Tài liệu Giải mã và phân tích hệ gen virus viêm gan vịt cường độc chủng ninh thuận (nt) phân lập tại việt nam

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------------------- ĐỖ THỊ ROAN GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH HỆ GEN VIRUS VIÊM GAN VỊT CƢỜNG ĐỘC CHỦNG NT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM NĂM 2013 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 12/2014 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------------------------- ĐỖ THỊ ROAN GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH HỆ GEN VIRUS VIÊM GAN VỊT CƢỜNG ĐỘC CHỦNG NT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM NĂM 2013 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: TS. ĐOÀN THỊ THANH HƢƠNG Viện Công nghệ sinh học Hà Nội – 12/2014 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3 MỞ ĐẦU Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Hepatitis Virus) được coi là một bệnh cổ điển của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Bê ̣nh xảy ra ở vịt con từ 1 đến 6 tuần tuổi, và đặc biệt mẫn cảm với vịt con dưới 1 tuần tuổi, tố c đô ̣ lây lan nhanh với tỷ lệ chết rất cao, có khi lên đến 95 – 100% toàn đàn. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế, là mối lo ngại cho các nhà chăn nuôi. Trên thế giới, mặc dù được phát hiện từ trước những năm 1950 nhưng chỉ trong vòng 10 năm gầ n đây virus viêm gan vịt được nghiên cứu sâu sắc ở mức độ sinh học phân tử gen và hệ gen, đặc biệt về ứng dụng sinh học phân tử trong giám định, nghiên cứu hệ gen, phân loại và tìm hiểu quan hệ sinh học trong họ Picornaviridae. Theo quan điểm phân loại hiện nay, virus viêm gan vịt gồm ba genotype khác nhau: genotype I (DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3). Tại Việt Nam, từ trước đến nay mới chỉ công bố sự phổ biến của virus viêm gan vịt thuộc genotype I, bao gồm cả các chủng cường độc và vaccine. Tuy nhiên trong những điều tra mới đây, virus viêm gan vịt thuộc genotype III đã phát hiện ở một số địa phương của Việt Nam. Để làm sáng rõ về đặc điểm phân tử của virus thuộc genotype 3 mới phát hiện này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Giải mã và phân tích hệ gen virus viêm gan vịt cường độc chủng Ninh Thuận (NT) phân lập tại Việt Nam năm 2013”. Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau: 1. Mục tiêu: - Thu nhận được trình tự nucleotide của toàn bộ hệ gen của một chủng virus viêm gan vịt cường độc mới phân lập tại Việt Nam năm 2013. - Phân tích được trật tự sắp xếp của từng vùng gen và đặc điểm phân tử của các phân đoạn gen trong hệ gen. 2. Nội dung: Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4 - Phân lập và thu thập một chủng virus cường độc viêm gan vịt mới phân lập tại tỉnh Ninh Thuận (Việt Nam) năm 2013 (Kí hiệu chủng: NT). - Giải mã toàn bộ hệ gen của virus viêm gan vịt chủng NT (có kích thước khoảng 7.8 kb). - Phân tích trật tự sắp xếp của các gen theo từng vùng gen. - So sánh trình tự nucleotide của chủng NT với các chủng virus viêm gan vịt khác của Việt Nam và thế giới. - Xây dựng cây phả hệ và vị trí phân loại. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT 1.1.1. Cấ u ta ̣o chung Virus viêm gan vịt (duck hepatitis virus) thuộc họ Picornaviridae, có kích thước nhỏ, khoảng 20-30 nm, không có vỏ bọc ngoài cùng. Hệ gen của virus viêm gan vịt chứa acid ribonucleic (RNA) sợi đơn dương có độ dài khoảng 7600 đến 7700 nucleotide và đuôi poly A ở đầu 3’, chứa duy nhất một khung đọc mở (open reading frame) mã hoá cho một protein chung (polyprotein). Protein này, sau khi tổng hợp phải trải qua nhiều lần phân cắt để tạo nên các sản phẩm protein độc lập. Hệ gen RNA của virus rất đặc biệt, có chứa một protein ở đầu 5’ có tác dụng như một primer của quá trình sao chép RNA nhờ RNA polymerase (www.britannica.com/EBchecked/topic/459528/Picornavirus). Các virus thuộc họ Picornaviridae rất đa dạng (có tới trên 200 genotype) và là loại virus được biết đến từ sớm nhất. Bệnh do chúng gây ra rất đa dạng, có thể là bệnh cấp tính hay nhiễm trùng mãn tính, bao gồm cả nhiều bệnh nguy hiểm trên người và động vật. Picornavirus rất nhỏ bé, có thể xuyên qua được màng lọc thông thường (Levine, Fabricant, 1950). Qua kính hiển vi điện tử, virus là những hạt tròn, bề mặt xù xì, không có vỏ bọc ngoài cùng (hình 1.1). Hepatitis A virus - Picornavirus capsid Viral polypeptides 27 nm VPG ss RNA Hình 1.1. . Mô hình cấu trúc của một chủng virus thuộc họ Picornavirus (Hepatitis A virus ). (Nguồn: www.technologyreview.com) Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 6 1.1.2. Đặc điểm cấu trúc hệ gen của virus viêm gan vịt Trong họ Picornaviridae, tất cả virus đều bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’ mà thay vào đó là một protein (khoảng 23 amino acid) gọi là VPg (v irion protein genome-link). VPg này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ thông qua một gốc tyrosine (Cheney et al., 2003) (hình 1.2). Ở cả hai đầu của hệ gen Picornavirus đều có vùng không dịch mã (UTR). Vùng 5’UTR dài hơn, có độ dài khoảng từ 600 đến 1200 bp, trong khi vùng 3’UTR thường có độ dài chỉ từ 50 đến 100 bp. Vùng 5’UTR có vai trò quan trọng đối với quá trình sao mã và vùng 3’UTR có vai trò trong quá trình tổng hợp sợi âm. Tuy nhiên đầu 5’ cũng có thể có vai trò trong việc làm tăng cường độc lực của virus. Trong hệ gen của Picornavirus có một vùng nucleotide làm điểm khởi đầu để ribosome dịch mã, gọi là IRES – Internal Ribosome Entry Site, đó là một cấu trúc di truyền hoạt động phức tạp dạng cis với cấu trúc bổ sung thứ cấp khởi động cho quá trình dịch mã không phụ thuộc điểm mũ của hệ gen virus (Chard et al., 2006). Nằm giữa hai vùng 5’ và 3’ là một khung đọc mở (open frame reading) lớn, mã hóa khoảng từ 2100 đến 2400 amino acid cho cả các protein cấu trúc và không cấu trúc. Đầu cuối 3’ của hệ gen virus có gắn thêm đuôi poly A, dài khoảng từ 16 đến18 nucleotide. Trong chuỗi polypeptide, phần protein đầu tiên là protein dẫn, ký hiệu là L (Leader protein), tiếp theo là 4 loại protein cấu trúc bao gồm VP4 (1A), VP2 (1B), VP3 (1C) và VP1 (1D), đoạn cuối cùng gồm 7 protein không cấu trúc là protein 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D. Tuy nhiên, ở các chi virus khác nhau thì trật tự này có sự thay đổi nhỏ. Chuỗi polypeptide chung của Picornavirus thường bị phân giải bởi một, hai hoặc cả ba enzyme protease là 3Cpro, 2Apro và Lpro thành 10, 11 hoặc 12 chuỗi (Krumbholz et al., 2002). Toàn bộ chuỗi các protein liên tục này gồm 2249 amino acid, đươ ̣c mã hóa bởi 6747 nucleotide (Ding, Zhang, 2007). Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 7 Hình 1.2. Cấu trúc không gian của Picornavirus. Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm trên bề mặt vỏ kháng nguyên; protein VP4 lặn sâu vào bên trong (Nguồn: Swiss Institute of Bioinformatics, 2008). 1.1.3. Vai trò, chƣ́c năng của các gen và các protein của virus viêm gan vịt Trong hệ gen virus, VPg – tuy là một protein nhỏ, chỉ khoảng 23 amino acid, nhưng có vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình sao mã. VPg là mồi cho quá trình tổng hợp sợi âm, trong khi VPgpUpUOH (một dạng chuyển hoá của VPg) là mồi cho quá trình tổng hợp sợi dương. Hình 1.3. Cấu trúc hệ gen của một loại virus họ Picornavirus (Kok, McMinn, 2009). Hệ gen chia làm ba phần chính : P1, P2, P3 mã hóa cho chuỗi polyprotein chung, sau đó tự phân cắt thành các protein thành phần. Các protein VP1, VP2, VP3 và VP4 trong tổ hợp protein P1 có vai trò trong quá trình tạo vỏ capsid của virus. Ba loại protein đầu tiên nằm ở mặt ngoài của virus, protein VP4 ngắn hơn, nằm hoàn toàn ở bên trong vỏ capsid (Hình 1.2). Trong 4 loại protein này, VP1 có vai trò đặc biệt quan trọng, quyết định tính kháng nguyên và độc Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8 lực của virus. Bảy loại protein còn lại 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D là các protein không cấu trúc, tham gia vào các quá trình nhân lên của virus. Protein dẫn (L), protein 2A và 3C (Lpro, 2Apro và 3Cpro) là các enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình phân cắt protein của virus (Strebel, Beck, 1986). Trong đó, Lpro chỉ xuất hiện trong các tế bào nhiễm Aphtovirus và Cardiovirus. Các enzyme này không chỉ phân cắt các chuỗi peptide của virus mà còn ức chế hoạt động tế bào của nhiều loại tế bào vật chủ khác nhau và gây ảnh hưởng đến chức năng nội bào. 3Cpro của Picornavirus có thể xâm nhập vào nhân thông qua tiền tố có mang trình tự định vị nhân (NLS) của chúng là 3CD’ hay 3CD (Amineva et al., 2004; Sharma et al., 2004). 3Cpro đồng thời có thể phân cắt phần lớn các yếu tố hoặc các nhân tố điều hoà liên quan đến RNA polymerase I, II, III của tế bào. Ngoài ra, 3Cpro còn liên quan đến quá trình ức chế phiên mã của tế bào vật chủ. 2Apro có khả năng phân cắt protein gắ n có cấ u trúc hô ̣p TATA in-vitro nhưng lại không có khả năng ức chế quá trình phiên mã của tế bào vật chủ (Yalamachili et al., 1997). Các protein khác của Picornavirus bao gồm 2B, 2BC, 3A và 3D liên quan đến quá trình sao chép RNA. Cụ thể : Protein 2B/2BC Các protein 2B hay protein 2BC được giả thiết là có khả năng biến đổi màng của các tế bào bị nhiễm . Protein 2B và tiền thân của chúng là 2BC có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và gắn dính vào màng của hệ thống Golgi và phức hợp mạng lưới nội chât (endoplasmic reticulum-ER) của tế bào vật chủ, từ đó hình thành nên các cấu trúc túi hạt trên màng tế bào vật chủ bị viêm nhiễm và hình thành phức hợp viroporin (Jong et al., 2004). Sự tích luỹ các protein 2B và 2BC trong mạng lưới Golgi dẫn đến thay đổi tính thấm của màng sinh chất (Jong et al., 2008) và làm cho cấu trúc thể Golgi trở nên lỏng lẻo, từ đó có thể gây chết tế bào (Kuppeveld et al., 1997). Bên cạnh đó, khi protein 2B và 2BC gắn vào màng tế bào vật chủ còn gây giảm nồng độ Ca2+ trong phức hợp ER và Golgi, từ đó gây ức chế quá trình vận chuyển protein từ mạng lưới nội chất ER tới phức hệ Golgi (Jong et al., 2006). Protein 3A Protein 3A là một loại protein gắn màng, chúng giữ vai trò trong quá trình ức Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 9 chế tiết protein nội bào và giữ vai trò trung gian trong quá trình trình diện protein màng khi bị nhiễm virus. Khi có mặt protein A trong tế bào sẽ làm gián đoạn quá trình lưu thông từ mạng lưới nội chất tới mạng lưới Golgi, hiện tượng này cũng xuất hiện trong trường hợp tế bào bị nhiễm có protein 2B (Doedens et al., 1995 ; Doedens et al., 1997). Protein 3AB Theo các kết quả nghiên cứu về mặt hoá sinh, protein 3AB là một protein đa chức năng. Vùng kỵ nước trong tiểu phần 3A của protein liên kết với cấu trúc dạng túi hạt trên màng. Protein 3AB tương tác với 3D và 3CD của Poliovirus ở quy mô in-vitro (Towner et al., 1996; Fujita et al., 2007). Protein 3AB màng gắn trực tiếp với tiền thân 3CD polymerase trên cấu trúc vòng lúp của RNA poliovirus, từ đó kích thích hoạt tính protease của 3CD. Thêm vào đó, protein 3AB lại kích thích 3D polymerase của Poliovirus (Hope et al., 1997) và có chức năng như là một cơ chất cho 3D polymerase trong quá trình uridyl hoá VPg. Bên cạnh đó, protein 3AB của Poliovirus còn giữ một số vai trò khác, ví dụ như phá vỡ tính bền vững của chuỗi xoắn kép, phá vỡ tính ổn định trong cấu trúc bậc 2 của RNA và nâng cao khả năng bắt cặp của các cặp nucleotit bổ sung trong quá trình sao chép của virus (Xiang et al., 1995; Richard et al., 2006). Protein 3B Các protein 3B (VPg) là những peptide nhỏ có chứa từ 21 đến 23 amino acid liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ của hệ gen Picornavirus thông qua liên kết 5’ tyrosyluridine trong các gốc tyrosine của VPg. VPg cũng có khả năng tương tác với 3D polymerase của Poliovirus và UMP để tạo thành các tổ hợp VpgpU và VpgpUpU (Paul et al., 1998). VPg đã uridyl hóa được sử dụng như một primer cho cả quá trình tổng hợp RNA sợi đơn âm và RNA sợi đơn dương (Pettersson et al., 1978). Protein 3CD Protein 3CD, tiền thân của protease 3C trưởng thành và polymerase 3D, có hoạt tính protease, không có hoạt tính polymerase (Harris et al., 1992). Protein 3CD của Poliovirus góp phần tích cực vào quá trình sao chép RNA của virus bằng cách tương tác với cả hai đầu 5’ và 3’ của RNA virus, làm cuộn vòng genome của virus (Parsley et al., 1997; Gamarnik and Andino,1997). Ngoài ra, 3CD cũng có khả năng tương tác với ribonucleoprotein C (hnRNP C) (Brunner et al., 2005). hnRNP C tham gia trong quá Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 trình tổng hợp tiền RNA thông tin ở các tế bào bình thường. hnRNP C tham gia vào quá trình sao chép RNA của virus và dạng đột biến của hnRNP C không có khả năng tương tác protein-protein sẽ ức chế quá trình tổng hợp RNA sợi đơn dương của virus (Walter et al., 2002 ; Brunner et al., 2005). Protein 3D RNA polymease 3D là một trong những thành phần cơ bản tham gia vào phức hợp sao chép RNA virus. 3D polymease có thể uridilyl hóa VPg và sử dụng VPgpUpU như là một primer trong quá trình sao chép RNA. 1.1.4. Quá trình nhân lên của virus Virus nhân lên trong tế bào chất. Đầu tiên, virus gắn vào thụ thể nằm trên màng sinh chất của tế bào chủ, sau đó theo cơ chế nhập bào và tiến hành quá trình “cởi áo” virus trong endosome hoặc lysosome. Sau khi được giải phóng khỏi capsid, RNA hệ gen của virus được dịch mã, sản xuất các protein của virus; tiếp theo đó, các phức hợp sao chép của virus được tập hợp; RNA virus được nhân lên và hệ gen RNA mới sau tổng hợp sẽ được bao gói tạo thành các thế hệ virus con cháu (Barton, Flanegan, 1995; Molla et al., 1991) (Hình 1.4). Trước tiên, RNA ngay lập tức khởi động quá trình dịch mã ở vị trí gần đầu 5’ để tạo thành một polyprotein – tiền thân của các protein chức năng của virus. Polyprotein này ban đầu được phân cắt thành 3 protein tiền chất là P1, P2 và P3. Tiếp theo đó, mỗi protein lại tiếp tục tiến hành phân cắt để tạo ra các sản phẩm protein đặc hiệu có chức năng cụ thể: - P1 được cắt ra tạo thành VP0, VP1 và VP3. Đó là các protein capsid. - P2 được cắt ra tạo thành các kháng nguyên 2A, 2B của vật chủ và 2C tham gia vào quá trình tổng hợp RNA. - P3 tiến hành tự cắt thành 3A, 3B (VPg), 3C (một enzyme dùng để phân cắt hầu hết các protein) và 3D (RNA polymerase làm nhiệm vụ kéo dài chuỗi RNA mới tổng hợp trên khuôn RNA). Để lắp ráp, trước hết virus phân cắt P1 tạo thành một đơn phân gốc (protome) 5S chưa hoàn thiện chứa VP0, VP1 và VP3. Các protome này sẽ liên kết với genome RNA để tạo thành tiền virion (provirion). Trong quá trình hoàn thiện, phần lớn hoặc tất cả các phân tử VP0 đều bị phân cắt tạo thành VP2 và VP4. Sau lắp ráp, virion trưởng Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 11 thành thoát ra khỏi tế bào nhờ sự tan bào (cell lysis). Một số Picornavirus, ví dụ virus viêm gan A (Hepatitis A Virus, HAV) có thể gây nhiễm nhưng không gây ra sự tan bào. Đồng thời với quá trình dịch mã để tổng hợp các protein, RNA của hệ gen virus cũng được nhân lên để tạo thành vật liệu di truyền cho các hạt virus mới. Hệ gen RNA của Picornavirus là các RNA thông tin, chúng có chức năng như là các khuôn mẫu cho quá trình sao chép RNA của virus (Gesteland et al., 1999). Các RNA sợi dương của Picornavirus nhân lên thông qua các RNA sợi âm trung gian được tổng hợp ngay bên trong các phức hợp sao chép gắn trên màng lipid trong bào tương của các tế bào nhân thật của vật chủ (Ahlquist, 2006; Kopek et al., 2007). Điều đặc biệt là trong quá trình nhân lên của các Picornavirus, có sự bất đối xứng giữa số lượng RNA sợi âm trung gian và RNA sợi dương được tổng hợp trong các phức hợp sao chép của virus. Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy, có rất nhiều yếu tố liên quan đến quá trình sao chép RNA, trong đó, đặc biệt đã phát hiện các phân đoạn RNA hoạt hóa có cấu trúc không gian dạng cis, gọi tắt là cis-RNA hoạt hóa (CREs – cis active RNA elements), nằm trong hệ gen của các Picornavirus (Steil, Barton, 2009). Sự góp mặt của các tiểu phần cis-RNA hoạt hóa tham gia vào sự ổn định của các RNA thông tin của virus (Kempf, Barton, 2008), quá trình dịch mã RNA thông tin của virus. Các trình tự cis-RNA (CREs) này tương tác mạnh mẽ với các protein sao chép của virus, gián tiếp tác động lên sự sao chép RNA của virus (Steil, Barton, 2009). Mỗi RNA sợi dương của virus đều được sao chép thành một RNA sợi âm bổ sung và sau đó RNA sợi âm được sao chép thành 40 đến 70 phân tử RNA sợi dương thế hệ con cháu. Cuối cùng, các RNA sợi dương – hệ gen virus được kết hợp với các protein và bao gói thành các hạt virus mới, phá vỡ tế bào (tan bào), thoát ra ngoài tiếp tục xâm nhiễm trên các tế bào thích ứng của vật chủ, khởi động một chu trình mới, giúp cho virus tồn tại và gây ra bệnh lý trên vật chủ của chúng. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 12 Hình 1.4. Quá trình nhân lên của một virus họ Picornaviridae (poliovirus) (Philip, Minor, 2004) 1.1.5. Vị trí xếp loại trong họ Picornaviridae Theo hệ thống phân loại thế giới ICTV (International Committee on Taxonomy of viruses ) năm 2009, họ Picornaviridae bao gồm 24 loài và được nhóm vào 12 chi là Enterovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Kobuvirus, Teschovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Tremovirus và một chi mới là Avihepatovirus (Nicole et al., 2009 ; nguồ n : http://www.Picornaviridae.com/avihepatovirus/dhav.com; OIE 2010) (bảng 1.1). Trong đó virus viêm gan vịt thuộc chi Avihepatovirus. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 13 Bảng 1.1 : Danh sách các chi và loài thuộc họ Picornaviridae Tên chi Enterovirus Hepatovirus Tên loài Type huyết thanh Bovine enterovirus 2 type bao gồm BEV-1 và BEV-2 Human enterovirus A 21 type bao gồm một số Coxsackie A virus và Enterovirus Human enterovirus B 57 type bao gồm Enterovirus, Coxsackie B viruses, Echoviruses và Swine vesicular disease virus Human enterovirus C 14 type bao gồm một số Coxsackie A virus và enterovirus Human enterovirus D 3 type bao gồm EV-68, EV-70, EV-94 Poliovirus 3 type bao gồm PV- 1, PV-2 và PV-3 Porcine enterovirus A 1 type là PEV- 8 Porcine enterovirus B 2 type bao gồm PEV-9 và PEV-10 Simian enterovirus A 1 type làSEVA1 Human rhinovirus A 74 serotype Human rhinovirus B 25 serotype Hepatitis A virus 1 serotype HAV Avian encephalomyelitis1 type AEV like viruses Encephalomyocarditis virus 1 serotype EMCV Cardiovirus Theilovirus 5 type bao gồm Theiler murine encephalomyellitis virus (TMEV), Vilyuisk human encephalomyelitis virus (VHEV), Theiler-like virus (TLV) của chuột, Saffold virus (SAFV) 1 và SAFV-2 Foot-and-mouth disease virus 7 serotype bao gồm O, A, C, Southern African Territories (SAT) SAT 1, SAT 2, SAT 3 và Asia 1 Equine rhinitis A virus 1 serotype: Equine rhinitis A virus (ERAV) Human parechovirus 6 type bao gồm HpeV-1, HpeV-2, HpeV-3, HpeV-4, HpeV-5, HpeV-6 Ljungan virus Có 3 type huyết thanh LV-1, LV-2, LV3 Erbovirus Equine rhinitis B virus 3 typ bao gồm ERBV-1, ERBV-2, ERBV-3 Kobuvirus Aichi virus 1 serotype: Aichi virus (AiV) Aphthovirus Parechovirus Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 14 Bovine kobuvirus 1 serotype: Bovine kobuvirus (BKV) Teschovirus Porcine teschovirus 11 serotype bao gồm các serotype từ PTV-1 đến PTV-11 Sapelovirus Duck Picornavirus Porcine enterovirus Simian Picornavirus 1 Duck Picornavirus (DPV) Porcine enterovirus 8 (PEV 8) Simian Picornavirus 1 (SV 1) Senecavirus Seneca Valley virus Seneca valley virus (SVV) Tremovirus Avian encephalomyelitis Avian encephalomyelitis virus (AEV) Avihepatovirus Duck Hepatitis A Virus 3 type bao gồm DHAV-1, DHAV-2, DHAV-3 1.1.6. Vị trí xếp loại của virus viêm gan vịt Trước đây, dựa vào một số đặc tính của chúng mà virus viêm gan vịt được xếp vào chi Enterovirus trong họ Picornaviridae (Woolcock, 2003). Tuy nhiên, nghiên cứu trong những năm gần đây về sinh học phân tử đã chỉ ra rằng sự xếp loại đó là chưa phù hợp. Ngày nay, với các phương pháp nghiên cứu về sinh học phân tử, toàn bộ hệ gen của một số chủng virus viêm gan vịt trên thế giới đã được xác định. Tất cả các nghiên cứu đều thống nhất rằng virus viêm gan vịt thuộc họ Picornaviridae. Theo công bố của tổ chức Quốc tế về phân loại virus năm 2009 (International Committee of Taxonomy of Virus, ICTV), virus viêm gan vịt DHV-I được xếp vào nhóm Picornavirus và được đặt lại tên thành virus viêm gan vịt type A (DHAV) trong khi DHV-II và DHV-III lại được xếp vào nhóm Astrovirus, với tên gọi duck astrovirus type 1 (DAstV-1) và duck astrovirus type 2 (DAstV-2). Trong số đó, DHAV là nhóm virus độc lực cao nhất và nguy hiểm nhất. Cụ thể, khi đàn vịt dưới ba tuần tuổi nhiễm virus thì tỷ lệ vịt chết có thể lên đến 80% (Nguyễn Phục Hưng, 2004). Virus này phân bố khá rộng và là mối nguy hại cho ngành chăn nuôi vịt. Theo quan điểm phân loại mới này, DHAV là thành viên duy nhất trong chi mới của họ Picornaviridae (chi Avihepatovirus). Bằng các phân tích về cơ chế phát sinh loài và các thử nghiệm trung hòa, DHAV được phân làm 3 genotype. Genotype I (DHAV-1) bao gồm các chủng cổ điển có mặt ở nhiều nơi trên thế giới (Kim et al., 2006; Ding, Zhang, 2007; Tseng et al., 2007). Genotype II (DHAV-2) bao gồm 2 chủng phân lập được ở Đài Loan (Tseng, Tsai, 2007a). Genotype III (DHAV-3) bao gồm các chủng mới được phân lập ở Hàn Quốc, Trung Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 15 Quốc và Việt Nam từ năm 2006 trở lại đây (Kim et al., 2007b ; (http://www.Picornaviridae.com/avihepatovirus/dhav.com, http://www.picornastudygroup.com) (Kim et al., 2009; OIE, 2010, Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2010), với cùng một cấu trúc hệ gen đặc trưng, như sau: 5’UTR-VP0VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR. Không có sự trung hòa chéo giữa DHAV-1 và DHAV-2 (Tseng, Tsai, 2007) và ít có hiện tượng trung hòa chéo giữa DHAV-1 và DHAV-3 (Kim et al., 2007b). Các tác giả đã thống nhất cây phả hệ của họ Picornaviridae có thêm một nhánh mới. Nhánh mới được tạo ra này đã chia Picornavirus thành 12 chi. Trong đó, virus viêm gan vit tạo thành một nhánh riêng độc lập, khác biệt với tất cả các chi Picornavirus khác, nằm ở giữa Parechovirus và Hepatovirus trong cây phả hệ (Tseng, Tsai, 2007b) (Hình 1.5). Để tìm hiểu mối liên quan giữa genotype và serotype, các tác giả đã tiến hành thí nghiệm bằng cách thực hiện phản ứng trung hoà chéo. Kết quả cho thấy, kháng thể của genotype nào thì có khả năng trung hoà kháng nguyên của genotype đó mà thôi. Chính kết quả này đã chứng minh rằng giữa ba genotype cũng có thể có liên quan cả về serotype huyết thanh (Kim et al., 2007). Sự tương đồng về nucleotide và amino acid trong cùng một genotype đạt thấp nhất là 90 - 92%; trong khi giữa genotype khác nhau thì tỷ lệ này không vượt quá 72 - 78%. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 16 Hình 1.5. Cây phả hệ thể hiện liên quan của virus viêm gan vịt với các chi thuộc họ Picornaviridae. Mối quan hệ được xây dựng dựa trên khoảng cách của cây phả hệ nhờ xem xét sự giống nhau về amino acid của phức hệ protein (Tseng et al., 2007). Kết quả phân tích phả hệ dựa trên gen VP1 của các chủng virus viêm gan vịt công bố trên Ngân hàng gen một lần nữa đã khẳng định chắc chắn các chủng virus này thuộc về các genotype khác biệt. Kết quả này cũng trùng với kết quả nghiên cứu đã công bố của Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sự năm 2011 (Đoàn Thị Thanh Hương, 2011) 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH VIÊM GAN VỊT 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bênh ̣ viêm gan viṭ trên thế giới Bệnh viêm gan do virus (Duck Virus Hepatitis) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1945 tại Mỹ trên đàn vịt con một tuần tuổi (Levine, Hofstad, 1945). Đến năm 1950, bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà, Levine và Fabricant đã phân lập được virus viêm gan vịt serotype 1 (Levine, Fabricant, 1950). Dịch bệnh sau đó lan rộng ra cả nước Mỹ. Năm 1965, ở Anh phát hiện bệnh viêm gan vịt xảy ra trên đàn vịt đã được tiêm phòng bằng vaccine nhược độc viêm gan vịt serotype 1. Từ đây đã phân lập ra virus viêm gan vịt serotype 2. Một hiện tượng tương tự cũng xảy ra trên đàn vịt ở Mỹ đã Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 17 được tiêm vaccine nhược độc viêm gan vịt serotype 1. Sau đó người ta phân lập được một chủng viêm gan vịt khác hẳn, đặt tên là virus viêm gan vịt serotype 3. Có nhiều phương pháp định type virus viêm gan vịt, ngoài các phương pháp huyết thanh học như HA, ELISA, hay khuếch tán đĩa thạch thì ngày nay việc định type còn dựa trên nhiều phương pháp sinh học phân tử hiện đại như RT-PCR và RT-LAMP với độ chính xác cao và thời gian thực hiện được rút ngắn. Cụ thể, phương pháp RT-PCR đa mồi đã được sử dụng để phân biệt hiện tượng đồng nhiễm DHAV-1 và DHAV-3 (Chen et al, 2013) trong khi phương pháp RT-LAMP với bộ mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen 2C để nhận biết các chủng virus thuộc DHAV-1. Bằng phản ứng RTLAMP người ta đã phát hiện ra sự có mặt của virus viêm gan vịt DHAV-1 chỉ trong khoảng một giờ thực hiện phản ứng với độ nhạy cao hơn cả phương pháp RT-PCR (Yang et al., 2012). Đến nay, bệnh viêm gan vịt do virus thuộc genotype I và genotype III đã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam. Virus viêm gan vịt không những gây bệnh trên vịt con mà còn trên cả các loài khác như : gà tây, ngỗng, chim cút, trĩ, vịt trời… Phổ biến nhất hiê ṇ nay là virus viêm gan vịt genotype I bao gồm khoảng 60 – 70 chủng đã được phân lập từ năm 1950 đến nay. Virus viêm gan vịt genotype II chỉ gồm có 2 chủng mới phân lập ở Đài Loan và virus viêm gan vịt genotype III gồm các chủng mới phân lập ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam (Stanway et al., 2005; Tseng et al., 2007a; 2007b; Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2010 ; 2011). Trong đó, hiện tượng đồng nhiễm giữa DHAV-1 và DHAV-2 khá phổ biến tại Đài Loan (Tseng, Tsai, 2007). Trong khi tại Trung Quốc, hiện tượng đồng nhiễm lại được công bố là phổ biến giữa DHAV-1 và DHAV-3 (Wei et al., 2012). Đặc trưng của bệnh là vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao. Mổ khám bệnh tích thấy gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên bề mặt gan (Woolcock, 2003b). 1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh viêm gan vịt lần đầu tiên được phát hiện năm 1978, nhưng tại thời điểm này vẫn chưa phân lập được mầm bệnh. Từ năm 1979 đến năm 1984, bệnh đã xảy ra ở nhiều địa phương làm chết nhiều vịt con (Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng, 1985). Bằng phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và phân Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 18 lập virus, các tác giả đã khẳng định vịt chết do nhiễm virus viêm gan vịt (Lê Thanh Hòa et al., 1984). Từ năm 1984 - 1987, bệnh viêm gan vịt đã lan tràn ở nhiều địa phương như Hà Tây, Hòa Bình gây nhiều thiệt hại về kinh tế (Lê Minh Chí et al., 1999; Nguyễn Văn Cảm et al., 2001; Nguyễn Hữu Vũ et al., 2001; Nguyễn Đức Lưu et al., 2002). Tuy nhiên việc nghiên cứu sâu về bệnh viêm gan vịt chưa có nhiều. Năm 1983, từ chủng virus cường độc viêm gan vịt phân lập được tại Phú Xuyên - Hà Sơn Bình (kí hiệu là TT), các tác giả đã cấy truyền 39 đời trên phôi gà và tạo được chủng virus nhược độc VN (Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng, 1985). Năm 1985, quy trình sản xuất vaccine từ 3 chủng virus nhược độc viêm gan vịt: chủng TN của Asplin, E32 của Pháp và VN của Việt Nam đã được xây dựng (Lê Thanh Hòa et al., 1984). Tuy nhiên, hiện nay không thấy sự có mặt của các loại vaccine trên trên thị trường. Theo một số nghiên cứu đã công bố, bệnh viêm gan vịt cho đến nay vẫn xảy ra ở nước ta, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Văn Cảm et al., 2001). Đặc biệt, gần đây nhiều giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta chưa thích ứng được với điều kiện môi trường nên bệnh viêm gan vịt càng xảy ra nhiều hơn, nhất là ở các địa phương là Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long gây tổn thất rất lớn cho ngành chăn nuôi (Nguyễn Hữu Vũ et al., 2001; Nguyễn Đức Lưu et al., 2002). Từ cuối năm 2003, đầu năm 2004, bệnh cúm gia cầm bùng phát, gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi gia cầm cũng như ảnh hưởng đến sức khỏe con người khiến bệnh viêm gan vịt cũng như một số bệnh khác của gia cầm ít được quan tâm chú ý nhiều như trước. Tuy nhiên, trên thực tế bệnh viêm gan vịt vẫn tồn tại và có nhiều biến đổi phức tạp. Trong những năm gần đây, đặc biệt là từ năm 2006 - 2007 đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đi sâu nghiên cứu về sinh học phân tử virus viêm gan vịt và đã đồng loạt đưa ra nhiều công bố khẳng định sự biến đổi mạnh mẽ và khác nhau trong quần thể và hệ gen của virus, đến mức tạo ra một chi mới và các genotype mới trong họ Picornaviridae (Yun et al., 2010). Tuy nhiên, các loại vaccine phòng bệnh viêm gan vịt cho đến nay đều thuộc một loại genotype (DHAV-1). Do đó, việc sản xuất vaccine từ chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype mới là rất cần thiết (Kim et al., 2009). Trong các năm gần đây, các công trình nghiên cứu về virus viêm gan vịt ở Việt Nam không có nhiều và các nghiên cứu này chỉ đi sâu vào nghiên cứu bệnh tích đại Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 19 thể, vi thể của virus gây bệnh, các đặc tính sinh học của virus nhược độc (Bùi Thị Cúc, 2002; Trần Thị Lan Hương, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007) ; có rất ít các nghiên cứu về sinh học phân tử, giải mã hệ gen (Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2011). 1.2.3. Đƣờng xâm nhập và cách lây lan Virus viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ vịt bệnh sang vịt lành, tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao (100%). Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá, hô hấp hoặc qua vết thương (Levine, Fabricant, 1950). Đường lây nhiễm qua không khí của bệnh viêm gan vịt giống với bệnh dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà con. Có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp. Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau đó ít ngày. 1.2.4. Cơ chế gây bệnh Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hoá, hô hấp hoặc vết thương rồi vào máu. Theo máu, virus đến các cơ quan phủ tạng đặc biệt là gan, đây là cơ quan thích hợp nhất đối với virus. Ở giai đoạn đầu, do tác dụng của virus đã khiến trao đổi chất ở gan bị rối loạn. Kiểm tra tổ chức học cho thấy lượng glycogen trong gan giảm mạnh nhưng lượng lipid lại tăng cao do quá trình trao đổi lipid ở gan mà đặc biệt là trao đổi cholesterol bị ức chế. Vì vậy, vịt con ở thời kỳ mới nở thiếu năng lượng dẫn đến sức đề kháng của chúng bị giảm sút. Giai đoạn thứ hai, virus trực tiếp phá hoại tế bào gan, tế bào nội mô huyết quản, gây xuất huyết đặc trưng. Sự có mặt của virus DHAV còn ảnh hưởng tới cơ chế điều hòa phiên mã, cụ thể là quá trình methyl hóa DNA. Quá trình này làm tăng sự có mặt của tế bào CD8A trong tuyến ức, phổi, lách và gan nhưng giảm ở thận và các cơ (Xu et al., 2014). Virus nhân lên trong tế bào gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kuffer (một loại đại thực bào phân bố ở thành xoang mạch máu của gan). Khi kiểm tra cho thấy tổ chức gan bị phá hoại, cơ thể không được giải độc làm con vật chết do ngộ độc (Phạm Văn Ty, 2007 ; Bùi Thanh Khiết, 2007). 1.2.5. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau từ 1 đến 2 giờ mắc bệnh, vịt bị chứng xanh tím niêm mạc, rối loạn vận động, co giật, vịt chỉ ngồi, sau đó nằm la liệt, nghiêng sườn Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 20 và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, đầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngoẹo sang bên sườn (hình 1.6). Mổ khám bệnh tích phát hiện gan vịt bệnh thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ. Trong một số trường hợp gan vịt bệnh bị nhũn có hình thái như gelatin. Bề mặt gan loang lổ do có nhiều điểm xuất huyết, xuất huyết lan rộng không có ranh giới, kích thước và hình dạng to nhỏ khác nhau . Tuy nhiên, hiê ̣n tươ ̣ng xuất huyết trên bề mặt gan không phải có ở tất cả vịt chết do bệnh viêm gan virus (Nguyễn Đức Lưu, Vũ Như Quán, 2002; Nguyễn Văn Cảm et al., 2001). B A Hình 1.6. Tư thế chết điển hình của vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt và hình ảnh gan vịt nhiễm virus. A: Hình ảnh vịt chết khi nhiễm virus viêm gan vịt. B: Gan vịt xuất huyết khi mắc bệnh (Nguồn: www.as2.nchu.edu.tw). 1.2.6. Vaccine phòng bệnh Biện pháp quan trọng nhất để khống chế dịch bệnh là dùng vaccine tạo miễn dịch cho đàn vịt (Tripathy, Hanson, 1986; Davis et al., 1987). Vaccine phòng bệnh viêm gan vịt có 2 loại gồm vaccine nhược độc và vaccine vô hoạt. - Vaccine nhược độc: Vaccine viêm gan vịt nhược độc được sản xuất từ virus cường độc dưới tác động của các yếu tố sinh học. Virus cường độc được tiêm truyền nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi, thì độc lực của virus giảm đi. Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên được dùng để làm vaccine. Virus viêm gan vịt độc lực thường được cấy truyền nhiều đời trên phôi gà để giảm độc tính sau đó virus này được dùng làm vaccine. - Vaccine vô hoạt: Vaccine viêm gan vịt vô hoạt được sản xuất từ virus viêm gan vịt bằng cách nuôi cấy virus trên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn