Tài liệu điều tra thành phần loài nấm đông trùng hạ thảo tại vườn quốc gia hoàng liên, nghiên cứu nuôi trồng loài đông trùng hạ thảo bông tuyết (isaria tenuipes

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM ----------  ---------- HOÀNG QUỐC BẢO ĐIỀU TRA THÀNH PHẦN LOÀI NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO TẠI VƯỜN QUỐC GIA HOÀNG LIÊN VÀ NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG LOÀI ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BÔNG TUYẾT (ISARIA TENUIPES) LUẬN ÁN TIẾN SY LÂM NGHIỆP CHUYÊN NGHÀNH ĐÀO TẠO MÃ SỐ : : QUẢN LÝ TÀI NGUYÊN RỪNG 9620211 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS.TS. PHẠM QUANG THU HÀ NỘI - NĂM 2018 i LỜI CAM ĐOAN Luận án được hoàn thành trong chương trình đào tạo tiến sĩ khóa 27 (2015 - 2018) tại Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của bản thân tôi. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực. Nếu có gì sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày tháng 01 năm 2019 Nghiên cứu sinh Hoàng Quốc Bảo LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành trong chương trình đào tạo nghiên cứu sinh khóa 27, giai đoạn 2015 - 2019 tại Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt ii Nam. Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án, tác giả nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, các nhà khoa học, cán bộ nghiên cứu thuộc: Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Ban Đào tạo và Hợp tác quốc tế, Lãnh đạo Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam; Lãnh đạo UBND tỉnh Lào Cai, Văn phòng UBND tỉnh Lào Cai, Tỉnh đoàn Lào Cai, VQG Hoàng Liên... Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ quý báu đó. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Phạm Quang Thu - thầy giáo trực tiếp hướng dẫn đã dành nhiều thời gian và công sức chỉ bảo cho Tôi hoàn thành luận án này. Trân trọng cảm ơn các đồng chí lãnh đạo, nghiên cứu viên, kỹ thuật thuật viên Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng đã luôn tạo điều kiện tốt nhất, hỗ trợ Tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ Tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Luận án được hoàn thiện trên cơ sở tham khảo nhiều tài liệu có liên quan, ý kiến đóng góp của nhiều nhà chuyên môn và nỗ lực của tác giả. Tuy nhiên do điều kiện và thời gian còn hạn chế, khó tiếp cận các kết quả nghiên cứu nên luận án không tránh khỏi những thiếu sót. Tác giả rất mong nhận được ý kiến đóng góp, xây dựng của các nhà khoa học cũng như của bạn bè đồng nghiệp để luận án được hoàn thiện. Xin chân thành cảm ơn! iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................i LỜI CẢM ƠN..................................................................................................ii MỤC LỤC.......................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU.................................xix DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................xx DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ...................................................xxi MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU..................................5 1.1. Hệ thống của giới Nấm..........................................................................5 1.2. Hình thái và cấu trúc sợi nấm..............................................................13 1.2.1. Sợ nấm..........................................................................................13 1.2.2. Quả thể.........................................................................................14 1.2.3. Quả thể đệm.................................................................................14 1.2.4. Nang nấm.....................................................................................14 1.2.5. Bào tử nấm...................................................................................15 1.3. Nấm ký sinh côn trùng.........................................................................15 1.3.1. Khái niệm.....................................................................................15 1.3.2. Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng.............16 1. 4. Tình hình nghiên cứu về nhóm nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới.....20 1.4.1. Nghiên cứu về phân loại, thành phần loài nhóm nấm Đông trùng hạ thảo....................................................................................................20 1.4.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học cuả nhóm nấm Đông trùng hạ thảo ................................................................................................................23 1.4.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nhóm nấm Đông trùng hạ thảo.........................................................................................................25 1.4.4. Nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối hệ sợi và nuôi trồng thể quả đệm trên giá thể nhân tạo.......................................................................29 1.5. Nghiên cứu về nhóm nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam................31 iv 1.5.1. Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và nhóm nấm Đông trùng hạ thảo...............................................................31 1.5.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị dược liệu nấm Đông trùng hạ thảo...........................................................................................37 1.5.3. Nghiên cứu về nuôi trồng.............................................................38 1.6. Đặc điểm tự nhiên khu vực nghiên cứu..............................................40 1.6.1. Vị trí địa lý...................................................................................40 1.6.2. Địa hình, địa mạo.........................................................................41 1.6.3. Địa chất và thổ nhưỡng................................................................42 1.6.4. Khí hậu, thủy văn.........................................................................43 1.6.5. Thực vật........................................................................................44 1.6.6. Động vật.......................................................................................45 Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................................................................................................47 2.1. Nội dung nghiên cứu............................................................................47 2.1.1. Thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên. 47 2.1.2. Xác định các chỉ số đa dạng các loài nấm Đông trùng hạ thảo....47 2.1.3. Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo...............................................................47 2.1.4. Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết trên giá thể nhân tạo.............................................................47 2.2. Vật liệu nghiên cứu..............................................................................48 2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................48 2.3.1. Các bước nghiên cứu....................................................................48 2.3.2. Phương pháp điều tra thu mẫu nấm Đông trùng hạ thảo ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên và giám định mẫu thu được................................49 2.3.3. Phương pháp xác định các chỉ số đa dạng các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên........................................51 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo...........................................54 v 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu............................................................59 2.4. Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo.........................................................59 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..........................60 3.1. Thành phần loài nấm ĐTHT tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên.............60 3.2. Đánh giá đa dạng sinh học và phân bố các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên...........................................................................90 3.2.1. Đa dạng về thành phần loài, tần suất xuất hiện............................90 3.2.2. Đa dạng về phân bố......................................................................92 3.2.3. Đa dạng về ký chủ......................................................................106 3.2.4. Đa dạng về giá trị sử dụng và giá trị dược liệu.........................107 3.3. Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo..................................................................................109 3.3.1. Nghiên cứu môi trường thích hợp tạo giống gốc.......................109 3.3.2. Nghiên cứu nuôi trồng thể quả đệm trên giá thể lỏng................111 3.3.3. Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể rắn..........119 3.3.4. Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả đệm trên giá thể nhộng tằm ..............................................................................................................123 3.4. Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo.......................................................127 3.4.1. Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I. tenuipes trên giá thể lỏng ..............................................................................................................128 3.4.2. Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I. tenuipes trên giá thể rắn129 3.4.3. Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I. tenuipes trên giá thể nhộng tằm........................................................................................................130 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ.............................................................133 Kết luận.....................................................................................................133 Khuyến nghị..............................................................................................134 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN............................................................................................135 vi TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................136 Tài liệu tiếng Việt.....................................................................................136 Tài liệu tiếng nước ngoài..........................................................................142 PHỤ LỤC......................................................................................................150 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ ĐTHT Đông trùng hạ thảo rAND Ribosom Acid Deoxyribo Nucleic EPF Nấm ký sinh côn trùng -Entomology phathogenic fungi PDA Potato Dextrose Agar PYEG Peptone Yeast Extract Glucose CSA Carrot extract Sucrose Agar MEA Malt Extract Agar VQG Lsd Vườn Quốc gia Khoảng sai dị Fpr Xác suất kiểm tra của F viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Số lượng loài và giống của một số bộ Nấm Việt Nam so sánh với Trung Quốc và Thế giới..................................................................................11 Bảng 1.2. Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm Đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes....................................................................................24 Bảng 1.3. Thành phần acid amin trong nấm Đông trùng hạ thảo I. tenuipes..24 Bảng 1.4. Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I. tenuipes.....25 Bảng 3.1: Thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo ở Vườn quốc gia Hoàng Liên - Lào Cai.................................................................................................60 Bảng 3.2: Tính đa dạng về thành phần loài và tần xuất xuất hiện của các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn quốc gia Hoàng Liên................................90 Bảng 3.3. Phân bố nấm ĐTHT theo sinh cảnh................................................92 Bảng 3.4. Phân bố nấm ĐTHT theo đai độ cao...............................................97 Bảng 3.5. Phân bố nấm ĐTHT theo độ tàn che.............................................101 Bảng 3.6. Tổng hợp số lượng nấm ĐTHT phân bố theo thời gian................103 Bảng 3.7. Tổng hợp số lượng, tỷ lệ thành phần Bô ̣ côn trùng ký chủ của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên............................................106 Bảng 3.8. Giá trị sử dụng của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên................................................................................................................107 Bảng 3.9. Kết quả sinh trưởng, phát triển của giống nấm gốc trên môi trường dịch thể..........................................................................................................110 Bảng 3.10: Kết quả nuôi trồng thể quả đệm nấm I. tenuipes trên giá thể lỏng .......................................................................................................................112 Bảng 3.11: Kết quả nuôi trồng thể quả đệm ở nhiệt độ không khí khác nhau .......................................................................................................................115 Bảng 3.12: Kết quả nuôi trồng thể quả đệm ở môi trường có pH khác nhau117 Bảng 3.13: Sinh trưởng của hệ sợi nấm ở các tốc độ lắc khác nhau.............119 Bảng 3.14 : Kết quả nghiên cứu nuôi trồng nấm I. tenuipes trên giá thể rắn121 Bảng 3.15: Kết quả nuôi trồng nấm I. tenuipes ở các công thức giá thể nhộng tằm .......................................................................................................................124 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng...........................17 ix Hình 1.2. Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng...............................19 Hình 1.3. Sơ đồ các kiểu khí hậu ở huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai.......................44 Hình 3.2. (a) Nấm B. bassiana ký sinh trên bọ cánh cứng, (b) Bào tử vô tính nấm B. bassiana, (c) Hệ sợi nấm B. bassiana trên môi trường PDA..............67 Hình 3.3. (a) Nhộng bị nấm Beauveria sp. nov. ký sinh; (b) Bào tử vô tính; (c) Thể đệm hình thành trong nuôi cây thuần khiết trên môi trường PDA.....70 Hình 3.4. Thể quả đệm C. cardinalis............................................................71 Hình 3.5. (a) Thể quả đệm C.militaris, (b) Túi bào tử nấm C.militaris chứa các bào tử đứt đoạn, (c) Hệ sợi nấm C.militaris trong nuôi cấy thuần khiết. 73 Hình 3.6. Thể quả đệm C. pseudomilitaris...................................................74 Hình 3.7. (a) Thể quả đệm C. takaomontana (giai đoạn hữu tính) và I. tenuipes (giai đoạn vô tính); (b) Bào tử túi C. takaomontana; (c) Bào tử vô tính của I. tenuipes; (c) Hệ sợ I. tenuipes trên môi trường PDA....................75 Hình 3.8. (a)Thể quả đệm nấm I. cateniannulatus; (b) Bào tử vô tính nấm I. cateniannulatus............................................................................................77 Hình 3.9. (a) Thể đệm I. tenuipes; (b) Bào tử vô tính (c) Thể đệm hình thành trong nuôi cấy thuần khiết trên môi trường PDA............................................78 Hình 3.10. Thể đệm Isaria sp.nov.; (b)Bào tử vô tính; (c) (c) Hệ sợi chủng HL46, (d) Hệ sợi chủng HL15........................................................................81 Hình 3.11. (a) Thể quả đệm O. annulata, (b) Túi bào tử, (c) Bào tử túi......82 Hình 3.12. (a) Thể quả đệm O. crinalis, (b) Túi bào tử chứa các bào tử túi đứt đoạn...........................................................................................................83 Hình 3.13. (a) Thể quả đệm O. formicarum (b) Túi bào tử nấm O. formicarum......................................................................................................84 Hình 3.14. (a) Thể quả đệm O. formosana, (b) Túi bào tử nấm O. formosana........................................................................................................85 Hình 3.15. Thể quả đệm O. myrmecophila...................................................86 Hình 3.16. (a) Thể quả đệm O.nutans; (b) Túi bào tử nấm O.nutans chứa các bào tử túi đứt đoạn; (c) Thể quả đệm O.nutans hình thành trong nuôi cấy thuần khiết trên môi trường PDA....................................................................88 x Hình 3.17. (a) Nấm O. oxycephala ký sinh trên ong; (b) Hệ sợi nấm O. oxycephala trong nuôi cấy thuần khiết............................................................89 Hình 3.18. (a) Thể quả đệm O. sphaecocephala; (b) Túi bào tử O. sphaecocephala; (c) Thể quả đệm O. sphaecocephala trong nuôi cấy thuần khiết trên môi trường PDA..............................................................................90 Hình 3.19. A - Giống nấm công thức CT1; B - Giống nấm công thức CT2 111 Hình 3.20. Thể quả đệm của nấm I. tenuipes từ nguồn giống nấm gốc khác nhau...............................................................................................................111 Hình 3.21: Thể quả đệm của nấm I. tenuipes được nuôi trên các giá thể lỏng A - Thể quả nấm xuất hiện bào tử; B - Thể quả nấm đang phân hủy.........113 Hình 3.22: Thể quả đệm của nấm I. tenuipes được nuôi trên giá thể lỏng...114 Hình 3.23: Thể quả đệm khi nuôi ở nhiệt độ không khí khác nhau..............116 Hình 3.24: Thể quả đệm khi nuôi ở các môi trường có pH khác nhau.........118 Hình 3.25. Giống nấm I. tenuipes A: Tốc độ lắc 150 vòng/phút; B: Tốc độ lắc 110 vòng/phút................................................................................................120 Hình 3.26: Thể quả đệm nuôi trồng trên giá thể rắn.....................................123 Hình 3.27: Nấm được nhiễm bằng phương thức tiêm giống vào nhộng.......126 Hình 3.28: Nấm được nhiễm bằng phương thức phun giống vào nhộng.....126 Hình 3.29: Nấm I. tenuipes được nhiễm bằng phương thức phun giống vào sâu non tuổi 5................................................................................................126 Hình 3.30. Thể quả đệm tươi (A)và khô (B) nấm I. tenuipes.......................132 Biểu đồ 3.1. Số lượng nấm ĐTHT phân bố theo thời gian...........................105 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo Đông trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loại côn trùng. Sâu non, sâu trưởng thành của một số loài côn trùng nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh, xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết. Mùa đông, giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao đã hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu. Vì mùa đông nấm tồn tại ở dạng hệ sợi trên sâu, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là đông trùng hạ thảo. Nấm Đông trùng hạ thảo là loài nấm được đánh giá cao về giá trị dược liệu, nhờ có hợp chất cordycepin trong thành phần hoá học của thể quả nấm. Đây là hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của quá trình sinh tổng hợp mới của các tế bào ung thư. Tác dụng kìm hãm của các tế bào ung thư vú, ung thư phổi, ung thư máu cũng được nhiều nhà khoa học như: Yoo et al., (2004) [107]; Ahn et al., (2000) [48] đã nghiên cứu và phát hiện. Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị các chứng rối loạn lipit máu, rối loạn nhịp tim, viêm thận mạn tính, cao huyết áp, ung thư phổi, thiểu năng sinh dục và viêm gan B mạn tính. Nấm Đông trùng hạ thảo đã được Nan et al., (2001) [89] chứng minh có hiệu quả chữa trị bệnh rối loạn chức năng gan. Ngoài ra nấm này còn có tác dụng chống viêm và kìm hãm sự oxy hoá của lipit và lipoprotein. Không chỉ vậy loài nấm Đông trùng hạ thảo còn được phát hiện có hàm lượng dinh dưỡng cao: giàu các vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3, vitamin B1… và có hàm lượng protein khá cao, nhiều nguyên tố khoáng như Zn, Se, Cu... Như vậy giá trị của loài nấm Đông trùng hạ thảo là vô cùng quý giá. 2 Được thiên nhiên ưu đãi về điều kiện tự nhiên cùng với hệ động thực vật phong phú, Vườn Quốc gia Hoàng Liên còn có nguồn dược liệu vô cùng quý giá như: Tam thất hoang, nấm Linh chi, Ba kích cùng nhiều loài thảo dược quý khác đã góp phần xây dựng Sa Pa trở thành điểm du lịch nghỉ dưỡng, chữa bệnh yêu thích của du khách trong và ngoài nước. Tuy nhiên những sản vật của địa phương mới chỉ dừng lại ở việc khai thác, thu hái từ rừng, một phần nhỏ do nhân dân nuôi trồng mà chưa có nhiều sản phẩm khoa học công nghệ cao phục vụ khách du lịch và đóng góp đáng kể cho ngân sách địa phương. Bằng các nghiên cứu chuyên đề các nhà khoa học bước đầu phát hiện Vườn Quốc gia Hoàng Liên có các loài nấm Đông trùng hạ thảo phân bố tự nhiên, trong đó có loài “Bông tuyết Đông trùng hạ thảo - Isaria tenuipes” được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y học… loài này chứa hàm lượng một số hoạt chất (Adenosine, Cordycepin…) cao và giá trị nó mang lại vô cùng lớn với việc điều trị ung thư, tiểu đường và một số bệnh lý khác. Tuy nhiên khu hệ nấm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên còn chưa có nhiều nghiên cứu. Những hiểu biết về đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế. Với mong muốn được đóng góp vào việc xây dựng danh mục nguồn gen các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, bảo tồn đa dạng sinh học và đề xuất biện pháp sử dụng bền vững, nhân nuôi nguồn dược liệu quý bằng phương pháp nhân tạo. Mở ra một hướng đi mới trong việc phát triển kinh tế, xã hội của tỉnh Lào Cai, tạo sản phẩm du lịch đặc trưng mang thương hiệu Đông trùng hạ thảo Sa Pa. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) đặt ra là rất cần thiết, có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn. 3 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Xác định được thành phần, tính đa dạng các loài thuộc nhóm nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên và cơ sở khoa học trong việc nuôi trồng loài nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes). 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được thành phần loài nhóm nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên. - Xác định được tính đa dạng và đặc điểm sinh học của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên. - Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo. 3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu Giới hạn đối tượng nghiên cứu - Nhóm Nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên. - Nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes). Giới hạn địa điểm nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu được giới hạn trong phạm vi VQG Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai. - Phân lập và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội). 4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học Đóng góp các dữ liệu khoa học về thành phần loài, tính đa dạng và đặc điểm sinh học của nhóm nấm Đông trùng hạ thảo; góp phần xây dựng 4 luận cứ khoa học cho việc nuôi trồng thành công thể quả đệm loài nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu của luận án xác định được thành phần loài nhóm nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai. - Xác định được cơ sở khoa học và xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng thành công loài nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo. 4.3. Những đóng góp mới của luận án - Lần đầu tiên xác định được danh mục gồm 18 loài thuộc 3 họ Clavicipitaceae, Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae tại VQG Hoàng Liên, trong đó ghi nhận 2 mẫu nấm mới là Beaveria sp. và Isaria sp.. Mô tả chi tiết đặc điểm hình dạng, sinh thái và các chỉ số đa dạng sinh học của các loài nấm thu thập được. - Nghiên cứu nuôi trồng thành công thể quả đệm trên giá thể nhân tạo: giá thể rắn, giá thể lỏng và trên nhộng tằm. Nhiễm nấm vào sâu non nhộng tằm ở tuổi 5 (trước khi hóa nhộng) cho kết quả tốt nhất. 5. Thời gian, địa điểm nghiên cứu - Đề tài tiến hành điều tra thực địa từ năm 2015 đến năm 2017, mỗi năm điều tra làm 4 đợt, gồm các tháng 4, 6, 8 và tháng 10. - Nghiên cứu về giám định nấm Đông trùng hạ thảo bằng kỹ thuật ADN; phân lập, xây dựng nguồn gen các loài nấm Đông trùng hạ thảo; Nghiên cứu nuôi trồng thể quả loài Isaria tenuipes trên giá thể nhân tạo tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Hệ thống của giới Nấm Quan điểm nghiên cứu của các nhà Nấm học từ trước đến nay, Nấm (Fungi) là một nhóm sinh vật có nhân chính thức, đa nguyên, bao gồm Protozoa Fungi, Chromista Fungi và Eufungi (Nấm chính thức) (Takhtajan, 1973 [31]; Trịnh Tam Kiệt, 1980 [12]). Những năm trở lại đây hệ thống của một số nhóm nấm đã có những thay đổi, cụ thể: Ở Nấm nang (Ascomycota) việc phân chia các bậc taxon thấp hơn như lớp, lớp phụ. Nhóm bộ hầu như ít có sức thuyết phục, mà được chia trực tiếp thành 46 bộ (Kikuchi et al., 2004) [73]. Đối với nhóm Nấm bất toàn (Fungi imperfecti, Deuteromyces) không được thừa nhận về mặt hệ thống tự nhiên, vì vậy taxon cơ bản là chi (genus) được sử dụng để sắp xếp các nhóm nấm (Bùi Xuân Đồng, 1977 [4]; Trịnh Tam Kiệt, 1980 [14]; Trịnh Tam Kiệt, 2014 [15]). Thời cổ đại, thế giới sinh vật được chia ra thành Động vật và Thực vật bởi Aristot (384-322 trước Công nguyên). Sau này trong hệ thống phân chia của mình Carl Von Linne (1707-1778) gọi là giới thực vật (Vegetabilia) và giới động vật (Animalia). Trong khi một số nhóm sinh vật bậc thấp như: vi khuẩn, virut, nấm được xếp vào giới thực vật, dù cơ sở khoa học là chưa đầy đủ. Vì vậy, Haeckel (1886) đã đề nghị tách nhóm Protista ra khỏi hai giới Động vật và Thực vật (Trịnh Tam Kiệt, 1980) [14]. Đến giữa thế kỷ 20, các nhà khoa học đã chia thế giới hữu sinh thành 4 giới (Monera, Protoctista, Pliantae và Animalia) (Copeland, 1956) [56]. Năm 1968, Magulis đã đề xướng học thuyết phát sinh, cộng sinh. Đến năm 1969, Whittaker đã đưa ra hệ thống 5 giới (Monera, Protista, Plantae, Fungi và Animalia) (R. H. Whittaker, 1969) [104]. 6 Nhưng chỉ 4 năm sau các nhà nấm học lại gộp thành 4 giới (Mychota = Monera, Animalia, Mycetalia = Fungi, Vegetabila = Plantae) (Takhtajan, 1973) [31]. Các hệ thống này có ưu điểm là khi phân chia thế giới sinh vật ra làm nhiều giới thì đã nêu lên được sự khác nhau căn bản nhất về bản chất của chúng. Trong tác phẩm “Systema mycologicum”, cha đẻ của hệ thống Nấm đã tách Nấm thành một giới riêng là điều hợp lý (Elias Fries, 17941878) [61]. Giới nấm (Mycetoidem Fries) gồm những sinh vật có nhân thực, có màng rắn chắc được tạo thành từ kitin, xenluloza, ... hay không có màng, dinh dưỡng chủ yếu bằng kiểu hấp thụ, một số ít nuốt thức ăn; thường sống bám và sinh trưởng không có giới hạn, sinh sản và phát tán bằng bào tử. Đặc biệt, những kết quả nghiên cứu mới như: có bộ máy hấp thụ ánh sáng mặc dù không đi kèm với sự tổng hợp hydratcacbon, sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất gần với động vật, sự tồn tại nhiều trung tâm điều khiển tính thấm của màng, sự phát triển cá thể trải qua nhiều pha sợi nấm,... đã được nhiều tác giả ủng hộ. Mặc dù việc phân chia các nhóm Nấm đã được hoàn chỉnh dần theo lịch sử phát triển của Nấm học nhưng vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Theo Linne, nấm chỉ được chia thành 10 chi với 86 loài (Trịnh Tam Kiệt, 1980) [14]. Sau này, chúng ở bậc taxon cao hơn. Sau đó, Elias Fries chia nấm thành 4 lớp nguyên thuỷ Hymenomycetes, Gasteromycetes, Hyphomycetes và Coniomycetes, trong đó Hymenomycetes, theo ông bao gồm cả Ascomycetes có lớp sinh sản (hymenium). Hệ thống của Elias Fries, dù được các tác giả sau này hoàn chỉnh, nhưng về cơ bản, hệ thống này vẫn mang tính chất nhân tạo (Schaffer, 1975) [98]. Nấm nhầy được De Bary (1884) xếp sang giới Động vật với tên Mycetozoa và nhận được sự đồng thuận của nhiều nhà nghiên cứu. Tuy nhiên, phần đông các nhà Thực vật lại xếp chúng trong giới Thực vật với tên khoa học Myxomycetes Link (1883) và tách biệt với Nấm. Quan điểm 7 này gần đây còn được nhiều nhà Nấm học thừa nhận và họ tách Nấm nhầy ra khỏi hệ thống của mình (Bessey, 1950 [55,]; Kreisel, 1969 [80]; Schaffer, 1975 [98] ). Sau này, những nghiên cứu của Martin (1960-1961) đã làm rõ được bản chất nấm của Myxomycetes và được một số nhà Nấm học thừa nhận trong hệ thống của mình như (Alexopoulos, 1966) [49]. Đặc điểm chung của các ngành nấm nhầy là đều có cơ thể dinh dưỡng dạng thể nhầy (plasmodium) và hình thành bào tử có màng xenluloza. Tuy nhiên, chúng có sự khác nhau rất lớn, cụ thể: ở Myxomycetes có thể nhầy thực (Eupiasmodium) thì ở Acrasiomycetes có thể nhầy giả do các tế bào nhầy riêng rẽ tập hợp lại thành (Pseudoplasmodium) và ở Labyrinthulomycetes là thể nhầy mạng lưới (Filoplasmodium). Riêng Nấm nhầy nội ký sinh Plasmodiophoromycetes trước kia được để trong Myxomycetes vì có cơ thể trần và dạng chuyển động là amíp có roi, điều mà một vài tác giả hiện đại còn chấp nhận. Thể nhầy của nấm nhầy có hai giai đoạn là thể nhầy 1n và thể nhầy 2n, màng của bào tử lại có thành phần chủ yếu là kitin và hàng loạt đặc điểm riêng biệt khác nên phần lớn các tác giả đã xếp sang Phycomycetes sensu lato (Alexopoulos, 1966) [49]. Nhiều tác giả cho rằng đây là một nhóm nấm hoàn toàn tách biệt với các nhóm còn lại. Đối với nấm thật (Eumycetes), được coi là một ngành của giới Thực vật Plantae sensu lato và dựa vào cấu trúc cơ thể được chia thành các lớp Archimycetes, Phycomycetes (gồm những nấm sợi có cấu trúc dạng hợp bào), Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes dạng sợi đa bào có vách ngăn ngang hay đơn bào có dạng nấm men. Một số khác gộp Archimycetes vào Phycomycetes (Takhtajan, 1973 [31]; Trịnh Tam Kiệt, 1980 [14]). Những nghiên cứu sau này về nhóm Mastigomycetes hay Mastigomycotina gồm những nấm không những khác nhau về kiểu đính mà còn về số lượng và cấu trúc của roi. Oomycetes và Hyphochytridiomycetes là những nấm có những đặc điểm hết sức khác biệt 8 với Chytridiomycetes và toàn bộ các nhóm nấm khác. Ở Oomycetes, màng tế bào có cấu trúc từ xenluloza, giai đoạn chuyển động có hai roi, trong đó một roi phủ lông, còn ở Hyphochytridiomycetes lại có màng chứa cả xenluloza và kitin, giai đoạn chuyển động chỉ có một roi phủ lông đính ở phía trước. Chúng khác biệt với những cơ thể có nhân thực còn lại là có cấu trúc ti thể dạng ống, về khối lượng ribosom ARN, về hệ men thủy phân cũng như về phản ứng đối với thuốc diệt nấm. Chính vì vậy, nhiều nhà Nấm học đã tách Oomycetes thành nhóm nấm riêng biệt, thậm chí không thừa nhận bản chất nấm của chúng, và tách thành một lớp của Tảo vàng (Kreisel, 1964) [80]. Đối với Hyphochytridiomycetes mặc dù mới được tách ra khỏi Chytridiomycetes nhưng chúng hoàn toàn tách biệt với Oomycetes cũng như các nhóm nấm khác và cần được làm sáng tỏ hơn nữa về mặt di truyền. Nấm lông Trichomycetes từ lâu được coi như nhóm nấm không rõ về vị trí phân loại (Alexonpoulos, 1966) [49] đã được một số tác giả xếp vào Zygomycetes vì cùng có kiểu sinh sản tiếp hợp giao (Zygogamie). Chúng có cấu trúc cơ thể khác biệt, có màng tế bào bằng galactosamin, galactoza trùng hợp và hàng loạt đặc điểm riêng biệt khác với Zygomycetes cũng như các nhóm nấm khác và dường như có quan hệ với Acrasiomycetes. Những nấm còn lại hầu hết có màng tế bào bằng kitin được phần lớn các nhà Nấm học gọi là Nấm chính thức ( Eufungi); chúng gồm các nấm có giai đoạn chuyển động bằng một roi không phủ lông dính ở phía sau ở Chytridiomcetes và các nấm hoàn toàn mất giai đoạn chuyển động như Zygomycetes, Endomycetes, Ascomycetes và Basidiomycetes. Trong các nhóm nấm này, vị trí của Endomycetes, Taphrinales trong Hemiascomycetes sensu lato và Uredinales cũng như một số nấm có dạng nấm men của Basidiomycetes đang còn có nhiều ý kiến khác nhau; một số nhà Nấm học khác xem chúng như là những nhóm thuộc Ascomycetes và Basidiomycetes theo quan điểm cổ truyền (Bessey., E. A. 1950) [59]. Về sau, một số tác giả muốn tách chúng thành một nhóm riêng biệt, tương 9 đương với Ascomycetes và Basidiomycetes là Endomycetes và gồm các bộ Endomycetes, Sporobolomycetales, TorulopsidaleSy Taphrinales, Exobasidiales, Ustilaginnales (Takhtajan, 1973) [31]. Rõ ràng các nấm men chính thức Endomycetes khác với các nấm thật còn lại ở cấu trúc màng tế bào từ manan và glucan, ở dạng sống, ở phương thức sinh sản vô tính (nảy chồi hay chia đôi cơ thể) và đặc biệt ở sinh sản hữu tính, không có cơ quan sinh sản cũng như sợi sinh nang mà chỉ có sự giao phối hai tế bào, hai sợi dinh dưỡng hay tự giao và số lượng bào tử hình thành hầu như bất định. Các nấm còn lại của Endomycetes lại có màng kitin-manan, có hệ sợi hai nhân (dicaryon) và một số hình thành lớp sinh sản (hymenium) do các nang (ascus) hay đảm (basidie) xếp dạng bờ rào hình thành. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu được trình bày trong Hội nghị Thực vật học lần thứ 12 (1975) về hình thái, tế bào và di truyền học của Ustilaginales cũng có quan điểm về vị trí của chúng bên cạnh Uredinales trong Basidiomycetes, từ chối việc xếp chúng vào Endomycetes ở trên hay nâng lên thành một ngành mới Ustomycota (Moore, 1972) [87]. Dù sao, vị trí của những nhóm nấm này cũng cần được xem xét kỹ lưỡng hơn dưới góc độ của những nghiên cứu hiện đại. Nấm bất toàn (Fungi imperfecti) bao gồm những nấm đơn bào dạng nấm men hoặc dạng sợi có vách ngăn chính thức nhưng chưa tìm thấy sinh sản hữu tính hay cả sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính. Từ trước đến nay, người ta vẫn sử dụng hệ thống phân loại của Saccardo để xếp chúng thành dạng lớp Deutermycetes hay Fungi imperfecti gồm các dạng bộ sau (Saccardo, 1880-1886) [94]: - Sphaeropsidales có cuống conidie tập hợp thành thể gối. - Molanconiales có cuống conidie tập hợp thành thế gối. - Moniiales hay Hyphales có cuống conidie đính đơn độc trên sợi nấm hay tập hợp thành bó.