Tài liệu đồ án tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme bromelain từ dứa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH    ĐỀ TÀI: TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ NGÀNH : 111 GVHD: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH : PHAN THỊ HUỲNH NHƯ MSSV : 106111023 LỚP : 06 DSH TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập và bồi dưỡng tại trường. Em vô cùng biết ơn sự dìu dắt và hướng dẫn nhiệt tình của toàn thể quý Thầy Cô trong Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học cùng quý Thầy Cô trực tiếp giảng dạy em trong suốt bốn năm qua, những người đã truyền thụ kiến thức quan trọng để em có thể thực hiện tốt Đồ án tốt nghiệp này. Em xin đặc biệt chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng và Cô Đỗ Thị Tuyến đã tạo điều kiện cho em làm Đồ án tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM và đã tận tình hướng dẫn, động viên em trong suốt thời gian làm Đồ án tốt nghiệp tại đây. Em xin cảm ơn các anh chị phụ trách phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM đã cung cấp nhiều kiến thức bổ ích. Chân thành cảm ơn tập thể lớp 06DSH đã giúp đỡ, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực tập tại trường. Cuối cùng con xin gởi lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Ba Mẹ và mọi người trong gia đình đã luôn ở bên con chăm sóc, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong suốt quá trình học tập. TP HCM, ngày 1 tháng 7 năm 2010 SVTH: Phan Thị Huỳnh Như NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. .................................................................................................................................. Điểm số bằng số:_______________ Điểm số bằng chữ:____________ TPHCM, ngày tháng năm 2010. GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự do – Hạnh phúc TPHCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CNSH NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HỌ VÀ TÊN: PHAN THỊ HUỲNH NHƯ ............................. MSSV: 106111023 ............ NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC.............................. LỚP: 06DSH .................. 1. Đầu đề đồ án: TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA 2. Nhiệm vụ (yêu cầu nội dung và số liệu ban đầu) ................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................ 3. Ngày giao đồ án: ............................................................................................................. 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: ............................................................................................ 5. Họ tên người hướng dẫn: 1. PGS TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG 2. CN. ĐỖ THỊ TUYẾN 6. Phần hướng dẫn: a. ................................................................................................................................. b. ................................................................................................................................. c. ................................................................................................................................. d. ................................................................................................................................. Nội dung và yêu cầu ĐATN đã được thông qua bộ môn Ngày tháng năm 20…. Chủ nhiệm bộ môn Người hướng dẫn chính (ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên) MỤC LỤC TRANG CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................... 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1 1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát .............................................................................. 2 1.2.1. Mục tiêu cụ thể ................................................................................... 2 1.3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU ............................................................................. 2 1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 3 1.4.1. Nghiên cứu lý thuyết ............................................................................ 3 1.4.2. Nghiên cứu thực nghiệm ...................................................................... 3 1.5. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................ 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .............................. 4 2.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA............................................................................... 4 2.1.1. Lịch sử và sự phát triển của cây dứa .................................................. 4 2.1.2. Thành phần dinh dưỡng trong dứa ....................................................... 5 2.1.3. Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain ................... 6 2.1.3.1. Quả ............................................................................................ 6 2.1.3.2. Thân ........................................................................................... 6 2.1.3.3. Lá .............................................................................................. 6 2.1.3.4. Rễ .............................................................................................. 6 2.2. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME ......................................................... 7 2.3. ENZYME PROTEASE..................................................................................... 8 2.3.1. Giới thiệu sơ lược các enzyme protease ............................................... 8 2.3.1.1. Protease vi sinh vật ..................................................................... 8 2.3.1.2. Protease động vật ........................................................................ 9 2.3.1.3. Protease thực vật ....................................................................... 10 2.3.2. Ứng dụng của enzyme protease .......................................................... 10 2.4. ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA......................................... 11 2.4.1. Giới thiệu enzyme bromelain ............................................................. 11 2.4.2. Tính chất vật lý của enzyme bromelain ............................................. 11 2.4.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain .......................................... 12 2.4.3.1. Cấu tạo hoá học ........................................................................ 12 2.4.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain .......................................... 13 2.4.4. Hoạt tính của enzyme bromelain ....................................................... 13 2.4.4.1. Cơ chế tác động ........................................................................ 14 2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain .......... 14 2.4.5. Ứng dụng của enzyme bromelain ...................................................... 16 2.4.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm .................................................. 16 2.4.5.2. Trong y dược học ...................................................................... 17 2.4.5.3. Một số enzyme bromelain thương mại ..................................... 17 2.4.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain .... 18 2.4.6.1. Nghiên cứu trong nước ............................................................. 18 2.4.6.2. Nghiên cứu ngoài nước ............................................................. 18 2.5. KĨ THUẬT CƠ BẢN CHUẨN BỊ DỊCH PROTEIN THÔ ........................... 19 2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN ........................................................ 19 2.6.1. Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác nhau .............................. 19 2.6.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ ................................................................ 20 2.6.3. Tủa bằng điểm đẳng nhiệt ................................................................. 20 2.6.4. Tủa bằng các loại polymer ................................................................. 20 2.6.5. Tủa bằng các chất đa điện phân ......................................................... 21 2.7. SỰ CỐ ĐỊNH ENZYME ................................................................................. 21 2.7.1. Định nghĩa enzyme cố định ............................................................... 21 2.7.2. Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định ...................................... 21 2.7.2.1. Ưu điểm .................................................................................... 21 2.7.2.2. Nhược điểm .............................................................................. 22 2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định ........................ 22 2.7.4. Các phương pháp cố định enzyme ..................................................... 23 2.7.4.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định.................. 23 2.7.4.2. Phương pháp hấp thụ vật lí ....................................................... 24 2.7.4.3. Phương pháp nhốt ..................................................................... 24 2.7.4.4. Phương pháp khâu mạch........................................................... 25 2.7.5. Đặc điểm, tính chất của Natrialginate................................................ 25 2.7.6. Ứng dụng của enzyme cố định .......................................................... 26 2.7.6.1. Trong công nghiệp .................................................................... 26 2.7.6.2. Trong y học ............................................................................... 26 2.7.6.3. Trong nghiên cứu khoa học ...................................................... 27 2.7.6.4. Trong bảo vệ môi trường .......................................................... 27 2.7.7. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước............................... 27 2.7.7.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................. 27 2.7.7.2. Tình hình nghiên cứu nước ngoài ............................................. 28 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................... 29 3.1. VẬT LIỆU ..................................................................................................... 29 3.1.1. Chế phẩm enzyme thô ....................................................................... 29 3.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 30 3.1.3. Thiết bị ............................................................................................... 30 3.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ................................................................... 31 3.2.1. Chiết thô enzyme từ chế phẩm dứa .................................................... 31 3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme thô ...................................................................................... 32 3.2.2.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford ....... 33 3.2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano ............ 35 3.2.3. Tách enzyme bằng các phương pháp tủa bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton(CH3COCH3).................................. 39 3.2.3.1. Nguyên tắc ................................................................................ 39 3.2.3.2. Phương pháp thí nghiệm tủa enzyme bằng cồn 960 ................. 39 3.2.3.3. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng muối Ammonium sulfate ... 40 3.2.3.4. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng aceton ................................. 41 3.2.4. Phương pháp xác định tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỉ lệ aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain ........................................................... 42 3.2.5. Phương pháp xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme bromelain. ........................................................................... 42 3.2.5.1. Xác định pH tối ưu cho hoạt động của bromelain .................... 42 3.2.5.2. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của bromelain ............ 42 3.2.5.3. Khảo sát độ bền nhiệt ............................................................... 43 3.2.6. Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt.......................................................................................................... 43 3.2.6.1. Tạo dung dịch Natrialginate 3% ................................................ 43 3.2.6.2. Tiến hành cố định ...................................................................... 43 3.2.6.3. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định.......................................................... 43 3.2.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate. ................................. 44 3.2.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH ...................................................... 44 3.2.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.............................................. 45 3.2.7.3. Khảo sát độ bền nhiệt ............................................................... 45 3.2.8. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate ..... 45 3.2.9. Bước đầu tinh sạch enzyme bromelain chồi dứa bằng sắc ký lọc gel 46 3.2.9.1. Nguyên tắc ................................................................................ 46 3.2.9.2. Thiết bị và hóa chất ................................................................... 46 3.2.9.3. Các bước tiến hành ................................................................... 47 3.2.9.4. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel ............................................... 49 3.2.10. Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di SDS - PAGE ........................................................................................ 49 3.2.10.1. Nguyên tắc .............................................................................. 50 3.2.10.2. Thiết bị và hóa chất ................................................................. 50 3.2.10.3. Phương pháp ........................................................................... 52 3.2.10.4. Xác định trọng lượng phân tử của protein .............................. 54 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........................................................ 55 4.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN DỊCH CHIẾT THÔ CÁC BỘ PHẬN TRÊN QUẢ DỨA. ................................................. 55 4.2. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ CỒN 960 .... 56 4.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là cồn 960 ........................................................................................................ 56 4.2.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa cồn với tỉ lệ 1 dứa : 4 cồn .................................. 58 4.2.2.1. pH tối ưu ................................................................................... 58 4.2.2.2. Nhiệt độ tối ưu .......................................................................... 59 4.2.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt ............................................................... 60 4.3. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ MUỐI AMMONIUM SULFATE ....................................................................................... 61 4.3.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) ....................................................... 61 4.3.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa muối với nồng độ 60%....................................... 62 4.3.2.1. pH tối ưu ................................................................................... 62 4.3.2.2. Nhiệt độ tối ưu .......................................................................... 63 4.3.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt ............................................................... 64 4.4. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ ACETON (CH3COCH3) ........................................................................................................... 66 4.4.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là aceton (CH3COCH3) ................................................................................... 66 4.4.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa aceton với tỉ lệ 1 dứa : 5 aceton ......................... 67 4.4.2.1. pH tối ưu ................................................................................... 67 4.4.2.2. Nhiệt độ tối ưu .......................................................................... 68 4.4.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt ............................................................... 69 4.5. SO SÁNH VIỆC TỦA ENZYME BROMELAIN TRONG CỒN 960, MUỐI AMMONIUM SULFATE VÀ ACETON ............................................................... 70 4.6. CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TRÊN NATRIALGINATE ................ 71 4.6.1. Kết quả quá trình cố định enzyme bromelain trên chất mang Natrialginate.................................................................................................... 71 4.6.2. Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme bromelain trên gel Natrialginate ..................................................................... 71 4.6.3. So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định ................................................. 72 4.6.4. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH, nhiệt độ và độ bền nhiệt .................................................................................. 72 4.6.4.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo pH ...................... 72 4.6.4.2. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo nhiệt độ .............. 74 4.6.4.3. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo độ bền nhiệt ....... 75 4.6.5. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate ..... 76 4.6.6. So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu trước khi cố định và enzyme cố định trên Natrialginate ............................................................. 78 4.7. TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100................... 79 4.7.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước khi tinh sạch......... 79 4.7.2. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel với các thông số ................... 79 4.7.3. Tinh sạch enzyme đã tủa với cồn 960 ................................................ 79 4.7.4. Tinh sạch enzyme đã tủa với muối Ammonium sulfate .................... 80 4.7.5. Tinh sạch enzyme đã tủa với aceton .................................................. 82 4.7.6. So sánh kết quả giữa chế phẩm enzyme thô và dịch enzyme sau khi đã qua quá trình sắc ký lọc gel ............................................................................ 83 4.8. KẾT QUẢ PHÂN TÁCH HỆ ENZYME BROMELAIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS - PAGE ................................................................................. 84 4.8.1. Thành phần mẫu điện di .................................................................... 84 4.8.2. Kết quả điện di ................................................................................... 84 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 87 5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 87 5.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... I PHỤ LỤC ............................................................................................................... III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT VIẾT TẮT CHÚ THÍCH 1. CBB Coomasie Brilliant Blue 2. CPE Chế phẩm enzyme 3. Cs Cộng sự 4. Ctv Cộng tác viên 5. ĐVHT Đơn vị hoạt tính 6. Da Daltons 7. HTR Hoạt tính riêng 8. HT Hoạt tính 9. HL Hàm lượng 10. PHEMA Polyhydroxy ethyl metrhcryla 11. SDS Sodium dodecyl sulfate 12. UV Ultra violet 13. U 14. Vmẫu Unit ( Hoạt động của enzyme được tính theo đơn vị quốc tế U) Thể tích mẫu DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100g dứa.................................................... 5 Bảng 2.2: Protease động vật .................................................................................. 10 Bảng 2.3: Ứng dụng protease trong Công nghiệp ................................................ 10 Bảng 2.4: Tính chất vật lí của bromelain thân....................................................... 12 Bảng 2.5: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản lên hoạt tính enzyme bromelain ............................................................................................ 16 Bảng 3.1: Bảng số liệu dựng đường chuẩn Albumin ............................................. 34 Bảng 3.2: Bảng số liệu dựng đường chuẩn Tyrosin ............................................... 37 Bảng 3.3: Tỉ lệ tủa bằng cồn 960 đối với dịch enzyme từ chồi dứa ........................ 39 Bảng 3.4: Nồng độ tủa bằng muối (NH4)2SO4 đối với dịch enzyme từ chồi dứa . 40 Bảng 3.5: Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ chồi dứa ......................... 41 Bảng 4.1: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain dịch chiết thô của các bộ phận trên quả dứa ............................................................................... 55 Bảng 4.2: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ trong dịch tủa là cồn 960 ............................................................................................................... 57 Bảng 4.3: Sự biến thiên hoạt tính enzyme bromelain theo pH (tủa cồn) ............... 58 Bảng 4.4: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo nhiệt độ (tủa cồn) .................... 59 Bảng 4.5: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo độ bền nhiệt ở nhiệt độ 600C (dịch tủa cồn tỉ lệ 1:4)........................................................................... 60 Bảng 4.6: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) ............................................... 61 Bảng 4.7: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo pH (tủa muối) .......................... 62 Bảng 4.8 : Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo nhiệt độ ( tủa muối)................ 63 Bảng 4.9 : Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo độ bền nhiệt ở nhiệt độ 500C (dịch tủa muối nồng độ 60%) ............................................................... 65 Bảng 4.10: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là aceton (CH3COCH3) ......................................................................... 66 Bảng 4.11: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo pH (tủa aceton) ..................... 67 Bảng 4.12: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo nhiệt độ (tủa aceton) ............. 68 Bảng 4.13: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo độ bền nhiệt ở nhiệt độ 600C (tủa aceton) ........................................................................................... 69 Bảng 4.14: So sánh khi tủa enzyme bromelain trong cồn, muối và aceton ........... 70 Bảng 4.15: Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của bromelain ............................................................................................................... 72 Bảng 4.16: Hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định ....................................................... 72 Bảng 4.17: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định trên Natrialginate theo pH 73 Bảng 4.18: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ........................................................................................................... 74 Bảng 4.19: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định trên Natrialginate theo độ bền nhiệt ................................................................................................ 75 Bảng 4.20: Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme bromelain cố định trên Natrialginate qua các lần tái sử dụng .................................................. 76 Bảng 4.21: So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu và enzyme cố định trên Natrialginate ................................................................................. 78 Bảng 4.22: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của chế phẩm enzyme thô (chồi dứa) trước khi chạy sắc ký ........................................................ 79 Bảng 4.23: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng cồn 960 sau khi chạy sắc ký ....................................................... 80 Bảng 4.24: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng muối (NH4)2SO4 sau khi chạy sắc ký.......................................... 81 Bảng 4.25: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng aceton sau khi chạy sắc ký ......................................................... 82 Bảng 4.26: Kết quả tinh sạch enzyme bormelain của chồi dứa ............................. 83 Bảng 4.27: Giá trị Rf và LogM của thang chuẩn ................................................... 85 Bảng 4.28: Trọng lượng phân tử enzyme tủa bằng cồn 960 và đã qua sắc ký ....... 86 Bảng 4.29: Trọng lượng phân tử enzyme tủa bằng muối và đã qua sắc ký ........... 86 Bảng 4.30: Trọng lượng phân tử enzyme tủa bằng aceton và đã qua sắc ký ........ 86 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 2.1 : Dứa trước khi thu hoạch ......................................................................... 4 Hình 2.2 : Dứa sau khi thu hoạch ............................................................................ 4 Hình 2.3 : Bột bromelain bổ sung vào thức ăn gia súc do Thái Lan sản xuất ....... 17 Hình 2.4 : Chất chiết từ lá và thân dứa được sản xuất dưới dạng viên nén, mỗi viên chứa 200mg bromelain. ............................................................... 17 Hình 3.1 : Chồi dứa ............................................................................................... 29 Hình 3.2 : Mắt dứa ................................................................................................ 29 Hình 3.3 : Thịt dứa ................................................................................................ 29 Hình 3.4 : Cùi dứa ................................................................................................. 29 Hình 3.5 : Máy xay dứa ......................................................................................... 30 Hình 3.6 : Máy đo pH ............................................................................................ 30 Hình 3.7 : Cân phân tích ....................................................................................... 30 Hình 3.8 : Máy đo quang phổ UV – Vis ................................................................ 30 Hình 3.9 : Máy ly tâm ............................................................................................ 31 Hình 3.10: Bể ổn nhiệt............................................................................................ 31 Hình 3.11: Dịch chiết thô sau khi ly tâm ................................................................ 32 Hình 3.12: Thiết bị lọc gel áp suất thấp (Bio - Rad) .............................................. 46 Hình 3.13: Loại muối trước khi chạy sắc ký .......................................................... 48 Hình 3.14: Bộ điện di đứng một chiều của Cole – Parmer (Thuỵ Điển) ............... 49 Hình 4.1 : Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính enzyme các bộ phận trên quả dứa .......................................................................................... 56 Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain theo tỉ lệ cồn 960.............................................................................................. 57 Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa cồn ................................................................................... 58 Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa cồn ................................................................................... 59 Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa cồn theo thời gian ủ. ............................................................................................ 60 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain theo nồng độ muối (NH4)2SO4 ...................................................................... 62 Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa muối (NH4)2SO4 ............................................................. 63 Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa muối (NH4)2SO4 ............................................................. 64 Hình 4.9: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa muối (NH4)2SO4 theo thời gian ủ ........................................................................... 65 Hình 4.10: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain theo tỉ lệ aceton ............................................................................................. 66 Hình 4.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa aceton ............................................................................ 67 Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa aceton ........................................................... 68 Hình 4.13: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa aceton theo thời gian ủ ............................................................................................. 69 Hình 4.14: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa cồn 960, muối Ammonium sulfate và Aceton ....................................................... 70 Hình 4.15: Enzyme bromelain được cố định trong gel Natrialginate .................... 71 Hình 4.16: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel Natrialginate theo pH ........................................................................... 73 Hình 4.17: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel Natrialginate theo nhiệt độ ................................................................... 74 Hình 4.18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel Natrialginate theo độ bền nhiệt ............................................................ 75 Hình 4.19: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel Natrialginate theo số lần tái sử dụng ................................................... 77 Hình 4.20: Đường biểu diễn phần trăm hoạt tính bromelain còn giữ lại theo thời gian ủ .................................................................................................... 78 Hình 4.21: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng cồn 960 ................................................... 80 Hình 4.22: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng muối Ammonium sulphate ...................... 81 Hình 4.23: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng Aceton .................................................... 82 Hình 4.24: Đồ thị so sánh độ tinh sạch enzyme bromelain với các tác nhân tủa khác nhau .............................................................................................. 83 Hình 4.25: Kết quả điện di của hệ enzyme bromelain từ dứa ................................ 84 Hình 4.26: Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa LogM của protein trong thang chuẩn với Rf .......................................................................................... 85 Chương 1: Mở đầu CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây người ta dành sự quan tâm rất nhiều đến việc tách chiết enzyme bromelain để sử dụng làm tác nhân kích thích tiêu hóa, chữa vết thương, ổn định dịch lên men. Việc nghiên cứu thành công một enzyme là ở việc chiết xuất, xác định đặt tính, yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme. Việc tinh chế enzyme hết sức cần thiết bởi làm cho enzyme tinh sạch ít còn lẫn tạp chất (các protein không phải enzyme), nâng cao hoạt tính enzyme so với dạng thô nhiều lần, thuận lợi cho nghiên cứu, bảo quản, nguyên liệu cho một số ngành công nghệ thực phẩm và trong dược phẩm dùng làm thuốc trong điều trị và sản xuất. Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme bromelain cũng đang được nghiên cứu. Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme. Bằng cách cố định enzyme trong chất mang không tan trong nước enzyme có thể tách ra khỏi cơ chất dễ dàng sau phản ứng. Thêm vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan hiếm enzyme như hiện nay. Ngày nay, enzyme đã được sản xuất và sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác. Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nguyên liệu rất phong phú (dứa, đu đủ,...). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ khoảng 30% quả dứa được sử dụng, còn lại 70% phụ phẩm mà chủ yếu là chồi trên quả dứa, thân dứa (Hội thảo quốc gia năm 2005). Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất thải hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm bromelain bởi vì hầu như trên tất cả các bộ phận của cây dứa đều có enzyme. Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase. Bromelain thân, chồi có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết sản phẩm bromelain thương mại được ly trích từ thân dứa. Trang 1