Tài liệu Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây trinh nữ hoàng cung (crinum latufolium l. amryllidaceace) để sản xuất viên nang điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 BÁO CÁO TỔNG KẾT DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CẤP NHÀ NƯỚC HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L. Amaryllidaceace) ĐỂ SẢN XUẤT VIÊN NANG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT Mà SỐ: KC.10.DA17 Chủ nhiệm dự án: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM 6613 26/10/2007 TP.HCM, tháng 09 năm 2007 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 BÁO CÁO TỔNG KẾT DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CẤP NHÀ NƯỚC HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L. Amaryllidaceace) ĐỂ SẢN XUẤT VIÊN NANG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT Mà SỐ: KC.10.DA17 CHỦ NHIỆM DỰ ÁN: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM CƠ QUAN CHỦ TRÌ: CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC LIỆU TW2 CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THỜI GIAN: 1.2006 - 6.2007 TỔNG KINH PHÍ DỰ ÁN: 4.934,3 triệu đồng KINH PHÍ TỪ NGÂN SÁCH: 1.300 triệu đồng KINH PHÍ THU HỒI: 835 triệu đồng TP.HCM, tháng 09 năm 2007 MỤC LỤC PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ..... ................................................................................................ 7 PHẦN II: TỔNG QUAN.................................................................................................. 13 1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)….............................................................................................. 13 2. Tính cấp thiết và khả thi của dự án.. ........................................................................ 17 3. Mục tiêu dự án.. ....................................................................................................... 17 4. Nội dung dự án......................................................................................................... 18 PHẦN III: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. .................................. ..19 1. Nguyên liệu… .......................................................................................................... 19 2. Phương pháp nghiên cứu… ..................................................................................... 19 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…........................................................................... 22 1. Hoaøn thieän quy trình coâng ngheä chieát xuaát alcaloid töø döôïc lieäu laù Trinh nöõ hoaøng cung (tươi vaø khoâ) duøng laøm nguyeân lieäu saûn xuaát vieân nang Trinh nöõ hoaøng cung (Crila) ôû quy moâ công nghiệp... ......................................... 22 1.1. Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất alcaloid trong lá cây Trinh nữ hoàng cung.. ..... 23 1.1.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid toàn phần từ dược liệu khô TNHC........................................................................................................................... 23 1.1.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid toàn phần từ dược liệu tươi TNHC........................................................................................................................... 25 1.2. Máy móc thiết bị và quy trình công nghệ chiết xuất.. .......................................... 27 1.3. Vệ sinh vô trùng và an toàn lao động.. ................................................................. 30 1.4. Nội dung kiểm tra trong quá trình sản xuất. ......................................................... 30 1.5. Xử lý dư phẩm của quá trình chiết xuất................................................................ 30 1.6. Hồ sơ làm việc cần thiết........................................................................................ 30 2. Hoaøn thieän quy trình saûn xuaát vieân nang töø baùn thaønh phaåm cuûa Trinh nöõ hoaøng cung.. ........................................................................................... 31 2.1. Công thức viên nang Crila. ................................................................................... 31 2.2. Một số kết quả nghiên cứu về bào chế viên nang… ............................................. 32 2.2.1. Độ ẩm tới hạn và độ ẩm cân bằng của hạt. ........................................................ 32 2.2.2. Dải phân bố cỡ hạt. ............................................................................................ 34 2.2.3. Tính chảy của hạt.. ............................................................................................. 34 2.2.4. Tính phân tán trong nước................................................................................... 35 2.3. Khảo sát viên nang Crila....................................................................................... 36 1 2.4. Nghiên cứu theo dõi độ ổn định của sản phẩm..................................................... 37 2.5. Quy trình sản xuất viên nang CRILA.. ................................................................. 39 2.5.1. Cách tiến hành.................................................................................................. ..39 2.5.2. Máy móc thiết bị chủ yếu................................................................................... 39 2.5.3. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang Crila................................................... 40 2.5.4. Vệ sinh vô trùng và an toàn lao động.. .............................................................. 41 2.5.5. Nội dung kiểm tra trong quá trình sản xuất.. ..................................................... 41 2.5.6. Dư phẩm phế phẩm.. .......................................................................................... 42 2.6. Hồ sơ làm việc cần thiết........................................................................................ 42 3. Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm.. ................................................. 43 3.1. Nghiên cứu định tính và định lượng alcaloid crinamidin trong nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm bằng phương pháp HPLC… ..................................... 43 3.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở lá TNHC, cao khô TNHC và viên nang Crila........... 52 PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ ỨNG DỤNG CỦA DỰ ÁN.. ....................................................... 69 PHẦN VI: BÀN LUẬN.................................................................................................... 72 PHẦN VII: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.. ....................................................................... 73 PHẦN VIII: TÀI LIỆU THAM KHẢO.. ........................................................................... 75 PHẦN IX: CÁC PHỤ LỤC.. ............................................................................................ 79 2 KÝ HIỆU VÀ Ý NGHĨA CÁC CHỮ VIẾT TẮT TNHC Trinh Nữ Hoàng Cung Crinum latifolium L. HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid Chromatography SKLM: Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography S: Độ lệch chuẩn Standard Deviation RSD: Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard Deviation LOD: Giới hạn phát hiện Detection Limit LOQ: Giới hạn định lượng Quantitation Limit UV-VIS Tử ngoại – khả kiến Ultra Violet (Spectroscopy) IR: Hồng ngoại Infrared Spectroscopy NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân Proton nuclear Magnetic Resonance MS: Phổ khối lượng. Mass Spectroscopy 3 BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ VỀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA DỰ ÁN KH&CN CẤP NHÀ NƯỚC 1. Tên đề tài: Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây TNHC (Crinum latifolium L.) để sản xuất viên nang điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Mã số: KC.10.DA17 2. Thuộc chương trình Khoa Học Công Nghệ trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2001-2005. “Khoa học và công nghệ phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng” 3. Chủ nhiệm dự án: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM 4. Cơ quan chủ trì dự án: CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 5. Thời gian thực hiện: 18 tháng (từ tháng 1 năm 2006 đến tháng 6 năm 2007) 6. Tổng kinh phí thực hiện dự án: 4.934,3 triệu đồng Trong đó: kinh phí từ NSNN: 1.300 triệu đồng (bằng chữ: một ngàn ba trăm triệu đồng) Kinh phí thu hồi: 835 triệu đồng. 7. Tình hình thực hiện dự án so với hợp đồng. 7.1 .Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc. Hoàn thành 3 mục tiêu của dự án: - Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất alcaloid từ dược liệu TNHC ở quy mô công nghiệp. - Hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm của TNHC. - Nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm định lượng Crinamidin bằng phương pháp HPLC. Hoàn thành 5 nội dung của dự án: - Hoaøn thieän quy trình coâng ngheä chieát xuaát alcaloid töø döôïc lieäu laù TNHC (laù TNHC töôi vaø laù TNHC khoâ) duøng laøm nguyeân lieäu saûn xuaát vieân nang Trinh nöõ hoaøng cung (CRILA) ôû quy moâ công nghiệp. - Hoaøn thieän quy trình saûn xuaát vieân nang töø baùn thaønh phaåm cuûa TNHC. Nghiên cứu ổn định thuốc từ 24 tháng lên 36 tháng. - Naâng caáp tieâu chuaån kieåm nghieäm nguyeân lieäu, baùn thaønh phaåm vaø thaønh phaåm. Tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin – định lượng bằng phương pháp HPLC. - Xaây döïng tieâu chuaån cơ sở cuûa lá TNHC, cao khoâ TNHC, thuoác thaønh phaåm vaø thaåm ñònh laïi thuoác ñaõ xaây döïng. - Saûn xuaát 10.098.000 vieân thuoác Crila 4 7.2 .Về yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN. - - Sản phẩm của dự án là Viên nang Trinh nữ hoàng cung (CRILA) là một viên thuốc mới, đạt tiêu chuẩn cơ sở có tác dụng điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt, giá thành hợp lý, hiệu quả điều trị cao. Sản phẩm được chế tạo từ hai quy trình công nghệ về chiết xuất và bào chế đã được hoàn thiện và nâng cấp. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên thuốc mới bằng phương pháp HPLC. Tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin. 7.3 .Về tiến độ thực hiện. - Đảm bảo đúng tiến độ của đề cương và hợp đồng khoa học công nghệ số 11/2006/HĐ-DA, ngày 28/12/2006. - Nghiệm thu cấp cơ sở đúng quy định của Bộ Khoa học Công nghệ. 8. Về những đóng góp mới của đề tài: Dự án đã hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất các hoạt chất có hoạt tính sinh học có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u. Sản phẩm của dự án là viên nang CRILA được bào chế từ nguyên liệu chiết xuất từ dược thảo cây TNHC (Crinum latifolium L.). Hiện nay, đã có hai viên thuốc là viên nang mềm Tadenan được bào chế từ vỏ cây Mận Gai Châu Phi có tên khoa học là Pygeum africanum và Permixon từ quả cây Serenoa repens của Pháp sản xuất, và viên Crila là viên thuốc thứ ba sau hai viên thuốc trên được xếp vào kho tàng thuốc điều trị tuyến tiền liệt. Viên CRILA còn có khả năng chữa trị bệnh u xơ tử cung và cũng là viên thuốc đầu tiên chữa u xơ tử cung được sản xuất từ dược thảo. Cho đến nay chưa có một viên thuốc nào chữa u xơ tử cung được sản xuất từ nguồn gốc thiên nhiên. Viên CRILA ra đời sẽ cung cấp đủ thuốc phục vụ sức khỏe người bệnh trong nước và xuất khẩu. .Về giải pháp khoa học – công nghệ. Đã hoàn thiện một quy trình công nghệ, tạo được nguyên liệu để sản xuất thuốc điều trị các bệnh khối u từ dược thảo Việt Nam bằng những thiết bị máy móc sản xuất trong nước và được thiết kế theo yêu cầu của quy trình công nghệ cần tạo ra sản phẩm là các alcaloid có hoạt tính sinh học. .Về phương pháp nghiên cứu. Sử dụng các phương pháp nghiên cứu cổ điển và kết hợp với các phương pháp nghiên cứu hiện đại để hoàn thành nội dung của dự án: 5 - Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt. Các phương pháp hóa lý: Phổ hồng ngoại, khối phổ, cộng hưởng từ hạt nhân. Sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. Định lượng Crinamidin bằng phương pháp HPLC. .Những đóng góp mới khác. Trong quá trình nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết xuất chúng tôi đã có cải tiến dung môi chiết xuất nâng cao chất lượng sản phẩm so với giai đoạn nghiên cứu ở phòng thí nghiệm. Khi sử dụng dung môi chiết cồn/acid, nước/acid, trước đây chúng tôi sử dụng acid tartric nên sản phẩm thu được có mùi chua của acid tartric kết tinh trong cao. Để giải quyết vấn đề này trong quá trình hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất chúng tôi đã thay acid tartric bằng acid acetic. Sản phẩm thu được không còn mùi acid do acid acetic bốc hơi trong quá trình cô loại dung môi.Sản phẩm thu được đạt chất lượng tốt. Chúng tôi đã giải quyết được vấn đề giá thành sản phẩm hợp lý do hoàn thiện quy trình chiết xuất nguyên liệu từ lá tươi, khâu xử lý nguyên liệu tươi đúng theo quy trình kỹ thuật đã phá vỡ màng nguyên sinh của tế bào rồi chiết với dung môi thích hợp. Tiết kiệm chi phí điều trị bệnh so với sử dụng thuốc ngoại nhập để điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Tạo công ăn việc làm cho người lao động. Tạo sản phẩm thuốc đi từ nguồn dược liệu trong nước phục vụ sức khỏe cộng đồng. 6 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Beänh phì ñaïi laønh tính tuyeán tieàn lieät laø moät caên beänh phoå bieán trong vaø ngoaøi nöôùc. Thuoác ñieàu trò beänh phì ñaïi laønh tính tuyeán tieàn lieät laø gaùnh naëng ñoái vôùi beänh nhaân vaø gia ñình hoï, do chi phí ñieàu trò cao. Theo keát quaû nghieân cöùu hôn 30% nam giôùi ôû löùa tuoåi 40 trôû leân ñeàu maéc phaûi caên beänh naøy. Tình traïng söùc khoûe ngöôøi beänh giaûm suùt do phaûi ñi tieåu nhieàu laàn trong ñeâm, aûnh höôûng ñeán sinh hoaït vaø laøm vieäc. Do ñoù nhu caàu veà thuoác ñieàu trò beänh phì ñaïi laønh tính tuyeán tieàn lieät ngaøy caøng trôû neân caáp thieát. Để đáp ứng nhu cầu về thuốc chữa bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt, Công ty Cổ phần Dược Liệu TW2 đã được Bộ Y Tế cho phép thực hiện nghiên cứu hai đề tài sau: Đề tài 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung. Do TS.Nguyễn Thị Ngọc Trâm làm chủ nhiệm đề tài. Kết quả nghiệm thu đạt loại khá với các nội dung đã nghiên cứu sau: 1. Nghiên cứu trồng cây Trinh nữ hoàng cung làm nguyên liệu cho nghiên cứu và sản xuất. - Chọn được giống cây Trinh nữ hoàng cung đúng về mặt hình thái thực vật và có hiệu suất trồng cao. - Xác định được kỹ thuật trồng. - Sơ bộ đánh giá được ảnh hưởng của các yếu tố khí hậu, thổ nhưỡng lên năng suất thu hoạch. - Xác định được thời điểm thu hoạch lá cho năng suất cao. 2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu lá Trinh Nữ Hoàng Cung. - Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở hoàn chỉnh cho nguyên liệu Trinh Nữ Hoàng Cung. - Kiểm nghiệm nguyên liệu thu hoạch theo tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng. 3. Nghiên cứu sơ bộ thực vật, hóa học và chiết xuất. - Đã nghiên cứu, khảo sát về mặt hình thái thực vật, vi phẫu và soi bột lá Trinh Nữ Hoàng Cung để xác định tính xác thực khi xây dựng tiêu chuẩn và kiểm nghiệm nguyên liệu. - Xây dựng các phương pháp định tính, định lượng alcaloid toàn phần tính theo lycorine để phục vụ nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn, nghiên cứu chiết xuất và làm cơ sở để đánh giá hiệu suất quy trình chiết suất. - Chiết thăm dò dược liệu bằng các dung môi khác nhau: dung môi có tính phân cực yếu cloroform; dung môi không phân cực ether dầu hỏa; dung môi phân cực mạnh cồn/acid, nước acid, chiết xuất với các độ cồn 96o, 70o, 50o, thử tác dụng sinh học của dịch chiết từ đó chọn được phương pháp chiết xuất 7 và dung môi thích hợp cho nghiên cứu quy trình chiết: Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt, cồn 70o + 2% acid tartric, tỉ lệ dung môi dược liệu 9:1 - Xây dựng được quy trình chiết tối ưu cho hiệu suất xấp xỉ 100% tính theo alcaloid toàn phần. 4. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết. - Đã tiến hành chiết thử ở quy mô pilot: 5kg/mẻ để hoàn thiện quy trình đã xây dựng. Kết quả cho thấy quy trình khá ổn định, hiệu suất quy trình tính trên lượng alcaloid toàn phần có trong cao khô đạt trung bình: 73,12 ± 7,78%. - Tiêu chuẩn hóa được sản phẩm cao khô. 5. Khảo sát thăm dò dạng chế phẩm viên nang cứng. - Đã khảo sát thử công thức và quy trình sản xuất viên nang TNHC (Crila) từ cao khô TNHC là sản phẩm của quy trình chiết xuất với liều lượng 1 viên nang tương đương 1g dược liệu khô. 6. Dự kiến quy trình và thiết bị chiết xuất TNHC. - Trên cơ sở quy trình chiết xuất đã xây dựng được, chúng tôi đã dự kiến một quy trình và dây chuyền thiết bị thích hợp cho triển khai sản xuất ở quy mô lớn làm cơ sở cho việc chuẩn bị đầu tư sản xuất. 8 Sô ñoà 1: Sơ đồ tóm tắt quy trình coâng ngheä chieát xuaát alcaloid từ lá khô TNHC ở quy mô pilot. Boät laù TNHC Làm ẩm, ủ chiết Ngâm Baõ Ngấm kiệt Dịch chiết Cắn Để lắng Dịch lọc Cô cách thuỷ Cắn Để lắng Dịch lọc Cô cách thuỷ Cao lỏng 1:1 9 Cồn + 2% acid tartric Đề tài 2: “Nghiên cứu bào chế viên nang cứng từ cao khô alcaloid toàn phần của cây TNHC (Crinum latifolium L.) và thử tác dụng sinh dược học trong điều trị u xơ tuyến tiền liệt” do TS. Nguyễn Thị Ngọc Trâm làm chủ nhiệm đề tài. Theo quyết định số 2173/QD9-BYT, ngày 6/6/2002 của Bộ Y Tế. Kết quả nghiệm thu đạt loại khá với các nội dung nghiên cứu đã hoàn thành: 1. Nghiên cứu tác dụng dược lý của chế phẩm và thử độc tính. Công việc đầu tiên chúng tôi thực hiện được là thử độc tính cấp của cao khô (cao khô là nguyên liệu để sản xuất viên nang TNHC dùng cho thử nghiệm lâm sàng điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt tại Bệnh Viện Y Học Cổ Truyền Việt Nam): Xác định LD50 theo phương pháp Karber – Behrens, kết quả đã xác định được liều gây chết 50% súc vật thử nghiệm LD50 = 49,7g cao khô Trinh Nữ Hoàng Cung /kg thể trọng chuột. Để tăng thêm độ an toàn cho người bệnh, chúng tôi tiếp tục thử độc tính bất thường và kết quả tình trạng chuột sau khi uống thuốc và sau 48 giờ theo dõi khỏe mạnh, nhanh nhẹn, ăn bình thường. Độc tính bán trường diễn: Kết quả thử nghiệm khi cho thỏ uống liều 125mg/kg/ngày thời gian là 8 tuần không có biểu hiện nhiễm độc về mặt sinh hóa, huyết học và giải phẫu. Liều thứ hai là liều cao trên 1kg thể trọng là 1000mg/ngày. Với 2 liều thử nghiệm trên. Khi xét nghiệm các chỉ tiêu huyết học, sinh hóa, điện di protein huyết thanh, chỉ tiêu thể trạng thấy kết quả không làm thay đổi lớn các chỉ tiêu trên, điều đó chứng tỏ có thể sử dụng viên nang Trinh Nữ Hoàng Cung để điều trị u xơ tuyến tiền liệt với liều thử lâm sàng là 8 viên x 250 mg cao khô TNHC/ngày/người. Từ kết quả nghiên cứu độc tính và dược lý. Chúng tôi có thể nâng liều điều trị lên từ 10 – 12 viên/ngày/người. Nghiên cứu tác dụng dược lý của viên nang TNHC đối với u xơ tuyến tiền liệt bằng phương pháp dùng testosterone, kết quả viên nang Trinh nữ hoàng cung với liều 1,25g cao khô TNHC tương đương với 5 viên TNHC/kg, uống trong 7 ngày liên tục. Có tác dụng làm giảm u xơ tuyến tiền liệt. 2. Xây dựng công thức, quy trình sản xuất và tiêu chuẩn cơ sở của viên nang TNHC. Chúng tôi đã tìm được một công thức tối ưu với lượng hoạt chất có tác dụng sinh học ức chế sự phát triển và làm giảm khối u dùng để điều trị u xơ tuyến tiền liệt có kết quả. 3. Đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho viên nang TNHC. 4. Để có được những thông tin chính xác về điều kiện bảo quản thuốc và hạn dùng trong quá trình lưu hành trên thị trường. Chúng tôi đã nghiên cứu độ ổn định thuốc theo 2 phương pháp: Lão hóa cấp tốc để dự đoán tuổi thọ của thuốc, theo dõi bảo quản thuốc ở điều kiện tự nhiên. Kết quả nghiên cứu cho thấy viên nang TNHC có tuổi thọ là 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc và 24 tháng ở điều kiện tự nhiên nhiệt độ phòng 30o ± 5oC, độ ẩm tương đối 70 ± 5%. 10 5. Đánh giá kết quả lâm sàng: ở giai đoạn 1 và 2. - Giai đoạn 1: Với nhóm 10 người khỏe mạnh dùng thuốc, sau một đợt điều trị 10 ngày với liều 8 viên/ 1 ngày bệnh nhân ăn, ngủ tốt, mạch và huyết áp trong giới hạn bình thường. Các xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu trước và sau điều trị đều trong mức giới hạn bình thường và các chỉ số chức năng gan, thận trước và sau điều trị không có sự sai khác. Viên nang TNHC an toàn trong điều trị. - Giai đoạn 2: đã đánh giá được hiệu lực của thuốc trên lâm sàng, phạm vi dùng thuốc là 30 bệnh nhân với liều 8 viên / 1 ngày. Viên nang TNHC có tác dụng cải thiện mức độ rối loạn tiểu tiện trên bệnh nhân có u phì đại lành tính tuyến tiền liệt, trung bình giảm từ 93,3% xuống còn 33,3%. Viên nang TNHC có tác dụng làm giảm thể tích u phì đại lành tính tuyến tiền liệt, tỉ lệ bệnh nhân có kích thước giảm đạt 90% trong đó có 33,3% kích thước tuyến trở về bình thường sau 2 tháng điều trị. Viên nang TNHC không làm biến đổi các xét nghiệm sinh hóa máu (SGOT, SGPT, creatinin), huyết học (tổng phân tích máu và xét nghiệm nước tiểu). Viên nang TNHC không gây tác dụng phụ không mong muốn cho bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu sau 2 tháng điều trị. Vôùi quan ñieåm keá thöøa vaø phaùt huy y hoïc coå truyeàn, keát hôïp vôùi y hoïc hieän ñaïi coâng ty chuùng toâi ñaõ saûn xuaát vieân nang TNHC, coù teân thöông maïi CRILA, ñeå ñieàu trò caên beänh phì ñaïi laønh tính tuyeán tieàn lieät. Ñaây laø thuoác ñöôïc baøo cheá töø thaûo döôïc ít taùc duïng phuï, chöa töøng ñöôïc saûn xuaát trong nöôùc vaø treân theá giôùi. Vieân nang ñöôïc baøo cheá töø nguoàn döôïc lieäu saïch trong nöôùc vôùi ña soá caùc thieát bò do Vieät Nam saûn xuaát, neân giaù thaønh hôïp lyù. Trong khi caùc chi phí cho ñieàu trò noäi-ngoaïi khoa ñoøi hoûi quaù cao vaø giaù thuoác nhaäp ngoaïi laïi quaù ñaét, khoâng phuø hôïp vôùi ña soá ngöôøi beänh. Vieân nang CRILA ra ñôøi seõ ñaùp öùng ñöôïc nhu caàu cuûa thò tröôøng trong vaø ngoaøi nöôùc. Ngoaøi ra coøn giaûi quyeát coâng aên vieäc laøm cho ngöôøi lao ñoäng. Viên nang TNHC (CRILA) đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III theo quy chế 371 – Bộ Y Tế tại 3 bệnh viện: Bệnh Viện Y Học Cổ Truyền Trung Ương, Viện Lão Khoa TW, Bệnh viện Y Học Cổ Truyền TP.HCM, kết quả điều trị đạt 89,18% bệnh nhân khỏi bệnh và đã được Hội đồng Khoa Học Bộ Y Tế xác nhận. Ngày 21/7/2005 Cục Quản Lý Dược – Bộ Y Tế đã có quyết định số 135/QĐ-QLD cho phép viên nang TNHC (CRILA) được lưu hành rộng rãi trên toàn quốc với số đăng ký VNB – 3391- 05. Để tạo điều kiện cho sản phẩm viên nang TNHC (CRILA) được phát triển phục vụ tốt sức khỏe cộng đồng ngày 14/3/2005, Bộ Khoa Học và Công Nghệ đã ban hành Quyết định số 402/QĐ-BKHCN, phê duyệt cho Công ty chúng tôi được thực hiện 11 dự án sản xuất thử nghiệm KC.10.DA17: “Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) để sản xuất viên nang điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt”. 12 PHẦN II: TỔNG QUAN 1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ CÂY TNHC (Crinum latifolium L.) Töø naêm 1984 cho ñeán nay caùc coâng trình nghieân cöùu veà thaønh phaàn hoaù hoïc vaø taùc duïng döôïc lý cuûa Crinum latifolium cuõng ñaõ ñöôïc coâng boá treân caùc taïp chí trong vaø ngoaøi nöôùc. 1.1 Ngoài nước * Thaønh phaàn hoaù hoïc - Naêm 1984, Ghosal (AÁn Ñoä) ñaõ phaân laäp vaø xaùc ñònh töø caùn hoa Crinum latifolium moät glucoalcaloid coù teân latisolin. Thuûy phaân baèng enzym thu ñöôïc aglycon coù teân latisodin [23] - Ghosal vaø Shibnath coøn phaân laäp ñöôïc töø thaân haønh luùc caây ñang ra hoa pratorimin vaø pratosin laø 2 alcaloid pyrolophenanthrindon môùi cuøng vôùi nhöõng chaát ñaõ ñöôïc bieát nhö pratorimin, ambelin vaø lycorin [24] - Naêm 1986, Ghosal coøn coâng boá taùch ñöôïc töø Crinum latifolium L. moät soá daãn xuaát alcaloid coù taùc duïng choáng ung thö: Crinafolin vaø Crinafolidin. Caùc chaát naøy ñaõ ñöôïc thöû nghieäm vôùi teá baøo vaø cho keát quaû döông tính [25] - Naêm 1989, Ghosal coøn chieát töø dòch eùp cuûa caùn hoa Trinh nöõ hoaøng cung 2 alcaloid môùi coù nhaân pyrrolophennanthaidin laø 2-epilycorin vaø 2epipancrassidin [26] - Moät soá nhaø khoa hoïc Nhaät Baûn cuõng tìm thaáy moät soá ít alcaloid khaùc töø caây Crinum latifolium nhö: crinamin, hamayne (bulbisperine,demethỷlcinamine) [33] * Taùc duïng sinh hoïc Song song vôùi caùc nghieân cöùu veà maët hoùa hoïc, coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu veà taùc duïng döôïc lyù töø caây Trinh nöõ hoaøng cung ñaõ ñöôïc coâng boá. Caùc taùc giaû ñaõ chöùng minh ñöôïc raèng taùc duïng döôïc lyù cuûa caùc alcaloid trong hoï Amaryllidaceae raát roäng, bao goàm caùc ñaëc tính choáng ung böôùu, choáng vi khuaån vaø kích thích mieãn dòch. Taùc giaû Yui vaø coäng söï ñaõ chöùng minh alcaloid lycorine laø hoïat chaát chính töø Crinum latifolium L. coù taùc duïng gaây kích thích cho teá baøo T trong oáng nghieäm vaø treân sinh vaät hoaït ñoäng vaø phaùt trieån. [34] - Caùc taùc giaû Nguyeãn Thò Ngoïc Traâm, E.ZVETKOVA, E.NIKOLOVA, E.KATZAROVA vaø G.KOSTOV cuõng ñaõ chöùng minh ñöôïc raèng dòch chieát nöôùc noùng töø laù caây Trinh nöõ hoaøng cung (Crinum latifolium L.) Vieät Nam coù theå kích thích höõu hieäu söï sinh saûn cuûa teá baøo lympho T vaø ñaëc bieät coù - 13 taùc duïng kích thích tröïc tieáp caùc teá baøo CD3 +T vaø CD4 + T trong oáng nghieäm. [29] - Nguyeãn Thò Ngoïc Traâm, I.Yanchev, E.Zvetkova . Ñaõ tieán haønh thöû nghieäm gaây ung thö treân chuoät ñöïc gioáng Wistar töø 50 ñeán 55 ngaøy tuoåi baèng caùch caáy döôùi da chaát hoùa hoïc gaây ung thö 20-methylcholanthrene, vaø tieán haønh thí nghieäm cho uoáng nhöõng chaát chieát baèng nöôùc noùng cuûa caây Crinum latifolium L. (caây Trinh Nöõ Hoaøng Cung –Vieät Nam). Keát quaû ñaõ laøm chaäm söï taêng tröôûng khoái u cuûa chuoät thí nghieäm [30] - Theo taùc giaû Ghosal , moät soá alcaloid töø Crinum latifolium nhö: Crinafolin, crinafolidine ñaõ ñöôïc thöû nghieäm vôùi teá baøo ung thö vaø cho keát quaû döông tính. [25] - Theo taùc giaû E. Zvetkova, N.T.Tram, D.Fuchs dòch chieát nöôùc noùng cuûa traø tuùi loïc Trinh nöõ hoaøng cung coù khaû naêng kích thích teá baøo lympho T hoaït ñoäng vaø phaùt trieån taêng söùc ñeà khaùng cuûa cô theå maïnh hôn traø xanh. [19] - Dòch chieát nöôùc cuûa Crinum latifolium L. coù khaû naêng kích thích teá baøo lympho T cuûa ngöôøi hoaït ñoäng vaø phaùt trieån [19] - Dòch chieát nöôùc noùng töø Crinum latifolium L. Vieät Nam taïo neân moät soá taùc duïng maïnh tröïc tieáp maø nguyeân nhaân do kích thích moät soá hoãn hôïp nhöõng teá baøo Lympho CD4+/CD8+, laø söï saûn xuaát soá löôïng lôùn nhöõng taùc nhaân dieät ung böôùu nhö TNF - α trong caùc sinh vaät vaø beänh nhaân ung thö.[29] - Caùc alcaloid ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa khoái u vaø kích thích heä mieãn dòch. a. Epoxyambellin [22] ôû noàng ñoä 5 mg/ml kích hoïat vöøa phaûi teá baøo Lympho trong laùch chuoät b. Hoãn hôïp Epoxyambellin vaø ambellin [22] theo tæ leä (1:1) gaây hoaït hoùa teá baøo Lympho T gioáng nhö concanavalin A. [22] c. Crinamin vaø 6 – Hydroxycrinamin [20]. Hoaït ñoäng choáng laïi teá baøo u haéc toá chuoät BL6 d. Lycorin, crinamin vaø Augustin [27]. Lycorin ôû noàng ñoä 0,1 – 0,5 mg/ml dieät teá baøo MM46 vaø öùc cheá söï toång hôïp DNA (Deoxyribonucleic Acid) - Lycorin öùc cheá söï toång hôïp protein vaø DNA cuûa teá baøo laùch chuoät vaø öùc cheá teá baøo u baùng caáy ôû chuoät. - Lycorin laøm giaûm khaû naêng soáng cuûa teá baøo u. - Lycorine öùc cheá söï toång hôïp vitamin C trong caây coû, laøm ngöøng söï phaùt trieån virus gây beänh baïi lieät. - ÖÙc cheá söï toång hôïp caùc tieàn chaát caàn cho söï sinh tröôûng cuûa virus gaây beänh baïi lieät vaø enzym polipeptidase vaø coù taùc duïng khaùng virus. - Lycorin coù ñoäc tính caáp thaáp. - Lycorin - O – Glycosid ôû möùc lieàu microgram gaây kích thích caùc teá baøo lympho laùch chuoät nhaét traéng, coù taùc duïng ñieàu hoøa mieãn dòch. 14 Pseudolycorin coù taùc duïng laøm ngöøng söï phaùt trieån teá baøo Hela, ngaên caûn söï toång hôïp protein trong teá baøo u baùng vaø laøm chaäm laïi quaù trình toång hôïp DNA. - Kháng khuaån Staphylococcus [27] * Các nhà khoa học trên thế giới bằng con đường tổng hợp hóa học hoặc chiết xuất từ dược thảo đã tạo ra sản phẩm thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt có thể kể đến các thuốc sau: — Các thuốc kháng androgen: Acetat cyproterone, Flutamide, Casodex — Thuoác öùc cheá 5α reductase: Finasterid — Thuốc khaùng oestrogen: Tamoximen (TMA), Ketokonazone. — Thuoác phong beá alpha: Terazosin (Hytrin), Doxazosin (Cardura), Tamsulosin (Flomax), Prazosin, Alfurrosin. — Thuoác ñi töø nguoàn goác thieân nhieân, döôïc lieäu: Tadenan 50mg- vieân nang — meàm ñöôïc cheá töø voû caây Pygeum a fricanum), Permixon – töø quaû caây Serenoa repens. 1.2. Trong nước * Thaønh phaàn hoùa hoïc - Nguyeãn Thò Ngoïc Traâm vaø coäng söï ñaõ tìm ra 16 alcaloid: 9Octadecenamideb , Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamin, Augustamin, Oxoassoanin, Crinane-3α-ol, Buphanidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6-hydroxybuphanidrine, 6-hydroxypowelline, Crinamidine, 6-hydroxyundulatine, 1β,2β - epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one. [31] - Nguyeãn Vaên Baèng, Vuõ Ñoan Trang, vaø caùc coäng söï, ñaõ xaùc ñònh trong laù Trinh Nöõ Hoaøng Cung coù alcaloid, saponin, acid höõu cô, amino acid. [1] - Traàn vaên Sung vaø coäng söï xaùc ñònh theâm 2 hoaït chaát: Lycorin vaø Pratorin (Hippadin) [18] - Voõ Thò Baïch Hueä, Nguyeãn Khaéc Quyønh Cöù, vaø caùc coäng söï xaùc ñònh ñöôïc 4 alcaloid: Augustamin, ambelin, crinamidin, 6-hydroxycrinamidin [8] - Nguyeãn Thò Ngoïc Traâm vaø coäng söï ñaõ nghieân cöùu vaø coâng boá 32 chaát bay hôi coù trong laù caây Trinh Nöõ Hoaøng Cung [28] Nguyễn Hải Nam và cộng sự phân lập xác định cấu trúc hai flavonoid: [11] - 4’7 – dihydroxy -3- vinyloxyflavan; 4’7 – dihydroxyflavan 15 - Mai Đình Trị, Nguyeãn Coâng Haøo [15] ñaõ chieát taùch vaø phaân laäp töø laù töôi Trinh Nöõ Hoaøng Cung 4 hôïp chaát: p – hydroxycinnamat metyl, 3,4dihidroxycinnamat etyl, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosit vaø kaempferol-34’-di-O-β-D-glucopyranosit. * Tác dụng sinh học. - Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự chöùng minh theâm ñöôïc 4 phaân ñoaïn alcaloid coù taùc duïng gaây ñoäc teá baøo ung thö da, ung thö maøng töû cung, ung thö cô tim coù keát quaû döông tính maïnh. [14]. - Ñeå coù thuoác hoã trôï cho ñieàu trò u xô tuyeán tieàn lieät (phì ñaïi laønh tính tuyeán tieàn lieät), u xơ tử cung và traùnh nhaàm laãn caây Trinh Nöõ Hoaøng Cung vôùi caùc caây naùng khaùc coù ôû Vieät Nam, Coâng ty CP Döôïc Lieäu TW2 ñaõ saûn xuaát traø tuùi loïc Trinh Nöõ Hoaøng Cung töø 1998 cho ñeán nay, saûn phaåm ñaõ vaø ñang coù uy tín treân thò tröôøng. - Nguyeãn Xuaân Höôùng đã söû duïng nöôùc saéc laù Trinh Nöõ Hoaøng Cung cuûa Coâng ty Döôïc Lieäu TW2 cung caáp ñeå hỗ trợ ñieàu trò u xô tuyeán tieàn lieät cho caùc beänh nhaân cuûa beänh vieän Höõu Nghò Haø Noäi, kết quả việc tiểu tiện của đa số các bệnh nhân đã được cải thiện [7]. - Ngày 7/6/2004, theo quyết định số 2004/QĐ – BYT, Bộ Y Tế đã phê duyệt đề tài nghiên cứu khoa học: “Đánh giá tác dụng điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt bằng viên nang Trinh Nữ Hoàng Cung”, do GS.TS.Trần Đức Thọ làm chủ nhiệm đề tài. Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 theo quy chế 371 – Bộ Y Tế tại 3 bệnh viện: Bệnh Viện Y Học Cổ Truyền Trung Ương, Viện Lão Khoa Trung Ương, Bệnh viện Y Học Cổ Truyền TP.HCM. Qua kết quả nghiên cứu trên 157 bệnh nhân dùng thuốc viên TNHC (Crila) điều trị rối loạn tiểu tiện do phì đại lành tính tuyến tiền liệt, GS. Trần Đức Thọ rút ra một số kết luận như sau: ™ Viên nang TNHC (Crila) có hiệu quả trong điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Cho kết quả điều trị khá và tốt đạt 89,18%. o o ™ Cải thiện đáng kể về triệu chứng lâm sàng và chất lượng sống của bệnh nhân. Thang điểm trung bình IPSS từ 19,45 xuống còn 7,81 điểm. Thuốc làm giảm thể tích tuyến tiền liệt nhưng không nhiều. Thể tích tuyến tiền liệt trung bình từ 39,87 cm3 xuống 35cm3. Thuốc an toàn, ít tác dụng phụ. 16 o o Có một số tác dụng phụ nhưng không gây khó chịu nhiều cho bệnh nhân, và chỉ trên một số ít bệnh nhân như đầy bụng, chóng mặt, mất ngủ. Các xét nghiệm cận lâm sàng thay đổi không đáng kể: urê, creatinin, SGOT, SGPT, công thức máu, sinh hóa nước tiểu. - Từ kết quả nghiên cứu lâm sàng giai đoạn 3 – đạt kết quả tốt, Cuïc Tröôûng Cuïc Quaûn lyù Döôïc Vieät Nam đã ban hành quyết định số 135/QĐ-QLD, cho phép TRUNG TÂM NCPTSX DƯỢC PHẨM CRINA thuoäc CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 được phép saûn xuaát viên nang CRILA từ cao khoâ TNHC và löu haønh toaøn quoác, dùng ñieàu trò beänh phì ñaïi laønh tính tuyeán tieàn lieät (u xô tuyeán tieàn lieät). 2. TÍNH CẤP THIẾT VÀ KHẢ THI CỦA DỰ ÁN. Bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt là một căn bệnh phổ biến trong xã hội hiện nay cả trong và ngoài nước, nhu cầu về thuốc điều trị bệnh của thị trường là rất lớn. Thuốc viên CRILA được bào chế từ thảo dược, hiệu quả điều trị cao, được thị trường ưa chuộng. Giá thành hợp lý phù hợp với thu nhập của người dân Việt Nam. Tạo viêc làm cho người lao động. Do đó cần phải đầu tư để hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc viên TNHC (CRILA) để sớm đưa sản phẩm ra phục vụ sức khỏe cộng đồng và xuất khẩu. - 3. MỤC TIÊU DỰ ÁN. 3.1. Hoaøn thieän quy trình coâng ngheä chieát xuaát hoaït chaát alcaloid töø döôïc lieäu Trinh nöõ hoaøng cung ở quy moâ công nghiệp. 3.2. Hoaøn thieän quy trình saûn xuaát vieân nang töø baùn thaønh phaåm cuûa Trinh nöõ hoaøng cung. 3.3. Naâng caáp tieâu chuaån kieåm nghieäm nguyeân lieäu, baùn thaønh phaåm vaø thaønh phaåm. 17 4. NỘI DUNG DỰ ÁN. Ñeå thöïc hieän ñöôïc 3 muïc tieâu treân chuùng toâi tieán haønh thöïc hieän döï aùn theo noäi dung sau: 1- Hoaøn thieän quy trình coâng ngheä chieát xuaát alcaloid töø döôïc lieäu laù TNHC (laù TNHC töôi vaø lá TNHCù khoâ) duøng laøm nguyeân lieäu saûn xuaát vieân nang TNHC (CRILA) ôû quy moâ công nghiệp. 2- Hoaøn thieän quy trình saûn xuaát vieân nang töø baùn thaønh phaåm cuûa TNHC. 3- Naâng caáp tieâu chuaån kieåm nghieäm nguyeân lieäu, baùn thaønh phaåm vaø thaønh phaåm. 4- Xaây döïng tieâu chuaån cuûa lá TNHC, cao khoâ TNHC, tieâu chuaån cuûa thuoác thaønh phaåm vaø thaåm ñònh laïi thuoác ñaõ xaây döïng. 5- Saûn xuaát 10.000.000 viên thuoác ñöa ra thò tröôøng. CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG ĐANG NỞ HOA (Ảnh chụp tại Trang trại Dược liệu – Công ty CP Dược Liệu TW2-Trung tâm CRINA) 18