Tài liệu Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm và phổ xâm nhiễm của thực khuẩn thể phổ rộng đối với các chủng e. coli đã phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ THANH ĐIỀN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH XÂM NHIỄM VÀ PHỔ XÂM NHIỄM CỦA THỰC KHUẨN THỂ PHỔ RỘNG ĐỐI VỚI CÁC CHỦNG E. COLI ĐÃ PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ Tp.Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP.HCM. Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: TS. HOÀNG ANH HOÀNG Cán bộ chấm xét 1: PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG Cán bộ chấm xét 2: TS. NGUYỄN TẤN TRUNG Luận văn Thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP.Hồ Chí Minh ngày 08 tháng 08 năm 2015. Thành phần hội đồng đánh giá luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn Thạc sĩ) 1. Chủ tịch: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG 2. Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 3. Phản biện 2: TS. NGUYỄN TẤN TRUNG 4. Ủy viên: TS. HOÀNG KIM ANH 5. Thƣ ký: PGS.TS. LÊ THỊ THỦY TIÊN Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trƣởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỜNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SỸ Họ tên học viên: LÊ THANH ĐIỀN MSHV: 13310295 Ngày, tháng, năm sinh: 22/08/1989 Nơi sinh: Bến Tre Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm và phổ xâm nhiễm của thực I. khuẩn thể phổ rộng đối với các chủng E. coli đã phân lập tại Việt Nam. II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 1. Làm r đƣợ hoạt tính xâm nhiễm ủ h i thự khuẩn thể phổ rộng IP008 và IP052 h i thực khuẩn thể đƣợc phân lập trong nghiên cứu của Tanji và cộng sự năm 2008). 2. Khảo sát phổ xâm nhiễm ủ h i thự khuẩn thể IP008 và IP052 tr n á hủng E. coli đã đƣợ phân lập tại Việt N m. III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/01/2015 IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 14/06/2015 V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. HOÀNG ANH HOÀNG TP.HCM, ngày 01 tháng 08 năm 2015 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) TS. Hoàng Anh Hoàng TRƯỞNG KHOA (Họ tên và chữ ký) LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tại Trƣờng Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP. Hồ Chí Minh, tôi đã đƣợc tạo điều kiện và nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ, chia sẻ. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn hân thành đến Thầy hƣớng dẫn của tôi là TS. Hoàng Anh Hoàng. Thầy là ngƣời đã theo sát hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Qúy Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Bách Khoa TP.HCM đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, kỹ năng, đặc biệt là PGS.TS. Nguyễn Thúy Hƣơng. Để có đầy đủ điều kiện về ơ sở vật chất, trang thiết bị để luận văn tiến hành thuận lợi, tôi xin cảm ơn TS. Huỳnh Ngọc Oanh, Cô Võ Thị Ly T o đã qu n tâm và tạo điều kiện. Đồng hành và chia sẻ khó khăn trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi xin cảm ơn đến á em Uy n Phƣơng, Đức Trung, Mạnh Dũng, Xuân Cƣờng, Minh Trí, anh chị và các bạn đồng học lớp Cao học Công nghệ Sinh học khóa 2013 nhất là bạn Bí h Phƣợng và Chị Kim Yến. Cuối cùng, Con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắ đến Mẹ và gia đình đã y u thƣơng Con. TP.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 L Th nh Điền TÓM TẮT Thực khuẩn thể (bacteriophage hoặc phage) là những virus chỉ xâm nhiễm vi khuẩn. Đề tài đã tiến hành khảo sát hoạt tính xâm nhiễm của hai thực khuẩn thể phổ rộng là IP052 và IP008 (phân lập tại Nhật Bản) trên đối tƣợng vi khuẩn E. coli K12 đồng thời khảo sát phổ xâm nhiễm của hai thực khuẩn thể này đối với các chủng E. coli đã đƣợc phân lập tại Việt N m. IP052 và IP008 đƣợ đánh giá ó hoạt tính xâm nhiễm cao qua các chỉ ti u đã đƣợc nghiên cứu là phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm thấp (21% IP052 và 43% IP008), chu kỳ xâm nhiễm ngắn (khoảng 30 phút đối với cả 2 thực khuẩn thể IP008 và IP052), giá trị OD600nm của dịch nuôi cấy E. coli giảm mạnh. Trong nội dung khảo sát phổ xâm nhiễm, đề tài đã sử dụng phƣơng pháp “Pl que Drop Ass y” để khảo sát phổ xâm nhiễm của IP052 và IP008 đối với 60 chủng E. coli đã phân lập tại Việt Nam và 11 chủng vi khuẩn khá thƣờng xuất hiện trong các mẫu môi trƣờng và thực phẩm. Kết quả đánh giá IP052 xâm nhiễm 14/60 chủng E. coli, IP008 xâm nhiễm 10/60 chủng E. coli, nếu sử dụng hỗn hợp cả hai thực khuẩn thể này thì sẽ xâm nhiễm 20/60 chủng (có 4 chủng E. coli bị xâm nhiễm bởi cả 2 thực khuẩn thể), đồng thời, cả hai thực khuẩn thể không xâm nhiễm bất kỳ chủng vi khuẩn nào trong 11 chủng vi khuẩn khác E. coli đƣợc khảo sát. Qua quá trình khảo sát, nghiên cứu có thể kết luận IP052 và IP008 là hai thực khuẩn thể có hoạt tính xâm nhiễm cao, phổ rộng ó tính đặc hiệu loài E. coli cao và có tiềm năng ứng dụng để phát triển phƣơng pháp phát hiện E. coli trong các mẫu môi trƣờng và thực phẩm nhƣ hỉ thị ô nhiễm phân. Từ khóa: Thực khuẩn thể phổ rộng, E. coli, hoạt tính xâm nhiễm, phổ xâm nhiễm. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin m đo n á số liệu đƣợc trình bày trong phần kết quả của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện, không sao chép của bất kỳ ngƣời nào khác. Lê Thanh Điền MỤC LỤC TRANG DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................ i DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................... iii DANH MỤC SƠ ĐỒ ............................................................................................. iii CHƢƠNG MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 1.1. Tình hình vệ sinh môi trƣờng và an toàn thực phẩm ................................... 3 1.2. Giới thiệu về Escherichia coli ...................................................................... 5 1.2.1. Đặ điểm hình thái, cấu tạo .................................................................... 5 1.2.2. Đặ điểm sinh hóa .................................................................................. 6 1.2.3. Phân loại ................................................................................................. 6 1.2.4. Giới hạn ô nhiễm E. coli trong một số thực phẩm ................................. 7 1.2.5. Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh điển hình trong phân .............. 10 a. Salmonella ............................................................................................... 10 b. Shigella .................................................................................................... 10 c. Vibrio ....................................................................................................... 11 d. Virus ........................................................................................................ 12 e. Ký sinh trùng ........................................................................................... 12 1.3. Giới thiệu về thực khuẩn thể ...................................................................... 13 1.3.1. Tổng quan về thực khuẩn thể ............................................................... 13 1.3.2. Phân loại ............................................................................................... 14 a. Phân loại dựa vào đặc tính hình thái và kiểu gen ................................... 14 b. Phân loại dựa vào khả năng gây độc ...................................................... 15 1.3.3. Sự sinh sản củ ph ge gây độc ............................................................. 15 1.3.4. Sự hình thành vòng tan ......................................................................... 17 1.3.5. Giới thiệu về thực khuẩn thể IP052 và IP008 ...................................... 17 1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................... 19 1.4.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc .................................................................. 19 1.4.2. Các nghiên cứu trong nƣớc .................................................................. 22 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 24 2.1. Vật liệu ........................................................................................................... 24 2.1.1. Hóa chất ................................................................................................ 24 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................. 24 2.1.3. Chủng vi sinh vật ................................................................................. 24 2.2. Phƣơng pháp nghi n ứu ................................................................................ 26 2.2.1. Sơ đồ tổng quát .................................................................................... 26 2.2.2. Giải thích quy trình .............................................................................. 27 2.2.3. Thiết kế thí nghiệm .............................................................................. 28 A. Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm của hai thực khuẩn thể IP052 và IP008 28 B. Khảo sát phổ xâm nhiễm của 2 thực khuẩn thể IP008 và IP052 đối với các chủng E. coli phân lập tại Việt Nam ............................................. 30 C. Khảo sát sự xâm nhiễm của 2 thực khuẩn thể IP008 và IP052 đối với các chủng vi khuẩn được xác định không phải E. coli ........................ 31 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................................... 33 3.1. Kết quả khảo sát hoạt tính xâm nhiễm của hai thực khuẩn thể IP052 và IP008 ..................................................................................................................... 33 3.1.1. Phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm ....................................... 33 3.1.2. Chu kỳ xâm nhiễm của thực khuẩn thể ................................................ 35 3.1.3. Giá trị OD600nm của dịch nuôi cấy E. coli sau quá trình xâm nhiễm của thực khuẩn thể ................................................................................. 38 3.2. Kết quả phổ xâm nhiễm của hai thực khuẩn thể IP052 và IP008 đối với E. coli và các chủng .............................................................................................. 41 3.3. Kết quả phổ xâm nhiễm của hai thực khuẩn thể IP052 và IP008 đối với một số vi khuẩn thƣờng xuất hiện trong môi trƣờng và thực khuẩn ........ 45 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 47 4.1. Kết luận ...................................................................................................... 47 4.2. Kiến nghị .................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 48 PHỤ LỤC .................................................................................................................. Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADP : Adenosine Diphosphate ATP : Adenosine Triphosphate BGA : Brilli nt Green Ag r Môi trƣờng BGA) BGBL : Brillant Green Lactose Bille Salt (Canh thang Lactose bổ sung mật bò) DNA : Deoxyribo Nucleic Acid ELISA : Enzyme Linked Imunosorbent Assay (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn Enzyme) EMB : Eosin Methylene Blue Môi trƣờng EMB) EPEC : Enteropanthogenic Escherichia coli ICTV : International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban Quốc tế về phân loại Virus) ISO : International Standards Organization (Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế) LB : Luri Bert ni Môi trƣờng LB) NĐTP : Ngộ độc thực phẩm PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi nhờ Polymerase) RNA : Ribo Nucleic Acid TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) T Thanh i n - 13310295 Trang i Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng DANH MỤC HÌNH ẢNH STT NỘI DUNG TRANG Hình 1.1 E. coli dưới kính hiển vi điện tử quét SEM 6 Hình 1.2 Cấu trúc cơ bản của thực khuẩn thể coli T4 14 Hình 1.3 Chu trình sinh tan của Phage gây độc 16 Hình 1.4 Sự hình thành vòng tan của phage khi xâm nhiễm vi khuẩn 18 Hình 1.5 Ảnh chụp TEM của thực khuẩn thể IP052 và IP008 19 Hình 2.1 Biến động nồng độ phage trong quá trình xâm nhiễm 32 Hình 3.1 Phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm E. coli K12 38 Hình 3.2 Biến động nồng độ thực khuẩn thể IP052 và IP008 40 Hình 3.3 Biến động giá trị OD600 dịch nuôi cấy E. coli và thực khuẩn thể 42 Hình 3.4 Vòng sinh tan của IP052 đối với E. coli 47 Hình 3.5 Vòng sinh tan của IP008 đối với E. coli 47 T Thanh i n - 13310295 Trang ii Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng DANH MỤC BẢNG BIỂU STT NỘI DUNG TRANG Bảng 1.1 Giới hạn ô nhiễm E. coli trong một số loại thực phẩm 9 Bảng 1.2 Phân loại thực khuẩn thể theo ICTV 15 Bảng 1.3 Kích thước thực khuẩn thể IP052 và IP008 20 Bảng 2.1 Danh sách các chủng vi sinh vật dành cho đ tài 27 Bảng 3.1 Nồng độ ban đầu của E. coli K12, IP052 và IP008 36 Bảng 3.2 Nồng độ IP052, IP008 không xâm nhiễm E. coli K12 37 Bảng 3.3 Tóm tắt kết luận v hoạt tính xâm nhiễm của IP052 và IP008 43 Bảng 3.4 Kết quả phổ xâm nhiễm của IP052 và IP008 45 Sự xâm nhiễm của IP052 và IP008 đối với các chủng vi 49 Bảng 3.5 khuẩn không phải E. coli DANH MỤC SƠ ĐỒ STT Sơ đồ 2.1 T NỘI DUNG Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu Thanh i n - 13310295 TRANG 28 Trang iii Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng CHƯƠNG MỞ ĐẦU T Thanh i n - 13310295 Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng MỞ ĐẦU Escherichia coli thƣờng đƣợ sử dụng là vi sinh vật hỉ thị ho sự nhiễm phân trong á mẫu môi trƣờng, thự phẩm vì từ sự nhiễm Escherichia coli, húng t ó thể nghi ngờ sự nhiễm ủ á vi sinh vật gây bệnh khá từ phân, từ đó hiện hữu nguy ơ ảnh hƣởng ti u ự tới sứ khỏe on ngƣời khi tiếp xú hoặ ăn á mẫu bị nhiễm đó. Vì vậy, kiểm tr ó h y không sự hiện diện ủ E. coli trong mẫu thự phẩm, nƣớ là một điều kiện ti n quyết trong á quy trình kiểm tr , kiểm soát vệ sinh n toàn thự phẩm nói hung [1] [2] [3]. Tình hình n toàn vệ sinh thự phẩm tr n thế giới và Việt N m vẫn đ ng diễn r hết sứ phứ tạp, đ i hỏi á nhà sản xuất, ung ứng nguồn thự phẩm phải đảm bảo hất lƣợng ủ sản phẩm trƣớ khi đƣ đến ngƣời ti u d ng vì những sản phẩm thự phẩm khi ô nhiễm vi sinh, đặ biệt là bị nhiễm phân ó trạng thái, m i vị không khá sản phẩm bình thƣờng và ngƣời ti u d ng thƣờng không phân biệt đƣợ . Đồng thời khi ó trƣờng hợp ngộ độ thự phẩm xảy r , y u ầu phải ó những phƣơng pháp xá định nguy n nhân nh nh hóng, hính xá , hiệu quả để đƣ r những phá đồ điều trị hợp lý, tránh á biến hứng và hậu quả không mong muốn đến với nạn nhân. Hiện n y, phƣơng pháp xá định sự hiện diện ủ vi khuẩn E. coli thƣờng đƣợ sử dụng là nuôi ấy vi sinh và thử nghiệm sinh hó . Cá mẫu sau khi thu về sẽ đƣợ xử lý sơ bộ s u đó nuôi ấy tăng sinh họn lọ trong môi trƣờng BGBL để ứ hế á vi khuẩn Gr m dƣơng, kí h thí h sự phát triển ủ vi khuẩn Gr m âm. S u gi i đoạn tăng sinh họn lọ , vi khuẩn sẽ đƣợ trƣng EMB để lự ấy l n môi trƣờng họn lọ đặ họn những khuẩn lạ tr n đều, màu đỏ tí ó ánh kim. Cá khuẩn lạ này sẽ đƣợ tiến hành thử nghiệm IMViC để xá định ó phải là E. coli hay không [4]. Mặ d đem lại tính hính xá o, hi phí hợp lý nhƣng phƣơng pháp này lại mất quá nhiều thời gi n 5 - 7 ngày), ông sứ và nhân lự thự hiện. Với sự phát triển ủ á phƣơng pháp sinh họ phân tử, việ phát hiện E. coli đã đƣợ rút ngắn thời gi n xuống khoảng 30 - 48h, một số nghi n ứu ải tiến T Thanh i n – 13310295 Trang 1 Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng gần đây ó thể phát hiện trong 24 - 30h [5 . Tuy nhi n, những phƣơng pháp này lại tốn k m hi phí và phụ thuộ rất nhiều vào kỹ năng ủ ngƣời thự hiện. Vì lý do đó, để đáp ứng nhu ầu thự tế đặt r và ph hợp với điều kiện, khả năng hiện tại, việ phát triển một phƣơng pháp phát hiện E. coli nh nh hóng, đơn giản, rẻ tiền là rất ần thiết. Phƣơng pháp phát hiện á hủng E. coli độ tố nhờ thự khuẩn thể đƣợ nghi n ứu và ứng dụng tr n thế giới. Tuy nhiên, vấn đề đặt r là á thự khuẩn thể đ số ó phổ xâm nhiễm hẹp, trong khi đó vi khuẩn E. coli lại tồn tại rất đ dạng trong môi trƣờng làm ho việ ứng dụng phƣơng pháp này để phát hiện E. coli nhƣ hỉ thị nhiễm phân ó phần hạn hế. Vì thế, nghi n ứu ứng dụng á thự khuẩn thể phổ rộng để phát hiện E. coli sẽ khắ phụ đƣợ á nhƣợ điểm n u tr n. Năm 2008, T nji và ộng sự tại Viện Công nghệ Tokyo Nhật Bản) đã phân lập đƣợ h i thự khuẩn thể (IP052 và IP008) ó phổ xâm nhiễm rộng đối với á hủng E. coli đƣợ phân lập tại Nhật Bản [6]. Để phát triển á phƣơng pháp phát hiện E. coli trong mẫu môi trƣờng và thự phẩm tại Việt N m dự vào h i thự khuẩn thể phổ rộng này, trƣớ ti n phổ xâm nhiễm ủ với á húng ần đƣợ kiểm tr đối hủng E. coli đƣợ phân lập tại Việt N m. Vì những lý do tr n, húng tôi tiến hành nghi n ứu đề tài: với mụ ti u giải quyết đƣợ h i vấn đề s u đây:  Làm r đƣợ hoạt tính xâm nhiễm ủ h i thự khuẩn thể phổ rộng IP008 và IP052 h i thực khuẩn thể đƣợc phân lập trong nghiên cứu củ T nji và s năm 2008 đã n u tr n).  Khảo sát đƣợc phổ xâm nhiễm ủ h i hủng thự khuẩn thể IP008 và IP052 tr n á hủng E. coli đã đƣợ phân lập tại Việt Nam và các chủng vi khuẩn khác E. coli. T Thanh i n – 13310295 Trang 2 Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU T Thanh i n – 13310295 Luận văn Thạc sỹ 1.1. GVHD: TS. oàng nh oàng TÌNH HÌNH VỆ SINH MÔI TRƯỜNG VÀ AN TOÀN THỰC PHẦM Theo báo áo gần đây ủ Tổ hứ Y tế Thế giới WHO), hơn 1/3 dân số á nƣớ phát triển bị ảnh hƣởng ủ á bệnh do thự phẩm gây r mỗi năm. Đối với á nƣớ đ ng phát triển, tình trạng lại àng trầm trọng hơn nhiều, hàng năm gây tử vong hơn 2,2 triệu ngƣời, trong đó hầu hết là trẻ em. Tại Nhật Bản, vụ ngộ độ thự phẩm NĐTP) do sữ tƣơi giảm b o bị ô nhiễm tụ ầu tr ng vàng tháng 7/2000 đã làm ho 14.000 ngƣời ở 6 tỉnh bị NĐTP. Xu hƣớng ngộ độ thự phẩm, bệnh truyền qu thự phẩm xẩy r ở quy mô rộng nhiều quố gi àng trở n n phổ biến, việ ph ng ngừ và xử lý vấn đề này àng ngày àng khó khăn với mỗi quố gi trở thành một thá h thứ lớn ủ toàn nhân loại. Tháng 9 năm 2006 tại Ho Kỳ, một vụ ngộ độ khiến hàng trăm ngƣời nhập viện vì nguy n nhân r u spin h nhiễm E. coli từ nguồn nƣớ tƣới ti u ủ nông trại. Cũng trong năm 2006, hính quyền thành phố W lkerton, Ont rio C n d đã kết luận nguồn nƣớ W lkerton đã bị nhiễm E. coli với nồng độ từ nhà máy nƣớ o hơn rất nhiều lần ho ph p. Năm 2009, kết quả x t nghiệm á mẫu nƣớ uống ông ộng tại Anh và xứ W les đã kết luận rằng mứ độ ô nhiễm bởi sự hiện diện vi khuẩn E. coli trong các nguồn ung ấp nƣớ sạ h đã tăng gấp 5 lần so với năm 2007. Theo báo áo ủ ơ qu n Bảo vệ môi trƣờng FBA, hỉ ó khoảng 53 điểm ung ấp nƣớ sạ h ho 190.000 ngƣời trong năm 2009. Vào năm 2010, số điểm ung ấp nƣớ sạ h đã tăng l n 264 điểm tuy nhi n vẫn n rất nhiều điểm ung ấp nƣớ bị ô nhiễm E. coli. Cũng trong báo áo này, ứ 27 mẫu nƣớ đƣợ lấy kiểm nghiệm từ 250.000 mẫu thì ó 1 mẫu bị ô nhiễm E. coli trong khi đó ti u huẩn ho nƣớ sạ h d ng để uống là không ó sự xuất hiện ủ vi khuẩn E. coli. Theo thống k , mỗi năm Việt N m ó hừng 250 - 500 vụ ngộ độ thự phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 tử vong. Nguyên nhân ngộ độ thự phẩm do vi sinh vật hiếm 33 – 49 , một t lệ rất o. Theo số liệu thống k đến năm 2012 ủa Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế, năm 2007 xảy ra nhiều nhất với tổng số 247 vụ với tổng số ca ngộ độc là 7.329, số nhập viện là 5.584, gây T Thanh i n - 13310295 Trang 3 Luận văn Thạc sỹ tử vong 55 GVHD: TS. oàng nh oàng . Năm 2008 giảm xuống còn 205 vụ nhƣng số ca ngộ độc, số nhập viện và số tử vong gi tăng lần lƣợt là 7.829, 6.526 và 62 ca, cao nhất trong cả giai đoạn. Nhà nƣớ đã phải hi rất nhiều tiền ho việ điều trị, x t nghiệm và điều tr tìm nguyên nhân [7]. Đối với á quố gi đ ng phát triển nhƣ Việt N m, tình hình ô nhiễm phân trong nƣớ uống diễn r rất phổ biến ở khu vự nông thôn và miền núi. Ô nhiễm thƣờng xảy r trong quá trình lấy nƣớ , vận huyển, lƣu trữ từ nguồn nƣớ đến á hộ gi đình. Năm 2011, Nguyễn Đăng Tuấn đã nghi n ứu tình hình ô nhiễm phân trong nƣớ uống tại á hộ gi đình v ng nông thôn, miền núi tỉnh Lào C i đã ho thấy khi khảo sát 200 mẫu nƣớ vào m khô, 200 mẫu nƣớ vào m mƣ , 67.25 mẫu nƣớ uống đã bị nhiễm vi khuẩn E. coli [8]. Sự tồn tại ủ vi khuẩn hỉ thị ô nhiễm phân là E. coli trong á mẫu nƣớ ho thấy nguy ơ ó khả năng tồn tại á vi khuẩn ó trong phân khá và ó khả năng gây bệnh, từ đó tiềm ẩn nguy ơ ảnh hƣởng đến đến sứ khỏe ngƣời sử dụng là rất lớn. Nói ri ng về tình hình ti u hảy tại Việt N m, 6 tháng đầu năm 2014 đã ó 301.570 trƣờng hợp mắ bệnh trong đó ó 3 trƣờng hợp tử vong. Tại TP. Hồ Chí Minh, ổ dịch tiêu chảy tại xã Lê Minh Xuân, huyện Bình Chánh, từ ngày 08/7/2014 đến ngày 23/7/2014 ghi nhận 09 trƣờng hợp mắ , trong đó ó 01 trƣờng hợp tử vong. Kết quả xét nghiệm 21 mẫu bệnh phẩm có 4 mẫu phân xét nghiệm dƣơng tính với E. coli. Ổ dịch tiêu chảy tại Ấp 5, xã Vĩnh Lộc A, huyện Bình Chánh, từ ngày 23/7/2014 đến ngày 27/7/2014 ghi nhận 05 trƣờng hợp tiêu chảy, trong đó ó 01 trƣờng hợp tử vong. Kết quả phân tích của Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh xá định các chủng E. coli tìm thấy thuộc nhóm Enteropanthogenic Escherichia coli (EPEC), một nhóm E. coli gây bệnh đƣờng ruột. Tại Việt N m, ngày 24/04/2011 tại Huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng N i, một nhà máy nƣớ đá bị phát hiện ph p đã gây r ngộ độ ó sản phẩm nhiễm E. coli o hơn nhiều lần ho ho hàng loạt trẻ em và ngƣời l o động tại khu vự B i Chu – Bắ Sơn. Ngày 21/06/2006, một vụ ngộ độ nghi m trọng xảy r tại ông ty T Thanh i n - 13310295 Trang 4 Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng TNHH D e Won Đà N ng do sử dụng nguồn thứ ăn bị nhiễm E. coli từ nƣớ giếng với nồng độ vƣợt 150 - 250 lần ho ph p. Gần đây nhất, tháng 4 năm 2015, Cụ n toàn thự phẩm Bộ Y tế đã đƣ r kết luận về việ 107 ông nhân thuộ Công ty TNHH St r F shion, Chƣơng Mỹ, Hà Nội bị ngộ độ thự phẩm. Nguy n nhân dẫn đến vụ ngộ độ đƣợ xá định là do món á trứng trong quá trình hế biến đã bị nhiễm vi khuẩn E. coli. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ ESCHERICHIA COLI 1.2.1. Đặ m hình thái, cấu t o Escherichia coli là loài trự khuẩn Gr m âm, sống hiếu khí t y tiện, kí h thƣớ trung bình 2 - 3µm x 0.5µm, h i đầu tròn, tế bào đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, có khả năng di động, không tạo bào tử, ó thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-40oC, nhiệt độ thí h hợp nhất là 37oC do Theodore Es heri h, một nhà kho họ ngƣời Áo phát hiện lần đầu ti n vào năm 1885 và đƣợ nghi n ứu một á h hi tiết từ năm 1886. Màng tế bào vi khuẩn E. coli hứ một nữ là protein, một nữ n lại là phospholipid, trong đó 70 - 80 là phosph tidyleth nol mine, 15 - 25 là phosphatidylglycerol [4]. Hình 1.1. E. coli dưới kính hiển vi điện tử quét SEM [9] T Thanh i n - 13310295 Trang 5 Luận văn Thạc sỹ GVHD: TS. oàng nh oàng Khuẩn lạ E. coli tr n, lồi, bóng, bề mặt nh n, bờ đều. S u 48 giờ nuôi ấy tr n đĩ thạ h khuẩn lạ sẽ huyển s ng màu xám, giữ đụ xám. Tr n môi trƣờng Endo, E. coli hình thành những khuẩn lạ màu đỏ, ánh kim. Tr n môi trƣờng DA (Desoxycholate Agar), E. coli cho khuẩn lạ màu đỏ, dẹt tròn, khô. Tr n môi trƣờng EMB (Eosine Methylene Blue), E. coli hình thành những khuẩn lạ màu tím đen, đỏ tí , thƣờng có ánh kim, bờ tr n đều [4]. 1 2 2 Đặ m sinh hóa E. coli l n men sinh hơi với nguồn carbon là Glucose, Galactose, Lactose, Mantose, Arabinose, Xylose, Ramnose, Manitol, Fructose, có thể lên men hoặc không lên men Saccharose, Rafinose, Esculin, Duncid, Glycerol, ít khi lên men Inulin, Pectin, Adunite, không lên men Dextrin, Amidon, Glycogen, Inositol, Cellobiose. Vi khuẩn thƣờng sinh Indol, không sinh Ure và H2S, có sinh Lysine decarboxylase, không sử dụng Citrate. Sự tăng trƣởng của E. coli bị ức chế bởi Clorine, các dẫn xuất của muối mật, Brinlliant green, Sodium deoxycholate, Sodium tetrathionate, selenite. Để phân biệt E. coli với các vi khuẩn đƣờng ruột khác 4 tính chất sinh hó thƣờng đƣợc dùng là Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrate (còn đƣợc gọi là thử nghiệm IMViC) [10]. 1.2.3. Phân lo i E. coli sống ộng sinh trong đại tràng ủ ngƣời và động vật, húng hiếm 80% vi khuẩn hiếu khí trong ruột và hầu hết không gây bệnh. Tuy nhi n, sự ó mặt ủ E. coli đồng thời với sự ó mặt ủ á vi khuẩn, virus gây bệnh ó nguồn gố từ phân khá . Th m vào đó, E. coli cùng các vi sinh vật gây bệnh ó thể đƣợ phát tán từ phân r ngoài môi trƣờng và tồn tại trong đất, nƣớ , á loại thự phẩm ơ bản nhƣ sữ , r u quả, thịt á hính là á nguồn lây nhiễm trự tiếp s ng on ngƣời. Vì thế E. coli là vi sinh vật hỉ thị ô nhiễm phân h y đƣợ d ng. Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E. coli đƣợc chia thành các type huyết thanh, với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau. Mỗi type huyết th nh đƣợc ký hiệu bằng kháng nguyên O, T Thanh i n - 13310295 Trang 6