xảy ra. Tốc ñộ phân giải cũng rất nhanh ở pH < 5 và ñôi khi pH < 4 (Phạm Văn Kim, 2000). 1.2.3 Ảnh hưởng của ñiện thế oxy hóa khử (Eh) ðiện thế oxy hóa khử ñược biểu diễn bằng trị số ñiện thế (Eh), với ñơn vị ño là milivolt (mV). ðiện thế oxy hóa khử là chỉ tiêu ñánh giá tính thông khí và tình hình cung cấp dinh dưỡng trong ñất. Các chất dinh dưỡng như: NH4+, NO-3, PO43-, SO42-… ñược hình thành do tác ñộng của hệ vi sinh vật ñất trong những ñiều kiện cụ thể về pH, hoặc Eh nào ñấy (Trần Văn Chính, 2006). Các loại ñất khác nhau có Eh khác nhau, trong một phẫu diện Eh của các tầng khác nhau và thường giảm theo chiều sâu. Eh phù hợp với sản xuất nông nghiệp 4 biến ñộng trong phạm vi 200 - 700 mV (ñất lúa nước từ 200 - 300 mV). Eh quá cao chứng tỏ quá trình oxy hóa trong ñất xảy ra mạnh. Mùn tiêu hao nhanh và một số chất dinh dưỡng có thể bị cố ñịnh lại. Ngược lại, nếu Eh quá thấp nghĩa là quá trình khử diễn ra mạnh, sinh ra một số chất ñộc như H2S, CH4 … (Trần Văn Chính, 2006). Trong ñất có thể chứa nhiều hệ thống oxy hóa khử có nồng ñộ khác nhau nhưng Eh của ñất sẽ tương ứng với trị số Eh của hệ thống oxy hóa khử có nồng ñộ chất khử và chất oxy hóa cao nhất (Trần Văn Chính, 2006). Sự thay ñổi ñiện thế oxy hóa – khử (Eh): cùng với tiến trình khử của ñất, hàm lượng chất oxy hóa giảm, hàm lượng chất khử gia tăng, Eh do ñó giảm. Eh chỉ tình trạng oxy hóa hay tình trạng khử của ñất. Cây trồng cạn sẽ không phát triển bình thường trong ñiều kiện khử kéo dài. Cây lúa, ngược lại phát triển bình thường trong ñiều kiện ngập nước vì có một hệ thống chuyển vận oxy từ thân lá ñến rễ. Tuy nhiên, trong ñiều kiện khử mạnh, Eh thấp các chất khử như Mn 2+, Fe2+, H2S, CH4 có thể tích lũy cao ñến mức gây ñộc cho sự phát triển của lúa (Lê Văn Khoa, 2000). ðất yếm khí là ñất trong tình trạng thiếu oxy (hoặc không có oxy). ðất yếm khí thường tìm thấy ở ñất ngập nước (ñất trồng lúa nước) do oxy trong không khí không cung cấp kịp thời cho hoạt ñộng hô hấp của sinh vật vì tốc ñộ khuyếch tán trong nước của oxy chỉ bằng 1/10.000 lần so với trong không khí. Do vậy, 1 ñến 2 giờ sau khi ngập nước toàn bộ oxy ñều bị vi sinh vật sử dụng hết. Vi sinh vật yếm khí bắt ñầu hoạt ñộng trong môi trường không có oxy, các vi sinh vật sử dụng các chất oxy hóa (NO-3, Fe3+, SO42-, CO2) như chất nhận ñiện tử vì ñiện tử thải ra trong tiến trình hô hấp. Vì là nhận ñiện tử nên xảy ra phản ứng khử hóa (Trần Kim Tính, 2003). Trichoderma là loài phân bố rộng trong ñất. Vì vậy, biến ñộng của Eh cũng ảnh hưởng ít nhiều ñến sự sinh trưởng và phát triển của chúng. 1.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN DINH DƯỠNG LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TRICHODERMA 1.3.1 Nguồn cacbon (C) Nguồn cacbon có ảnh hưởng quyết ñịnh ñến sự hình thành bào tử nấm. Sự hình thành này bị giảm hoặc ngưng lại khi có sự gia tăng nguồn cacbon trong môi trường tuy nhiên sự tăng trưởng về sinh dưỡng vẫn xảy ra. Hiện tượng này xảy ra ở một số nấm thuộc lớp Phycomycetes, Ascomycetes và Deuteromycetes. Cơ chế của hiện tượng này chưa ñược biết rõ có thể là do sự tăng trưởng sinh dưỡng dẫn ñến tích lũy nhiều ñộc chất trong quá trình trao ñổi chất gây ảnh hưởng bất lợi cho sự gia tăng sinh khối. Sự hình thành bào tử bị ngưng lại khi nấm ở trong môi trường kín là do có sự tích luỹ của khí CO2. 5 Nói chung, ở ñường oligo- và ñường poly-saccharide thì sự hình thành bào tử tốt hơn nhưng sự phát triển sinh dưỡng kém hơn ở ñường ñơn. ðiều này ñược giải thích là phần lớn nấm có thể tổng hợp ñược nhiều loại oligo- và polysaccharide khác nhau khi nuôi trên môi trường carbohydrate phức hợp. Các oligosaccharide sẽ ñược thuỷ phân dần ñể cung cấp nguồn dưỡng chất ổn ñịnh cho nấm giúp cho sự hình thành bào tử ñược tốt hơn (Bilgrami và Verma, 1978). 1.3.2 Nguồn ñạm (N) Nguồn ñạm cung cấp cho nấm dưới dạng nitrate, ammonium và các nguồn ñạm hữu cơ mà ñặc biệt là các amino acid. Nồng ñộ ñạm hòa tan cần thiết cho sự sinh trưởng và hình thành bào tử nấm là giống nhau, nồng ñộ ñạm cao thường gây hại cho sự tái sản xuất. Khoảng biến ñộng về nồng ñộ thích hợp cho sự hình thành bào tử thường hẹp so với nguồn cacbon (Bilgrami và Verma, 1978). Muối ammonium là nguồn cung cấp phần lớn lượng ñạm hữu dụng cho Trichoderma (Papavizas, 1985). Nếu cung cấp thêm ñạm vô cơ (và cả hữu cơ) sẽ thúc ñẩy quá trình phân giải cellulose (nguồn cung cấp cacbon) nhanh hơn, ñó là nhờ thay ñổi tỷ lệ C/N. Tuy nhiên, hàm lượng ñạm quá cao sẽ làm chậm tốc ñộ phân giải (Phạm Văn Kim, 2000). Theo Ngô Thị Mỹ Hiền (2002), sau 9 tuần xử lý nấm Trichoderma với hai chủng nấm T-OM1 và T-OM2 ở nghiệm thức có NH4 NO3 thì phần trăm trọng lượng rơm giảm cao hơn các nghiệm thức khác. Chứng tỏ, khi bổ sung thêm dạng ñạm hữu dụng trực tiếp vào môi trường ñã làm gia tăng khả năng phân hủy rơm của Trichoderma. 1.3.3 Tỉ số C/N Trong ñiều kiện phòng thí nghiệm sự hình thành bào tử nấm sẽ tăng lên khi tỷ số C/N thấp và quá trình này có thể giảm hoặc ngưng lại khi có sự gia tăng nguồn carbohydrate trong môi trường mặc dù sự sinh dưỡng vẫn tiếp tục diễn ra (Bilgrami và Verma, 1978). Khả năng phân hủy cellulose của nấm sẽ tăng lên cùng với sự tăng lên của nguồn ñạm (Domsch và Gams, 1980). Những nguồn ñạm hữu cơ như là peptone thường ñược ñưa vào môi trường ñể làm gia tăng nhanh sự phát của nấm trên những chất có phân tử cao như cellulose (Mandels và Andreotti, 1978). Nấm Curvularia pallescens sẽ hình thành bào tử tối ña khi tỷ số C/N là 6/1, nấm Colletotrichum gloeosporioides là 1/1 ñến 2/1; C. capsici là 4/1; Fusarium coreuleum là 8/1; Curvularia penniseti là 16/1 (Bilgrami và Verma, 1978). Riêng Trichoderma thì tỷ lệ C/N thích hợp cho sự phát triển và hình thành bào tử là 30:1 (Phillips và ctv., 2005). 6 1.4 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHẤT HỮU CƠ CỦA TRICHODERMA Theo Nguyễn ðức Lượng và Nguyễn Hữu Phước (1996), thực vật chứa hàm lương cellulose rất lớn khoảng 60 - 70%. Trong ñó, thành phần cellulose trong rơm rạ là 35 - 36% nên rất khó phân huỷ trong ñiều kiện thường hay thời gian ngắn (Bùi Huy ðáp, 1980). Cellulose là một trong những thành phần cấu tạo nên vách tế bào thực vật và ñược xen lẫn với các thành phần khác như: hemicellulose, pectin và lignin. Vách tế bào thực ñược cấu tạo bởi hai lớp, từ ngoài vào trong có lớp thứ nhất gồm: pectin, cellulose và hemicellulose; lớp thứ hai chứa cellulose, hemicellulose và lignin. Khoảng cách giữa hai tế bào là lớp pectin. Với cấu tạo kiên cố như vậy cellulose rất khó ñược phân giải bởi các phản ứng hóa học và sinh hóa (Phạm Văn Kim, 2000). Các loài Trichoderma thường ñược quan tâm nghiên cứu vì chúng giữ vai trò phân hủy cellulose của rơm rạ còn lại sau mùa vụ, sau ñó chuyển hóa chúng thành ñường. ðồng thời có khả năng kí sinh và tiêu diệt một số loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Những ñường do sự phân hủy rơm rạ ñược tạo ra, trở thành dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn yếm khí cố ñịnh ñạm Clostridium butyrium. Sự phát triển C.butyrium làm gia tăng hàm lượng ñạm trong ñất. Hàm lượng ñạm này sẽ ñược tái cung cấp cho Trichoderma phát triển mạnh lên và tiếp tục thúc ñẩy sự phân hủy cellulose ñể cuối cùng cung cấp chất ñạm cho cây trồng (Lynch và Harper, 1985). Trichoderma là nấm hoại sinh (Kredics và ctv., 2003). Trichoderma có tác ñộng trực tiếp lên sự phát triển cây trồng do hoạt ñộng sống của nấm sản sinh ra enzyme phân hủy glucose, cellulose. Nhờ các enzyme này mà chất hữu cơ trong ñất ñược phân hủy nhanh hơn, tăng chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thu cho cây trồng, tạo ñiều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt (Nguyễn Văn Tuất và Lê Văn Thuyết, 2000). Theo Gayal và Khandeparkar (1998), thì Trichoderma reesei, Trichoderma lignorum và Trichoderma koningi tiết ra khá nhiều enzyme cellulase phân hủy hoàn toàn tế bào chứa cellulose. Theo kết quả thí nghiệm của Dương Minh và ctv. (2003), cho thấy sau 9 tuần xử lý 7 loại dư thừa thực vật như: lục bình, thân ñậu nành, thân và lá bắp, thân chuối, rơm, vỏ trấu, bằng Trichoderma spp. thì các dư thừa thực vật ñều bị phân hủy cao tới 25,9%. Theo Nguyễn Văn Bạc (2002), trong 7 loại dư thừa thực vật gồm: thân bắp, cỏ lông tây, rơm, lục bình, thân chuối, thân ñậu nành và vỏ trấu thì Trichoderma spp. phân hủy tốt nhất là thân bắp với phần trăm giảm trọng lượng là 20,6%. Sự phân hủy ñược sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: thân bắp, cỏ lông tây, rơm, thân ñậu nành, lục bình, thân chuối và vỏ trấu. 7 Kết quả thí nghiệm của Nguyễn Minh Hùng và Phan Quốc Kiệt (2009) cho thấy sau 14 ngày bố trí thí nghiệm 42 chủng Trichoderma ñều có khả năng phân hủy cellulose trong ñiều kiện bán yếm khí. Trong ñó, chủng T-LM 1h là chủng có triển vọng nhất trong việc sử dụng ñể phân huỷ cellulose ở ñiều kiện ngập úng do vừa có sinh khối và mật số tạo thành cao lại vừa có khả năng phân huỷ cellulose cao. Theo số liệu thu thập từ thực nghiệm của Parmider, Arneja và Joginder (1997, trích dẫn từ Ngô Thị Mỹ Hiền, 2002), dung dịch ñược trích trực tiếp từ T. reesei hay còn gọi là enzyme thủy phân cellulose thô ñã phân hủy ñược 54,3% rơm cao nhất ở pH = 5 và nhiệt ñộ là 50oC trong ñó rơm ñã ñược xử lý bằng NaOH 4% (khối lượng/thể tích) rồi trung hòa bằng HCl 1N, rửa sạch và sấy khô ở 60oC trước khi ñem thủy phân. Tuy nhiên, trong quá trình nghiên cứu của Lynch và Harper (1985) về sự cố ñịnh ñạm do vi khuẩn C.butyricum và phân hủy cellulose bởi Trichoderma harzianum cho thấy hàm lượng cellulose và hemicellulose trong xác bã thực vật rất cao, làm cho tỷ lệ C/N cao, ñiều này sẽ làm cho sự phân hủy xác bã thực vật chậm lại bởi sự giới hạn của hàm lượng ñạm. 8 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHƯƠNG TIỆN 2.1.1 Thời gian và ñịa ñiểm thí nghiệm - Thời gian thí nghiệm: Từ tháng 10/2009 ñến 04/2010. - ðịa ñiểm: Phòng thí nghiệm Bệnh Cây, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường ðại Học Cần Thơ. 2.1.2 Nguồn nấm Các chủng Trichoderma thu thập từ các huyện Bình Minh, Tam Bình và Trà Ôn, Vĩnh Long và quận Ô Môn, Cần Thơ, ñược tồn trữ tại Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, ðại Học Cần Thơ. 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm - Nồi thanh trùng ướt (autoclave) (hiệu Sibata, model KL300). - Tủ cấy hiệu Dalton, model FAP1300AN. - Máy ño pH hiệu Oakton (do Eutech instruments sản xuất). - Máy ño Eh hiệu Jenco, mode No. 6173 pH. - Cân ñiện tử (hiệu Shimadzu, model UX620H). - ðĩa petri (ñường kính ñáy 9,5 cm, nắp 10 cm). - Bình tam giác (erlen meyer) loại 250 ml. - Lamme ñếm hồng cầu (haemocytometer) hiệu Malassez. - Các vật dụng cần thiết khác. 2.1.4 Môi trường nuôi cấy Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) (Shurfleff và Averre III, 1997). Khoai tây ðường Dextrose Agar Nước cất (vừa ñủ) pH 200g 20g 20g 1.000 ml 6,5 – 6,8 2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
Mục ñích thí nghiệm Chọn lọc các chủng Trichoderma có khả năng phân hủy rơm nhanh và chịu ñựng ñược ñiều kiện ngập úng.
Chuẩn bị rơm Rơm lúa sau khi thu hoạch, cắt lấy một ñoạn khoảng 15cm ñến 20 cm; ñem mẫu rơm ñi phơi và sấy khô ở 800C trong 10 giờ. Cân trọng lượng rơm trước và sau 9 khi sấy ñể tính ẩm ñộ của rơm. Sau khi tính ẩm ñộ, tiến hành cân 3g rơm khô cho một bình tam giác.
Chuẩn bị nguồn nấm Các chủng Trichoderma ñược nuôi trên môi trường PDA (pH = 6,5) khoảng 7 ngày trước khi bố trí thí nghiệm. Gồm 40 chủng Trichoderma sau: - Huyện Bình Minh - Vĩnh Long (9 chủng): T-BM1a, T-BM2a, T-BM4a, T-BM1b, T-BM5b, T-BM6b, T-BM6e, T-BM8e và T-BM4i. - Huyện Tam Bình - Vĩnh Long (13 chủng): T-TB1a, T-TB2a, T-TB3a, T-TB4a, TTB5a, T-TB1b, T-TB2b, T-TB1c, T-TB4c, T-TB2d, T-TB5e, T-TB4f và T-TB5f. - Huyện Trà Ôn - Vĩnh Long (7 chủng): T-TO3a, T-TO3b, T-TO1c, T-TO1d, TTO3d, T-TO1g và T-TO3g. - Quận Ô Môn - Cần Thơ (9 chủng): T-OM1a, T-OM2a, T-OM3a, T-OM4a, TOM2b, T-OM2c, T-OM3c, T-OM6 và T-OM7. - Huyện Long Mỹ - Hậu Giang (1chủng): T-LM1h (có triển vọng theo Nguyễn Minh Hùng và Phan Quốc Kiệt, 2009) - Huyện Tri Tôn – An Giang (1chủng): T-TTAG3b (có triển vọng theo Dương Phạm Minh Châu, 2008).
Bố trí thí nghiệm (BTTN) Thí nghiệm ñược bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm hai nhân tố: - Nhân tố A: Môi trường ñược chủng các chủng Trichoderma (trong ñó hai chủng T- LM1h và T-TTAG3b ñược chọn làm ñối chứng do có khả năng phân hủy rơm cao và chịu ñựng ñược ñiều kiện ngập úng ñã ñược khảo sát trước ñó). - Nhân tố B: ðiều kiện ñể yên hoặc lắc 140 vòng/phút (rpm) Các nghiệm thức ñược bố trí với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một bình tam giác (250 ml) chứa 3 g rơm sấy khô + 200 ml nước cất thanh trùng. Thí nghiệm ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm của Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường ðại Học Cần Thơ. Rơm ñược quấn thành vòng, sau ñó ñược cột bằng dây gân và buộc bùloong inox ñể tạo ñiều kiện ngập cho rơm sau này; ngâm rơm trong nước khoảng 2 phút, vớt ra ñể ráo nước rồi cho rơm vào bình tam giác 250 ml; ñem thanh trùng ở 121 oC trong 20 phút. Trong tủ cấy, cho 200 ml nước cất thanh trùng vào các bình tam giác và chủng Trichoderma vào với mật số 105 bào tử/ml.