BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ THÚY
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
NHỜ STREPTOMYCES 183.24
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ THÚY
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
NHỜ STREPTOMYCES 183.24
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
Ths. Lê Thị Thu Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh và Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI - 2014
LỜI CẢM ƠN
ThS. Lê Thị Thu
Hương – Bộ
-S
ọ
ộ
Tôi xin chân thà
ộ
H
- S
ộ
ị
ọ
ộ
Đ
ọ
ễ
m.
ị
Đ
ọ
H
ộ
ọ
ọ
ộ
ị
H
ộ
ă
0 4
Sinh viên
HOÀ G HỊ HÚY
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................... 2
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh .......................................................................................... 2
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh ......................................................................... 2
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh ....................................................................................... 2
1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh .................................................................................. 2
1.1.4. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới .................................................................. 3
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn.............................................................................................. 3
1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn .............................. 3
1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ..................................................................... 4
1.2.3. Phân loại xạ khuẩn............................................................................................. 4
1.2.4. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ....................................................... 5
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn .................................................. 5
1.3.1. Mục đích .............................................................................................................. 5
1.3.2. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên .......... 6
1.3.3. Đột biến cải tạo giống........................................................................................ 6
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn .................................................................................. 6
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .......................................................................... 7
1.4.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 7
1.4.2. Các phương pháp lên men ................................................................................. 7
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ............................................ 8
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh ............................................................................ 8
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ................................................. 8
1.5.2. Các phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng ...................................... 9
1.6. Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh............................................................ 10
1.6.1. Phổ tử ngoại – nhìn thấy (phổ UV-VIS) ........................................................ 10
1.6.2. Phổ hồng ngoại (phổ IR) ................................................................................. 10
1.6.3. Phân tích khối phổ............................................................................................ 11
1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh 11
1.8. Nghiên cứu kháng sinh natamycin sản xuất bởi Streptomyces lydicus (quá trình
lên men, chiết suất, tinh chế và một số tính chất) ........................................................... 12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 13
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...................................................................................... 13
2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................. 13
2.1.2. Máy móc thiết bị ............................................................................................... 14
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 15
2.2.1. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được .......................... 16
2.2.2. Chủng giống, cải tạo giống ............................................................................. 16
2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh....................................................................... 16
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm ...................................................................................... 17
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ..................................................................... 17
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán .................. 17
2.3.3. Phân loại xạ khuẩn theo ISP ........................................................................... 18
2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp ....................................................... 19
2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên ......................................................................................... 20
2.3.6. Đột biến bằng ánh sáng UV ............................................................................ 20
2.3.7. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc............................................ 21
2.3.8. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ................................................................ 22
2.3.9. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ........................... 22
2.3.10.
Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng………..22
2.3.11.
Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột và sơ bộ xác định một số tính
chất của kháng sinh thu được ........................................................................................ 23
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ................................................................. 25
3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.24................................................. 25
3.2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh...................................................... 26
3.2.1. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp................................................ 26
3.2.2. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ........................................................................... 27
3.2.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 .............................................................. 28
3.2.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2…………………………………….29
3.2.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm......................................................... 30
3.2.6. Kết quả chọn chủng lên men ........................................................................... 30
3.2.7. Độ bền với pH, nhiệt ........................................................................................ 31
3.3. Chiết suất và tinh chế kháng sinh từ dịch lọc ....................................................... 32
3.3.1. Kết quả chọn pH chiết...................................................................................... 33
3.3.2. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi.................................................. 34
3.3.3. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh .............................................................. 34
3.3.4. Kết quả chạy sắc ký cột lần 1.......................................................................... 34
3.3.5. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2.......................................................................... 35
3.4. Kết quả độ nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết .................... 38
3.4.1. Nhiệt độ nóng chảy........................................................................................... 38
3.4.2. Phổ tử ngoại ...................................................................................................... 38
3.4.3. Phổ hồng ngoại................................................................................................. 39
3.4.4. Phổ khối ............................................................................................................. 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................................................................. 40
-
Kết luận .......................................................................................................................... 40
-
Đề xuất ........................................................................................................................... 41
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Chữ viết tắt
Tên đầy đủ
1
16S rADN
2
ADN
Acid deoxyribonucleic
3
ATCC
American type culture collection
16S Ribosomal acid deoxyribonucleic
(Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ)
4
B.pumilus
Bacillus pumilus
5
DM
6
DMHC
7
ĐB1
Đột biến lần 1
8
ĐB2
Đột biến lần 2
9
Gr(+)
Gram dương
10
Gr(-)
Gram âm
11
ISP
Dung môi
Dung môi hữu cơ
International Streptomyces Project
(Chương trình Streptomyces quốc tế)
12
IR
Investor relations
13
KS
Kháng sinh
14
HTKS
15
MS
Mass Spectometry
16
MT
Môi trường
17
MTdt
18
S.flexneri
Hoạt tính kháng sinh
Môi trường dịch thể
Shighella flexneri
19
UV-VIS
Ultraviloet- Visible
20
SLNN
Sàng lọc ngẫu nhiên
21
VSV
Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Ký hiệu
Nội dung
1
Bảng 2.1
Các vi khuẩn kiểm định
13
2
Bảng 2.2
Các dung môi đã sử dụng
15
3
Bảng 3.1
Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.24
25
Trang
và Streptomyces lydicus
4
Bảng 3.2
Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.24 trên
26
MT1, MT2, MT6
5
Bảng 3.3
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của sàng lọc ngẫu
27
nhiên
6
Bảng 3.4
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của đột biến lần 1
28
7
Bảng 3.5
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của đột biến lần 2
29
8
Bảng 3.6
Kết quả chọn môi trường lên men chìm
30
9
Bảng 3.7
Kết quả chọn chủng lên men
30
10
Bảng 3.8
Độ bền của kháng sinh với nhiệt
31
11
Bảng 3.9
Độ bền của kháng sinh với pH
31
12
Bảng 3.10
Kết quả chọn pH chiết
32
13
Bảng 3.11
Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký
33
14
Bảng 3.12
Kết quả chạy sắc ký cột lần 1
34
15
Bảng 3.13
Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của chạy cột
35
lần 1
16
Bảng 3.14
Màu sắc từ phân đoạn 7 đến 14 của sắc ký cột lần 1
35
17
Bảng 3.15
Kết quả chạy sắc ký cột lần 2
36
18
Bảng 3.16
Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của chạy cột
37
lần 2
19
Bảng 3.17
Kết quả của các chất kháng sinh tách được
37
20
Bảng 3.18
Kết quả IR
38
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh ra đời là một bước ngoặt quan trọng của y-dược học. Nhờ đó mà nhân
loại đã chống lại được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, viêm phổi… Hiện
nay, kháng sinh trở thành 1 nhóm thuốc thiết yếu. Với nền khoa học ngày càng phát
triển, nhóm thuốc kháng sinh không chỉ dừng lại ở chỉ định điều trị nhiễm khuẩn,
nhiễm nấm mà còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và HIV/AIDS với
nhiều kết quả khả quan.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu kháng sinh mới đang có xu hướng giảm dần theo thời
gian do chi phí, nhân lực còn hạn chế. Đó chính là nguyên nhân các hãng dược phẩm
đang có xu hướng từ bỏ cam kết triển khai nghiên cứu thuốc kháng sinh mới. Trong
khi đó, việc sử dụng kháng sinh chưa hợp lý gây ra tình trạng kháng thuốc ngày càng
nghiêm trọng và xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng chéo với các kháng sinh có
cấu trúc tương tự. Do vậy, đẩy mạnh nghiên cứu kháng sinh mới có hiệu quả điều trị
cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấp thiết.
Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn
gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi chọn đề tài:
”Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183.24” làm khóa
luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau đây:
-
Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.24.
-
Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
-
Xác định các điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh, sơ bộ xác định một số
tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.
2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
Năm 1929 thuật ngữ "chất kháng sinh" được Alexander Fleming mô tả một cách
đầy đủ và đã mở ra kỷ nguyên mới trong ngành y dược học, khai sinh ra ngành công
nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người
[9],[15]. Thập niên 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc của
ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt sự kiện như: Khám phá ra
hàng loạt kháng sinh, như penicillin (1928), griseofulvin (1939), gramicidin S (1942),
streptomycin (1943)…
Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến (đặc biệt là các kỹ
thuật gây đột biến, dung hợp tế bào, tái tổ hợp gen...) đã tạo ra những chủng có khả
năng tổng hợp kháng sinh cao gấp nhiều lần so với ban đầu. Bên cạnh đó, tổng hợp và
bán tổng hợp kháng sinh từ các khung hóa học sẵn có cũng đạt được những thành tựu
đáng kể với sự xuất hiện của chloramphenicol, cephalosporin bán tổng hợp,
macrolid,… [9],[12],[19],[35].
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn gốc
tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách
chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa…) hay tế bào
ung thư ở nồng độ thấp [4],[7],[8],[9],[15],[19].
Phụ lục 1.1 trình bày một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra.
1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh
-
Lĩnh vực y học:
Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh nhiễm
khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm [8].
3
-
Lĩnh vực khác
Trong chăn nuôi: kháng sinh được dùng để chữa bệnh cho động vật. Ví dụ:
griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú ở trâu bò… Ngoài ra kháng sinh còn
được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí
thức ăn, ăng sản lượng trứng cho gà, vịt…
Trong trồng trọt: hiện nay có khoảng 30 chất kháng sinh có thể diệt nấm, vi
khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng. Ví dụ: Blastincidin S (kháng sinh chiết từ S.
griseochromogenes), ở Nhật dùng để trị bệnh vàng lụi gây ra bởi Piricularia
oryzae, Herbicidin A và B là kháng sinh diệt cỏ do S.saganonensis tạo ra, nó kìm
hãm sự phát triển của Xanthomonas oryzae gây bệnh ở lúa…
Trong công nghiệp thực phẩm: kháng sinh được sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp, cho thêm kháng sinh vào nhằm giảm
thời gian khử trùng bằng nhiệt. Ví dụ: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo
ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra) [7].
1.1.4. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới
Một trong các thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và các
chất kháng VSV. Tuy nhiên, các VSV đã và đang phát triển tính kháng với các kháng
sinh hiện có bằng các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền. Do vậy, cần phải
có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là
các hợp chất chống khối u và vật ký sinh.
Ngoài ra, cần có các kháng sinh mới cho nông nghiệp để làm thuốc chữa bệnh cho
cây trồng và vật nuôi vì các bệnh đó sẽ ảnh hưởng đến con người thông qua chuỗi thức
ăn [19],[32].
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn
1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật có cấu tạo dạng sợi phân
nhánh, là các vi khuẩn gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có tỷ lệ G+C > 55%. Chúng phân
4
bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong
cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Do có thể sinh tổng hợp được
nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như kháng sinh, vitamin, acid hữu cơ, các
enzym… nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều [8].
Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên
trong tế bào (nội bào) hay phóng thích ra ngoài môi trường (ngoại bào). Các chủng xạ
khuẩn cùng loài có thể sản sinh các kháng sinh khác nhau, mặt khác, các chủng thuộc
các loài khác nhau cũng có thể sản xuất cùng một loại kháng sinh [8],[43].
Bảng 1 phụ lục giới thiệu một số kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp và ứng dụng.
1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà
thường có dạng thô ráp hoặc dạng phấn, có dạng nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0µm đến 2-3µm, đa số
không có vách ngăn, và có màu sắc phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, trắng…[8].
1.2.3. Phân loại xạ khuẩn
Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, khoảng 500 loài, tất cả đều
có tỷ lệ G+C cao (69-73%) trong ADN. Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được
nghiên cứu như khóa phân loại của Waksman, của Gauze… Ngày nay, để phân loại xạ
khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự 16S rADN, lai ADN, hình thái,
sinh lý sinh hóa, hóa phân loại [13].
Đối với xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces thì có thể phân loại:
-
Bằng đặc điểm hình thái: khóa phân loại ISP được sử dụng làm bảng phân loại
chính để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces dựa trên các đặc điểm: màu
khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử, khả năng
tạo sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, khả năng tiêu thụ các nguồn đường [7],[28].
-
Bằng sinh học phân tử: tách chiết ADN, giải trình tự 16S rADN để định tên khoa
học [1],[33].
5
1.2.4. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomytaceae, bộ Actinomycetales [13]. Một
số đặc điểm thường thấy ở xạ khuẩn Streptomyces:
Đặc điểm hình thái:
-
Khuẩn lạc tạo thành cụm trên bề mặt khô, xù xì, được bao phủ bởi một lớp bột mịn
hoặc bởi những sợi nhỏ như lông tơ, khuẩn lạc có chân khá vững chắc.
-
Hệ sợi của khuẩn lạc: khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào trong môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong
suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi.
Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau
một thời gian phát triển, trên đỉnh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử là cơ
quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn, phân cắt thành các bào tử trần.
Đặc điểm sinh lý: streptomyces là VSV dị dưỡng và hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ phát
triển từ 20-40°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5. Để phát triển chúng phân giải các
hydratcacbon như tinh bột, glucose... làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng,
đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.
Khả năng tạo sắc tố: được chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ
chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh (màu sắc của bề mặt), sắc tố melanoid [8].
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1. Mục đích
Xạ khuẩn thuần chủng phân lập từ tự nhiên thường có HTKS không cao, hiệu suất
sinh tổng hợp thấp. Do đó, để thu được kháng sinh có hoạt tính và hiệu suất sinh tổng
hợp cao đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên
cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp [7],[9].
6
1.3.2. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết,
có cá thể có HTKS tăng mạnh gấp 20-30% so với những cá thể khác. Chọn lấy cá thể
có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [7].
1.3.3. Đột biến cải tạo giống
Để chọn được các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao, tiến hành gây
đột biến liên tiếp kết hợp sàng lọc ngẫu nhiên các chủng sống sót [20] và kết hợp các
phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và
dung hợp tế bào trần... đã đem lại nhiều kết quả, không những nâng cao hiệu suất sinh
tổng hợp mà còn rút ngắn được thời gian cải tạo giống mới [7].
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 2 nhóm:
-
Tác nhân hóa học: có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, đồng thời gây thay
đổi trạng thái của ADN nên làm thay đổi cấu trúc gen. Một số tác nhân hóa học: acid
nitrơ (HNO2), các hợp chất gây alkyl hóa (ethylmethan sunfonat, ethylenimin,
nitromethylure…), các chất gây đột biến nhóm acridin,…[20],[21].
-
Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tác nhân vật lý
thông dụng là ánh sáng (UV). Ánh sáng có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những
tế bào VSV có kích thước nhỏ thì nó có khả năng xuyên thấu đến nhân. Khả năng đột
biến phụ thuộc vào thời gian chiếu, cường độ bức xạ, khoảng thời gian giữa lúc chiếu
xạ và lần sao chép tiếp theo của ADN, mức độ tổn thương ADN, hoạt tính enzym sửa
chữa trong tế bào xạ khuẩn [21]. Những cá thể nào sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm
thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng sinh tổng hợp kháng sinh (đột
biến âm) hoặc tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh (đột biến dương) [20],[21].
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
-
Mục đích: giữ VSV có tỷ lệ sống sót cao, ổn định các trạng thái thu được, các đặc
tính di truyền không bị biến đổi, không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ, tránh bị thoái
hóa, nhầm lẫn.
7
-
Thông thường có 4 phương pháp:
Bảo quản trên môi trường thạch, định kỳ cấy chuyền.
Giữ giống trong cát hoặc đất vô trùng: do cấu trúc lý hóa nên đất là những cơ
chất mang các tế bào VSV, đặc biệt là các bào tử [22]. Làm khô: trộn tế bào với giá
mang (đất, cát, đĩa giấy, đĩa gelatin…) ở nhiệt độ phòng [20].
Giữ giống bằng phương pháp đông lạnh: ức chế sự phát triển của VSV bằng
cách đưa chúng vào điều kiện lạnh sâu -25 đến -70 oC.
Giữ giống bằng phương pháp đông khô [7],[22],[20].
-
Thực tế, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng
thích hợp, bảo quản trong tủ lạnh ở 2°C, định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần [7],[22].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1. Định nghĩa
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của VSV
(trong điều kiện yếm khí hay kỵ khí) [20] nhờ sự xúc tác của các enzym với mục đích
cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng [7]. Lên men là giai đoạn
nuôi VSV để chúng tạo sản phẩm hoặc là sinh khối VSV, hoặc là các sản phẩm trao
đổi chất bậc 1,2,…[22].
Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn. Cụ thể,
là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng
của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào pha cân bằng [6],[7],[15].
Hình P1 phụ lục, trình bày các bước cơ bản trong quá trình lên men từ xạ khuẩn.
1.4.2. Các phương pháp lên men
-
Phương pháp lên men bề mặt: môi trường dùng trong phương pháp này ở thể rắn
hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ môi trường và sử dụng oxy
không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường. Phương pháp này có nhược điểm là tốn
mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử
dụng phương pháp này trong chọn giống và giữ giống [7].
8
Phương pháp lên men chìm: vi sinh vật được nuôi trong môi trường lỏng, phát triển
-
cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt,
nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.
Có 4 kiểu lên men chìm là: lên men mẻ, lên men bổ sung, lên men liên tục, lên men
bán liên tục [7],[9],[10],[20],[22].
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Nhiệt độ: là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của VSV và hiệu
-
quả lên men. Quá trình lên men thường tỏa nhiệt rất lớn nên nhiệt độ trong các thiết bị
lên men thường tăng vượt quá ngưỡng nhiệt độ thích hợp, vì vậy cần phải giám sát và
điều chỉnh nhệt độ theo yêu cầu của quá trình lên men [22].
-
pH môi trường: có thể các ion H+ hay OH- tác dụng trực tiếp đến tính chất keo
của tế bào, hoạt lực của enzym [7]. Trong quá trình lên men, VSV tạo ra những sản
phẩm trao đổi chất có tính acid hoặc base, khiến pH không còn phù hợp, nên phải chủ
động điều chỉnh pH luôn ở giá trị thích hợp toàn bộ quá trình [20],[22].
-
Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong
tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy
của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn
pha tiềm phát [7],[20],[22].
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá
trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho
sinh tổng hợp chất mong muốn [9].
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, tùy theo đặc tính của loài mà
sản phẩm thứ cấp đó được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong tế bào. Để thu
được các hoạt chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết thích hợp.
9
Mục đích:
-
Không những làm cho sản phẩm đạt chất lượng cao, bảo quản được lâu hơn, mà
còn làm tăng tỷ lệ thu hồi và hạ giá thành sản phẩm [7].
-
Sở dĩ cần có các phương pháp chiết tách và tinh chế vì lượng kháng sinh trong dịch
lên men thường rất nhỏ [2].
1.5.2. Các phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng
-
Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp lọc, bã được giữ lại
trên lớp lọc, dung dịch chảy qua do chênh lệch áp suất trên và dưới lớp lọc.
-
Chiết bằng dung môi hữu cơ: là quá trình chuyển kháng sinh cần tách sang pha
DMHC không đồng tan. Khi chọn DMHC cần thỏa mãn các yêu cầu sau:
Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc, khó cháy.
Có tính chọn lọc cao, hòa tan tốt hoạt chất ít hòa tan tạp chất.
Dễ cất thu hồi [7].
-
Phương pháp sắc ký: là phương pháp phân tách các chất trong hỗn hợp bằng cách
dùng môi trường động (pha động) đưa hỗn hợp dung môi qua môi trường cố định trên
bề mặt (pha tĩnh). Các chất được tách ra nhờ sự khác biệt của tương tác giữa chúng với
pha tĩnh. Được ứng dụng trong kỹ thuật phân tách, làm giàu, tinh chế, phân tích định
tính, định lượng [5],[16].
Sắc ký lớp mỏng: là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả
năng bị hấp phụ khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn. Chất hấp phụ
được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di
chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf [5],[16].
Sắc ký lỏng trên cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố
khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm
phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn (chất mang có cỡ hạt nhỏ) được nhồi
vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh [5].
-
Tinh chế bằng nhựa trao đổi ion hoặc bằng phức chất.
- Xem thêm -