Tài liệu đồng phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp in silico microarray

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -------------------- BÙI KHẮC HOÀNG VŨ ĐỒNG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SILICO MICROARRAY Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 420 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2015 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Chữ ký : ................................................ Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS Đỗ Phúc Chữ ký : .................................................. Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS. Võ Đình Lệ Tâm Chữ ký : ................................................. Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 08 tháng 08 năm 2015 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1. PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng – Chủ tịch 2. TS Huỳnh Ngọc Oanh – Thư ký 3. PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn - Ủy viên 4. PGS.TS Đỗ Phúc – Phản biện 1 5. TS Võ Đình Lệ Tâm – Phản biện 2 Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do- Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên học viên: Bùi Khắc Hoàng Vũ MSHV: 13310322 Ngày, tháng, năm sinh: 21/01/1990 Nơi sinh: Lâm Đồng Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 420 201 I. Tên đề tài: “Đồng phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp in silico microarray” II. Nhiệm vụ và nội dung:  Xây dựng cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA cũng như từ sự kết hợp của một số vùng siêu biến đổi phù hợp nhất để phát hiện các vi sinh vật gậy bệnh phổ biến trong thực phẩm.  Lựa chọn hệ mẫu dò đặc hiệu cho các vùng biến đổi đã lựa chọn và đánh giá tác động của các vùng biến đổi này đến đồng phát hiện các vi sinh vật gây phổ biến trong thực phẩm bằng phương pháp microarray.  Thiết kế cặp mồi chung phù hợp với các vùng siêu biến đổi lựa chọn được. III. Ngày giao nhiệm vụ: 07/07/2014 IV. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 10/05/2015. V. Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương. Tp. HCM, ngày … tháng … năm 2015 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thầy của tôi – PGS. TS Nguyễn Thúy Hương, người đã không quản mọi khó khăn để hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn cũng như chương trình cao học. Tôi đã học được ở cô sự yêu nghề, nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm cũng như sự bao dung và lòng vị tha. Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học, bộ môn Công nghệ thực phẩm- Trường Đại học Bách Khoa đã động viên va giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin cảm ơn anh Lê Thành Điền, chị Đỗ Thị Bích Phượng, bạn Nguyễn Minh Trí – học viên cao học ngành Công nghệ sinh học khóa 2013 đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẽ trong suốt quá trình học tập và làm luận văn tại trường. Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến anh Võ Văn Giàu – Đại học Công nghiệp thực phẩm, anh Hà Minh Luân – Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, chị Trần Thị Như Hoa – Đại học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và chia sẽ không chỉ về mặt chuyên môn mà còn về các khía cạnh khác của cuộc sống. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình đã luôn khích lệ, động viên tôi về mặt vật chất lẫn tinh thần để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu và đi theo con đường mình đã chọn. TÓM TẮT Để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, kiểm nghiệm bằng phương pháp microarray đang là một trong những hướng tiếp cận chủ yếu trong những năm gần đây. Trình tự mã hóa cho 16S ribosomal RNA là một trong những gene thường dùng nhất trong định danh vi sinh vật nói chung và trong kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phầm bằng phường pháp microarray nói riêng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích về mặt lý thuyết tác động của các vùng biến đổi của gene 16S rRNA và sự kết hợp giữa chúng trong định danh một số vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm. Từ đó lựa chọn hệ mẫu dò đặc hiệu và thiết kế mồi chung nhằm mục tiêu đồng phát hiện 15 tác nhân gây bệnh trong thực phẩm chủ yếu. Kết quả của nghiên cứu đã xác nhận gene 16S ribosomal RNA có thể phân biệt 9 tác nhân gây bệnh đến mức độ loài (Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Campylobater jejuni, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus và Yersinia enterocolitica). Các tác nhân gây bệnh có thể phân biệt đến mức độ dưới chi nhưng chưa đến loài bao gồm nhóm Bacillus cereus, nhóm Campylobacter jejuni/Campylobacter coli và nhóm Yersinia pestis/Yersinia pseudotuberculosis. Các tác nhân khác hoàn toàn không thể phát hiện được do mức độ tương đồng cao giữa chúng với các vi sinh vật cùng chi và loài bao gồm các loài thuộc Salmonella spp., Shigella spp. và Vibrio parahaemolyticus. Nghiên cứu này cũng xác nhận sự kết hợp giữa các vùng biến đổi V1-V2-V3 và các vùng biến đổi V6-V7-V8 là tốt nhất trong phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Có 35 mẫu dò đặc hiệu được lựa chọn và 2 cặp mồi chung được thiết kế nhằm sử dụng các vùng biến đổi này vào phát hiện vi sinh vật gây chủ yếu trong thực phẩm bằng kỹ thuật microarray trên thực nghiệm. SUMMARY To ensure food safety, detection by microarray method is one of the most trending approaches in recent years. 16S ribosomal RNA gene is one of the most common genes using in identification bacteria and detection major foodborne pathogens. In this research, we analyzed the effect of variable regions of 16S rRNA gene and the combination between them on simultaneous detect foodbone pathogens. Specific probes and design primers were selected and designed from the suitable regions for the goal of study. In the output, we confirmed that 16S ribosomal RNA could distinguish 9 pathogens to species level (including Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica). The groups of pathogens which could be differentiated to below genus level but still upper species level were Bacillus cereus group, Campylobacter jejuni/Campylobacter coli group and Yersinia enterolitica/ Yersinia pseudotuberculosis group. Other pathogens which could not be distinguished to genus level or species level due to high similarities with their related organisms are Salmonella spp., Shigella spp. and Vibrio parahaemolyticus. This study also shown that the combination between V1, V2 and V3 regions and between V6, V7 and V8 regions were the best options for foodborne pathogens detection. Finally, 35 specific probes were chosen and 2 pairs of primers were designed for detection and identificarion of foodborne pathogens in practical situations. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, hình ảnh và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Bùi Khắc Hoàng Vũ MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .........................................................................................................i DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... iii DANH MỤC VIẾT TẮT .............................................................................................. iv MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3 1.1 Tổng quan tình hình ngộ độc thực phẩm ............................................................ 3 1.2 Các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm ............................................ 4 1.2 ................................................................................................................................. 4 1.2.1 Esherichia coli ............................................................................................. 4 1.2.2 Salmonella ................................................................................................... 6 1.2.3 Shigella ........................................................................................................ 8 1.2.4 Campylobacter ........................................................................................... 10 1.2.5 Listeria monocytogenes ............................................................................. 12 1.2.6 Staphylococcus aureus ............................................................................... 13 1.2.7 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus................ 15 1.2.8 Clostridium botulinum và Clostridium perfringens ................................... 19 1.2.9 Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis và Yersinia pestis .. 21 1.2.10 Bacillus cereus ........................................................................................... 24 1.3 Các phương pháp chủ yếu trong kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm .......................................................................................................................... 26 1.3.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống .......................................................... 26 1.3.2 Phương pháp ELISA .................................................................................. 26 1.3.3 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ..................................... 27 1.3.4 Phương pháp microarray............................................................................ 28 1.4 Tổng quan về 16S Ribosomal RNA ................................................................. 30 1.5 Tổng quan về các nghiên cứu liên quan ........................................................... 32 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 36 2.1 Vật liệu ............................................................................................................. 36 2.1.1 Trình tự gene 16S ribosomal RNA của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu ... .................................................................................................................... 36 2.1.2 Các vùng biến đổi của gene 16S ribosomal RNA ..................................... 36 2.1.3 Các cơ sở dữ liệu dùng trong nghiên cứu .................................................. 37 2.1.4 Các phần mềm và công cụ tin sinh học sử dụng trong nghiên cứu ........... 37 2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 41 2.2.1 Sơ đồ tổng quát .......................................................................................... 41 2.2.2 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 49 3.1 Trình tự 16S ribosomal RNA được sử dụng trong nghiên cứu ........................ 49 3.2 Kết quả sắp gióng cột đa trình tự và xác nhận các vùng bảo tồn, vùng biến đổi của 16S ribosomal RNA ............................................................................................. 50 3.3 Kết quả xây dựng cây sinh loài từ các vùng biến đổi và so sánh với cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA của tất cả các vi sinh vật mục tiêu ....... 53 3.4 Kết quả lựa chọn mẫu dò đặc hiệu và ảnh hưởng của các vùng biến đổi đến phát hiện các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm ..................................... 58 3.5 Kết quả thiết kế mồi chung ............................................................................... 64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 66 4.1 Kết luận............................................................................................................. 66 4.2 Kiến nghị .......................................................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 68 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 75 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Escherichia coli O157:H7 ...... 6 Hình 1.2: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Salmonella enterica ................ 8 Hình 1.3: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Shigella flexneri .................... 10 Hình 1.4: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Campylobacter jejuni ........... 11 Hình 1.5: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Listeria monocytogenes ........ 13 Hình 1.6: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Staphylococcus aureus ......... 15 Hình 1.7: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus ........................................................................ 18 Hình 1.8: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Clostridium botulinum và Clostridium perfringens ............................................................................................... 20 Hình 1.9: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis và Yersinia pestis.......................................................................... 24 Hình 1.10: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Bacillus cereus .................... 25 Hình 1.11: Trình tự các bước thực hiện căn bản của phương pháp microarray .......... 29 Hình 1.12: Cây sinh loài xây dựng dựa trên so sánh trình tự 16S, thể hiện mối quan hệ giữa ba nhánh chính trong tự nhiên bao gồm Archaea, Bacteria và Eucaya ............... 30 Hình 3.1: Vị trí các vùng biến đổi từ V1 đến V8 của 16S ribosomal RNA ................ 53 Hình 3.2: Cây sinh loài xây dựng từ toàn bộ trình tự gene 16S rRNA của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu ........................................................................................................ 55 Hình 3.3: Cây sinh loài xây dựng từ vùng V1 đến V3 của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu ................................................................................................................................ 56 Hình 3.4: Cây sinh loài xây dựng từ vùng V4 đến V5 của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu ................................................................................................................................ 57 i Hình 3.5: Cây sinh loài xây dựng từ vùng V6 đến V8 của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu ................................................................................................................................ 58 Hình 3.6: Vị trí SNP phân biệt Campylobacter jejuni với C.coli, C. curvus và C. fetus và vị trí SNP phân biệt Vibrio vulnificus với V. cholera và V. parahaemolyticus ...... 64 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tình hình ngộ độc tại Việt Nam từ năm 2007 đến 2012 ............................... 4 Bảng 2.1: Vị trí các vùng biến đổi của gene 16S ribosomal RNA dựa trên Escherichia coli O157:H7 ................................................................................................................ 36 Bảng 3.1: Danh sách các trình tự được tài từ GenBank được sử dụng trong nghiên cứu ...................................................................................................................................... 49 Bảng 3.2: Vị trí các vùng bảo tồn cao của gene 16S ribosomal RNA ......................... 50 Bảng 3.3: Vị trí các vùng biến đổi của gene 16S ribosomal RNA .............................. 50 Bảng 3.3: Kết quả lựa chọn mẫu dò đặc hiệu cho vùng biến đổi V1-V3 .................... 60 Bảng 3.4: Kết quả lựa chọn mẫu dò đặc hiệu cho vùng biến đổi V6-V8 .................... 61 Bảng 3.5: Tác động của một số vùng biến đổi đến phân biệt vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng microarray ......................................................................................... 63 Bảng 3.6: Kết quả thiết kế mồi chung .......................................................................... 65 iii DANH MỤC VIẾT TẮT BLAST: Basic Local Alignment Search Tool bp.: base pair CDC: Centers for Disease Control and Prevention CFU: Colony-forming unit CSDL: Cơ sở dữ liệu DNA: Deoxyribonucleic acid ECDC: European Centers for Disease and Control EFSA: European Food Safety Authority ELISA: Enzyme linked-immusorbemt assay FDA: United States of America’s Food and Drug administration PCR: Polymerase chain reaction RDP: Ribosomal Database Project RNA: Ribonucleic acid rRNA : ribosomal ribonucleic acid WHO: World Health Organization SNP: Single-nucleotide polymorphism iv MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU Ô nhiễm thực phẩm hiện hiện diễn biến hết sức nghiêm trọng, đặt ra nhu cầu phải có phương pháp phát hiện nhanh cùng lúc nhiều vi sinh vật gây bệnh cùng lúc nhanh, chính xác và có độ tin cậy cao. Trong những năm gần đây, sự phát triển của kỹ thuật microarray ngày càng dược quan tâm do có thể đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm nhanh chóng với độ chính xác và độ nhạy cao với hai bước chính: (1) thực hiện phản ứng PCR với mồi chung, mồi riêng, hoặc kết hợp mồi chung với mồi riêng; (2) lai sản phẩm PCR với mẫu dò đặc hiệu cho từng chủng vi sinh vật cụ thể. Điều này giúp cho về mặt lý thuyết, có thể phát hiện cùng lúc hàng chục các vi sinh vật khác nhau. Do đó mà phương pháp này hiện nay là một trong những hướng tiếp cận chủ yếu hiện nay trong đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh. Một trong những yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến thành công của kỹ thuật microarray trong đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm là chọn ra trình tự phù hợp để thiết kế mồi và lựa chọn mẫu dò đặc hiệu. Trong đó, gene mã hóa cho 16S ribosomal RNA hiện nay được xem là tiêu chuẩn mới trong định danh vi sinh vật nói chung và vi sinh vật gây bệnh nói riêng. Lý do là cơ sở dữ liệu về trình tự này tương đối đầy đủ, trong khi các ứng viên khác như vùng trung gian 16S-23S tuy có mức độ biến đổi cao tuy nhiên lại quá ngắn. Vùng 23S được cho là có độ đa dạng cao nhất thì thông tin về trình tự này trên các cơ sở dữ liệu vẫn chưa được đầy đù. Do đó gene 16S ribosomal RNA hiện vẫn là lựa chọn tốt nhất trong việc định danh và phát hiện vi sinh vật. Tuy nhiên, các nghiên cứu liên quan hiện vẫn chưa thống nhất được về khả năng và số lượng vi sinh vật có thể phân biệt bằng phương pháp microarray sử dụng trình tự 16S ribosomal RNA. Ngoài ra, do quá trình cập nhật, thay đổi, điều chỉnh các cơ sở dữ liệu, hệ mẫu dò đặc hiệu của một số nghiên cứu trước đây không còn phù hợp nữa, và có khả năng dẫn đến các kết quả sai nếu áp dụng vào thực tế. Điều này đặt ra vần đề Trang 1 cần thiết phải đánh giá lại về mặt lý thuyết khả năng của gene 16S cũng như các vùng biến đồi tiêu biểu của chúng đến đồng phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm theo FDA bằng phương pháp microarray nhằm ứng dụng vào thực tế đạt hiệu quả cao nhất. Từ mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu : “Đồng phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp in silico microarray” Nghiên cứu được tiến hành cùng với những nội dung chính sau:  Xây dựng cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA cũng như từ sự kết hợp của một số vùng siêu biến đổi phù hợp nhất và so sánh chúng với nhau nhằm tìm ra vùng siêu biến đổi phù hợp nhất để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu.  Lựa chọn hệ mẫu dò đặc hiệu cho các vùng siêu biến đổi đã lựa chọn và đánh giá tác động của các vùng siêu biến đổi này đến đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh thường gặp trong thực phẩm bằng phương pháp microarray.  Thiết kế cặp mồi chung phù hợp với các vùng siêu biến đổi lựa chọn được. Trang 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình ngộ độc thực phẩm Theo Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (U.S. Food and Drug Administration – FDA), các tác nhân vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm bao gồm: Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Vibrio chloerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens và Clostridium botulinum [1] . Ở Mỹ, theo thống kê của Elain Scallan et al. (2011) ở Mỹ thực hiện tại Trung tâm kiểm soát và phòng chống dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention), Aurora, Colorado thì hàng năm 31 chủng gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm gây ra 9,4 triệu ca ngộ độc, trong đó có 55,961 ca phải nhập viện và 1,351 trường hợp tử vong. Trong đó khoảng 58% ca ngộ độc gây ra bởi virus, tiếp đó là Salmonella spp. (11%), Clostridium perfringens (10%) và Campylobacter spp. (9%). Trong số các ca phải nhập viện, nguyên nhân dẫn đầu là do nhiễm Salmonella spp. (35%),tiếp đến là virus (26%), Campylobacter spp. (15%) và Toxoplasma gondii (8%). Trong số các ca tử vong, dẫn đầu vẫn là Salmonella spp. (28%), tiếp đến là T.gondii (24%), Listerichia monocytogenes (19%) và các loại virus (11%) [2]. Trong khi đó, tại Châu Âu, theo báo cáo của Cơ quan An toàn thực phẩm Châu Âu (European Food Safety Authority EFSA) và Trung tâm kiểm soát và phòng chống dịch bệnh Châu Âu (European Centre for Disease Prevention and Control - ECDC) trong năm 2011, ghi nhận 5,648 ca ngộ độc gây ra chủ yếu bởi Salmonella spp., các độc tố vi khuẩn, Campylobacter spp. và các loại virus, thực phẩm chủ yếu gây ngộ độc bao gồm trứng, thức ăn hỗn hợp và hải sản [3]. Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê đến năm 2012 của Cục An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, năm 2007 xảy ra nhiều nhất với tổng số 247 vụ với tổng số ca ngộ độc là 7,329; số nhập viện là 5,584; gây tử vong 55 ca. Năm 2008 giảm xuống còn 205 vụ nhưng số Trang 3 ca ngộ độc, số nhập viện và số tử vong gia tăng lần lượt là 7,829; 6,526 và 62 ca, cao nhất trong cả giai đoạn. Từ năm 2009 đến năm 2012, chỉ trừ năm 2010, xu hướng ngộ độc thực phẩm nhìn chung có xu hướng giảm ở cả ba khía cạnh là tổng số vụ, số ca, số nhập viện và số tử vong, điều này cho thấy nổ lực của các cơ quan có thẩm quyền cũng như ý thức của người dân ngày một tốt hơn trong những năm gần đây. Tuy nhiên tình hình ngộ độc ở Việt Nam vẫn hết sức nghiêm trọng, do đó vấn đề cần đặc biệt lưu tâm là phải đề ra được chiến lược tốt nhất để đảm bảo nguồn cung thực phẩm có chất lượng cao và đảm bảo đủ an toàn trước khi đưa ra thị trường. Bên cạnh đó, khi ngộ độc thực phẩm xảy ra, cần phải có phương pháp nhanh chóng xác định chính xác tác nhân gây ngộ độc nhằm đưa ra phác đồ điều trị riêng cho từng bệnh nhận, tránh các biến chứng nghiêm trọng do ngộ độc gây ra [4]. Bảng 1.1: Tình hình ngộ độc tại Việt Nam từ năm 2007 đến năm 2012 [4] STT Năm Tổng số vụ Số ca Số nhập viện Số tử vong 1 2007 247 7329 5584 55 2 2008 205 7829 6525 62 3 2009 152 5212 4137 35 4 2010 175 5664 3978 51 5 2011 148 4700 3663 27 6 2012 168 5541 4335 34 1.2 Các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm 1.2.1 Esherichia coli 1.2.1.1 Đặc điểm phân loại Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, hình que (1-2µ chiều dài), hiếu khí và có khả năng di động. Một số chủng gây bệnh có khả năng chịu acid. Đa phần các chủng E. Trang 4 coli không gây độc và nguy hiểm cho con người và động vật. E. coli là đối tượng vi sinh vật chủ yếu trong nghiên cứu sinh lý học, trao đổi chất, quy luật di truyền, truyền tín hiệu và cấu trúc chức năng của vách tế bào. Triệu chứng nhiễm các chủng E.coli gây bệnh bao gồm viêm dạ dày, viêm ruột, lỵ, hội chứng nhiễm độc urê (hemolytic uremic syndorome - HUS), hội chứng nhiễm trùng đường tiết niệu (urinary tract infection - UTI), nhiễm trùng máu, viêm phổi và viêm màng não. Các ca ngộ độc gia tăng trong các năm gần đây chủ yếu liên quan đến các chủng enterohemorrhagic E. coli chủ yếu do tiêu thụ thịt, rau quả thối. E. coli thuộc họ Enterobacteriacea, thường gặp trong nhóm vi sinh vật đường ruột của động vật máu nóng. Chúng được thải vào trong môi trường thông qua phân và gây ô nhiễm đất và nước, có thể ảnh hưởng đến rau quả nếu phân sử dụng cho tưới tiếu không được xử lý cẩn thận. Thịt cũng có thể bị nhiễm E. coli do quá trình giết mổ có tiếp xúc với phân. Lớp kháng nguyên O quyết định nhóm huyết thanh của E. coli. Kháng nguyên O có chứa lipopolysaccharide (LPS), có tất cả 174 kháng nguyên O, được đánh số từ 1-181, bỏ qua các số 31, 47, 67, 72, 93, 94 và 122. Ngoài ra còn có 53 kháng nguyên kiểu H hay kháng nguyên tiêm mao (flagellar antigens) (H1-H53) và 80 kháng nguyên kiểu K hay kháng nguyên vỏ (capsular antigen). Chủng không có tiêm mao và không có khả năng di động. E. coli có thể có nhiều kiểu kết hợp kháng nguyên khác nhau, trong đó kháng nguyên “O” giúp xác định nhóm kháng nguyên trong khi “H” giúp xác định kháng nguyên. Tuýp gây độc (virotype) hay tuýp gây bệnh (pathotype) được xác định dựa trên sự hiện diện của các yếu tố gây độc và tác động của chúng đối với tế bào hoặc mô động vật như bám dính, xâm nhiễm và sản sinh độc tố. Các chủng E. coli gây độc chia làm 6 tuýp gây độc bao gồm: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli Trang 5