Tài liệu đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm bạch cương beauveria bassiana để ứng dụng phòng trừ sâu hại cây trồng

Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT Lời cảm ơn Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS – TS Phạm Thị Thùy, người thầy đã tận tình chỉ bảo giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa CNSH trường ĐH Phương Đông và Ban lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt quá trình thực tập Tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè cùng lớp và đặc biệt là các bạn cùng thực tập tại phòng nấm côn trùng thuộc Trung tâm đấu tranh sinh học – Viên Bảo vệ thực vật đã động viên và giúp đỡ tôi trong cả quá trình thực tập. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu nói trên Hà Nội, Ngày 15 tháng 5 năm 2010 Sinh viên Lê Anh Tuấn Lª Anh TuÊn 0 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT PHẦN I MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên rất thuận tiện cho cây trồng phát triển. Đồng thời với cây trồng phát triển là sâu bệnh hại cũng phát sinh, chúng gây hại đáng kể đến năng suất. Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, hàng năm các loại dịch hại, bệnh hại, đã làm giảm 35 – 40 % tổng sản lượng, mặt khác làm giảm phẩm chất của nông sản. Để bảo vệ cây trồng thì mức chi phí cho công tác bảo vệ thực vật, phòng trừ dịch hại đã không ngừng tăng lên trong phạm vi toàn quốc. Để làm giảm thiệt hại do sâu, bệnh hại gây ra, người nông dân đã sử dụng nhiều biện pháp phòng trừ như canh tác thủ công, luân canh, chuyên canh, chọn tạo giống mới, dùng thuốc hóa học... Trong đó biện pháp sử dụng thuốc hóa học được xem là phổ biến vì dễ áp dụng, có hiệu quả ngay, kịp thời và hiệu quả cao mà giá thành lại rẻ... Nhưng việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học gây ô nhiễm môi trường trầm trọng, để lại dư chất hóa học trong nông sản, giảm số lượng sinh vật có ích, làm mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên, làm tăng tính kháng thuốc của sâu bệnh... Do vậy, sử dụng thuốc hóa học chỉ là biện pháp tình thế. Hiện nay đời sống xã hội Việt Nam ngày càng phát triển, ý thức của người nông dân cũng được nâng cao, họ hiểu được tác hại của thuốc hóa học và muốn có một loại thuốc mới diệt trừ sâu đạt hiệu quả cao mà không gây ra hậu quả xấu như thuốc hóa học. Điều đó đòi hỏi các nhà khoa học cần phải nghiên cứu để thay thế thuốc hóa học bằng các loại thuốc khác theo hướng công nghệ sinh học. Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã phát triển các loại vi nấm, vi khuẩn, virut có khả năng ký sinh gây bệnh trên nhiều loại sâu hại cây trồng đạt hiệu quả cao. Nhiều cơ quan khoa học ở nước ta đã và đang tiến hành nghiên cứu sản xuất các chế phẩm nguồn gốc từ vi sinh vật ( vi khuẩn, vi rút và vi nấm). Trong số các chế phẩm đó thì vi nấm được Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) nghiên cứu Lª Anh TuÊn 1 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT từ những năm 1990 thế kỷ XX, đến nay mang lại kết quả cao trong việc bảo vệ cây trồng. Chế phẩm thuốc trừ sâu vi nấm có những ưu điểm là không độc hại với người và vật nuôi, không gây ô nhiễm môi trường, không làm mất đi nguồn sinh vật có ích trong tự nhiên. Nấm côn trùng chưa tạo ra tính kháng thuốc và có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại sâu khác nhau, ngoài ra nấm côn trùng không chỉ tiêu diệt trực tiếp sâu hại vào thời kỳ phá hoại mà còn tích lũy trên đồng ruộng và lan truyền cho thế hệ sâu tiếp theo. Loài nấm được nghiên cứu ở nước ta hiện nay sâu rộng hơn cả đó là nấm bạch cương Beauveria bassiana, vì đã lựa chọn được những chủng giống mới, môi trường nuôi cấy thích hợp, phổ tác động rộng trên nhiều loại sâu hại cây trồng với hiệu lực kéo dài. Để góp phần vào việc hoàn thành nâng cao năng suất và ổn định chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana làm ngang tầm với thế giới, hướng tới thương mại hóa chế phẩm, chúng tôi được giao thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm bạch cương Beauveria bassiana để ứng dụng phòng trừ sâu hại cây trồng.” MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU */ Mục đích Nâng cao hiệu quả sản xuất và chất lượng của chế phẩm nấm bạch cương Beauveria bassiana, trên cơ sở nghiên cứu môi trường và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana trong điều kiện phòng thí nghiệm. */ Yêu cầu Lª Anh TuÊn 2 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT - Xác định được tỷ lệ thành phần môi trường sản xuất thích hợp cho nấm Beauveria bassiana phát triển để đạt năng suất cao và chất lượng tốt. - Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng tới năng suất và chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana trong quá trình sản xuất. - Đánh giá được hiệu lực phòng trừ của nấm Beauveria bassiana đối với một số loại sâu hại trong điều kiện phòng thí nghiệm. Lª Anh TuÊn 3 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. Sơ lược lịch sử nghiên cứu nấm diệt côn trùng Theo tài liệu của tác giả Phạm Thị Thùy năm 2004 [8]: Sau những phát hiện đầu tiên của Balisneri (1709) về nấm gây bệnh trên côn trùng cũng là lúc ra đời ngành khoa học nghiên cứu về bệnh lý côn trùng. Thế kỷ thứ XVIII mới có những tác giả nghiên cứu ban đầu về nấm côn trùng, họ khẳng định nấm côn trùng chính là vi sinh vật gây bệnh đầu tiên được chứng minh về khả năng lan truyền bệnh từ ký chủ này sang ký chủ khác. Năm 1815, Agostino Bassi đã phát hiện ra nấm trắng Muscardin gây bệnh trên tằm, thời gian ấy tuy Bassi chưa có đầy đủ kiến thức về ngành nấm học để phân loại, nhưng tác giả đã phân biệt được mô của ký chủ với nấm ký sinh bằng cách đưa ra phương pháp lan truyền cũng như điều kiện gây bệnh và chính tác giả đã đưa ra biện pháp phòng trừ bằng nấm côn trùng. Như vậy có thể coi Agostino Bassi là nhà bệnh lý học côn trùng đầu tiên. Sau Bassi thì xuất hiện ngày càng nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng nấm côn trùng để phòng trừ các loại sâu hại cây trồng đạt hiệu quả. Những công trình của Oduen (1837) phát hiện về nấm trắng Muscardin ký sinh trên côn trùng không chỉ có trên tằm, mà nấm trắng còn có thể dùng để phòng trừ những loại côn trùng gây hại khác. Năm 1878, Metschnhikov đã phát hiện và phân lập được nấm xanh Entomophthora anisopliae trên sâu non bộ cánh cứng hại lúa mì ( Anisophliae austrinia ), sau này tác giả đổi tên là Metarhizium anisopliae. Sau thời gian đó, Metschnhikov đã tiến hành sản xuất bào tử nấm Metarhizium anisopliae dạng thuần khiết rồi trộn với nền chất bột và phun ra đồng ruộng để phòng trừ sâu non và trưởng thành bọ đầu dài hại củ cải đường (Bothinoderes punctiventris ), hiệu quả đạt được 55 – 80 % sau 10 – 14 ngày thử nghiệm [8]. Lª Anh TuÊn 4 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT Cũng trong thời gian đó ở Mỹ người ta đã sử dụng nấm côn trùng để phòng trừ sâu hại lúa mì. Năm 1888, nhà bác học Snoi đã tiến hành một loạt thí nghiệm với nấm Muscardin màu trắng có tên khoa học là Beauveria globuliera để phòng trừ bọ xít hại lúa mì đạt hiệu quả cao. Các nhà khoa học trường Đại học Tổng hợp Kanzac đã thành lập trạm tuyên truyền để phổ biến vai trò của nấm Beauveria đối với việc lây bệnh trên côn trùng, họ đã gửi hơn 500 kiện nấm Beauveria đến các trang trại để phòng trừ sâu hại củ cải đường. Cuối thế kỷ XIX và những năm đầu thế kỷ XX, các nhà bệnh lý học côn trùng trên thế giới mới công bố những công trình thông qua việc giám định và miêu tả cụ thể về những chủng nấm có khả năng diệt côn trùng [8]. II. Những nghiên cứu cơ bản về nấm Beauveria bassiana 1/ Đặc điểm hình thái Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy năm 2004 [8]: Vì nấm Beauveria bassiana có màu trắng nên người Trung Quốc và người Việt Nam gọi là nấm trắng hay nấm bạch cương. Trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng, nấm bạch cương có sợi màu trắng đến màu crem có pha một ít màu đỏ, da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời. Sợi nấm phân nhánh có vách ngăn, sợi nấm dài khoảng 3-5µm phát triển dày đặc trên môi trường, về sau xuất hiện chi chít các cuống sinh bào tử. Trên cơ thể tằm và các côn trùng khác, sợi nấm mọc nhanh và chẳng mấy chốc đã phủ kín trên bề mặt cơ thể, sợi nấm có dạng phấn trắng khi khô biến thành màu vàng sữa. Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử trần đơn bào không màu, trong suốt không ngăn vách từ hình cầu ( đường kính 1-4 µm ) đến hình trứng ( kích thước 1,5-5,5 µm ). Tế bào sinh bảo tử trần đơn hoặc trong vòng xoắn, phát sinh từ sợi sinh dưỡng mọc thành từng đám, có cuống phình ra. Tế bào sinh bào tử trần có hình zíc zắc nhưng là mấu dạng răng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép. Phần gốc của tế bào sinh bào tử trần hình cầu hoặc hình chai ( kích thước 2,5-3,5 Lª Anh TuÊn 5 x 3,0-6,0 µm ), khi thời gian MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT nuôi cấy kéo dài, trong môi trường những bào tử trần sinh ra sẽ mảnh và kết chặt hơn với nhau. 2/ Một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Beauveria bassiana Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm Beauveria bassiana nói riêng và nấm côn trùng nói chung là nhiệt độ, ẩm độ, độ pH trong môi trường, cũng như phương pháp nuôi cấy. a. Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp nuôi cấy Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc. Trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae cần các nguồn Cacbon, Nito. Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau. Môi trường thích hợp nhất cho nấm phát triển là môi trường có chứa kitin làm nguồn cacbon, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria bassiana sẽ thu được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, nó giúp cho sự phát triển và hình thành bào tử dính (Conidiospore) và bào tử trần (Blastoospore). Tuy nhiên không phải nguồn thức ăn chứa Cacbon và Nito nào cũng đều có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển cũng như sự nảy mầm và hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana, vì ngoài nguồn nitơ vô cơ ra nấm Beauveria bassiana còn sử dụng tốt nguồn hữu cơ như protein, pepton, các axitamin trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho nấm phát triển. Các nguyên tố vi lượng như C ++, Zn++... có tác dụng kích thích cho sự phát triển của nấm. Tùy từng loại nấm Metarhizium hay Beauveria mà chúng ta nghiên cứu để lựa chọn môi trường thích hợp sao cho nấm phát triển tốt nhất. Về phương pháp nuôi cấy theo các tác giả Rombach, Basto Cruz và cộng sự, Hegedus và cs, Miao và cs, Jenkins và Prior, Shimazu và cs thì sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất nấm côn trùng sẽ thu được những kết Lª Anh TuÊn 6 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT quả tốt, vì trong nuôi cấy chìm, người ta đã xác định được khả năng sinh bào tử chồi và lượng sinh khối sinh được từ hai chủng nấm B.bassiana và M.anisopliae là rất cao. [8] b. Ảnh hưởng của nhiệt độ và ẩm độ Nhiệt độ và ẩm độ là 2 yếu tố quan trọng quyết định đến sự phát triển của nấm. Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong phạm vi 25 – 30oC [5]. c. Ảnh hưởng của ánh sáng Nấm Beauveria bassiana phát triển tốt nhất trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6 – 8 giờ cũng đủ cho nấm côn trùng phát triển [5]. d. Ảnh hưởng của độ thoáng khí ( hàm lượng oxi) Hầu hết các loại nấm côn trùng thuộc loại hiếm khí, khi nấm phát triển chúng cần có hàm lượng oxi thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi cũng như trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp thì nấm sẽ phát triển tốt [5]. e. Ảnh hưởng của hàm lượng nước Nấm côn trùng đòi hỏi hàm lượng nước thích hợp, nếu quá khô hoặc quá ướt thì nấm phát triển không tốt, tỷ lệ thích hợp là 30 – 50% tùy theo điều kiện ẩm độ của không khí môi trường [5]. g. Ảnh hưởng của độ pH Phạm vi nấm côn trùng sống ở độ pH từ 3,5 – 8,0, song nấm côn trùng ưa môi trường axit và nấm phát triển thích hợp nhất ở độ pH từ 5,5 – 6 [5]. Lª Anh TuÊn 7 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT III/ Độc tố, cơ chế tác động và triệu chứng của sâu nhiễm nấm Beauveria bassiana 1/ Độc tố Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy [8]: Năm 1696 R.L Hamill và cộng sự đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm bạch cương Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin. Năm 1971 Y.A. Ovehinnokov và cộng sự đã tổng hợp lại độc tố này, tác giả Jame và cs đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất đó là vòng peptid có các sắc tố màu vàng tenelin và basianin, những sắc tố này có thể do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra từ testosteron (C19H28O2) sinh ra. Về mặt hóa học, độc tố Beauvericin có danh pháp là xyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxyizovaleryl). Đây là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-94 oC. Từ một lít môi trường nuôi cấy nấm Beauveria bassiana, các nhà khoa học Trung Quốc ở trường Đại học Tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách được 1,5g độc tố Beauvericin và từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã tách ra được 3,8 g Beauvericin. 2/ Cơ chế tác động Trong tự nhiên, khi bào tử nấm Bb rơi vào cơ thể côn trùng gặp điều kiện thuận lợi, chỉ sau 12-24h thì bào tử nấm nảy mầm. Chúng hình thành sợi nấm đâm xuyên qua lớp vỏ kitin và sau đó phát triển bên trong cơ thể côn trùng hại. Côn trùng hại phải huy động hết các tế bào bạch huyết để chống lại nhưng nấm Bb đã tiết ra độc tố Beauvericin và các chất khác làm phá hủy tế bào bạch huyết. Sợi nấm mọc rất nhiều bên trong cơ thể làm cho cơ thể cứng lại sau đó một thời gian thì nấm mọc ra ngoài, lớp bào tử phủ lên côn trùng hại và lớp bào tử này gặp điều kiện gió đưa vào cơ thể côn trùng khác thì cũng thực hiện cơ chế tác động như trên. Lª Anh TuÊn 8 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT 3/ Triệu chứng của sâu nhiễm bệnh Triệu chứng đặc trưng nhất là sự thay đổi các di động của côn trùng, sự di động này tùy theo mức độ phát triển của bệnh. Khi bị bệnh các mô dần dần bị phá hủy từng phần, lúc đầu côn trùng di động yếu sau ngừng hẳn nằm im một chỗ cho đến khi chết. Khi bị bệnh nấm, vận động của côn trùng ngừng từ 2-3 ngày thậm chí một tuần trước khi nấm phát triển đầy trong thân côn trùng. Chỉ những côn trùng bị thương hay bị bệnh nấm, màu sắc toàn thân mới thay đổi và xuất hiện những vết đen. Khi sâu hại bị bệnh do nấm Beauveria bassiana ở chỗ bào tử bám vào, nấm phát triển vào bên trong thân sâu tạo nên một vệt đen không có hình thù nhất định. Côn trùng chết do nấm thường có màu hồng, vàng nhạt, trắng và toàn thân cứng lại. Khi bị bệnh nấm thân côn trùng bị ngắn lại hoặc khô là do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn. Vi sinh vật gây bệnh trên côn trùng thường tác động đến những mô nhất định, côn trùng bị nấm Beauveria bassiana ký sinh thì tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do enzym lipaza và proteaza của nấm tiết ra, cũng chính nhờ đặc điểm đó mà người ta có thể xác định được côn trùng bị bệnh là do động vật nguyên sinh hay là do nấm bậc thấp (Coelomycidium, Entomophyhora...) gây ra. Hiện tượng chết hoặc gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô là đặc trưng của bệnh nấm, quá trình này tiến triển qua hai giai đoạn: - Hiện tượng chấn thương: Các mô tổn thương bị phá hoại là do nấm từ bên ngoài gây ra, trong trường hợp này các lympho máu đọng lại và mô tái sinh được tạo nên trên bề mặt phần thân côn trùng bị chấn thương. - Hiện tượng nhiễm trùng máu: của côn trùng khi bị bệnh nấm là do lympho máu chứa đầy sợi nấm. IV/ Công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana Hiện nay Viện Bảo vệ thực vật đang sản xuất chế phẩm nấm bạch cương Beauveria bassiana theo các công đoạn như sau: Lª Anh TuÊn 9 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT 1/ Chọn chủng giống: Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy thì chủng nấm (giống nấm) là yếu tố quan trọng quyết định đến chất lượng chế phẩm nấm. Để sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana, Viện Bảo vệ thực vật thường sử dụng chủng nấm Beauveria bassiana đã được phân lập trên sâu róm thông ở Thanh Hóa. Đây là chủng giống mới, nguồn gốc tự nhiên tại địa phương có cây trồng bị sâu hại, nên chủng nấm Beauveria bassiana có hoạt tính rất cao [7]. 2/ Môi trường nhân giống cấp 1 Năm 1992, kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Thùy và cs [8] đã xác định được môi trường nhân giống cấp 1 của nấm Beauveria bassiana chính là môi trường Sabouroud bổ sung thêm khoáng chất (SK), kế thừa từ môi trường Sabouroud. Môi trường Sabouroud: . Agar 20g . Glucoza 40g . Pepton 10g . H20 1000 ml . pH 6,0 Môi trường Sabouroud khoáng chất: . Agar 20g . Glucoza 20g . Pepton 10g . MgSO4.7H20 . KH2PO4 1g 0,5g . H20 1000 ml . pH 6,0 Lª Anh TuÊn 10 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT Tác giả Phạm Thị Thùy cho biết việc xác định được môi trường nuôi cấy là yếu tố rất quan trọng để nấm Beauveria bassiana nói riêng và nấm côn trùng nói chung sinh trưởng, phát triển tốt, nếu môi trường không tốt thì nấm mọc yếu hoặc thậm chí không mọc, nguyên nhân là do trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm côn trùng cần có các nguồn Cacbon, Nito. Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các nguyên tố vi lượng như C ++, Zn++, K+, Mg++ ... có tác dụng kích thích cho sự phát triển của nấm đồng thời duy trì độ pH. Môi trường SK làm giống cấp 1 đã đáp ứng được yêu cầu cho nấm Beauveria bassiana phát triển. 3/ Môi trường nhân giống cấp 2: Sử dụng phương pháp lên mem xốp Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy [8] thì sản xuất sinh khối nấm Beauveria bassiana bằng phương pháp lên men xốp dùng môi trường gồm thành phần chính là cám gạo và bột ngô có bổ sung thêm một số chất phụ gia để tăng khả năng hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana: . Bột cám ngô . Bột ngô . Bột đậu tương ( hoặc đậu xanh) . Trấu ( hoặc bã mía, vỏ lạc) Có thể sản xuất nấm Beauveria bassiana theo phương pháp của Cuba: Môi trường tấm gạo với dung dịch CaCO 3 5%, bằng phương pháp luộc tấm gạo rồi sấy khô, sau đó nhân giống với Beauveria bassiana thuần vào môi trường. 4/ Công nghệ sản xuất nấm Beauveria bassiana bằng phương pháp lên men xốp Tác giả Phạm Thị Thùy và cs đã nghiên cứu sử dụng môi trường sản xuất bao gồm cám gạo 3 phần, bột ngô 1 phần và phụ gia như đường, trấu... môi trường có tỷ lệ nước trên môi trường là 1/3 đảm bảo độ ẩm vừa phải, tơi xốp, nấm phát triển sau 5 ngày trong các bình tam giác hoặc dụng cụ có thể tích lớn. Lª Anh TuÊn 11 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT Chế phẩm được làm khô ở nhiệt độ 45oC trong 8 giờ, kết quả thu được chế phẩm có lượng bào tử trung bình là 5 x 109 bào tử/g. 5/ Tính ổn định của chế phẩm nấm Beauveria bassian - Chất lượng của chế phẩm nấm đạt 109 bt/g - Hàm lượng ẩm trong chế phẩm là 7 -10% - Hiệu quả diệt sâu là trên 70% sau 10 – 15 ngày thí nghiệm - Thời gian bảo quản là từ 1 – 2 năm V. Khái niệm về các loại sâu dùng trong thí nghiệm V.1/ Sâu róm thông ( Dendrolimus punctatus ): Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy [4]: Sâu róm thông là loại sâu phá hoại rất nặng nề các cánh rừng thông. Sâu róm thông chích hút nhựa của cây thông gây ra hiện tượng cháy lá và dẫn đến cây thông bị chết. Sâu róm thông phân bố rộng khắp ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Ở Việt Nam sâu róm thông tập trung nhiều ở các tỉnh miền trung như Thanh Hóa, Hà Tĩnh ... + Đặc điểm hình thái: Bướm trưởng thành có màu nâu. Chiều dài thân 17-18mm. Cánh trước có màu sẫm hơn cánh sau. Mép ngoài cánh trước có nhiều chấm màu nâu sẫm. Trưởng thành đẻ trứng thành từng đám hoặc từng hàng dọc theo lá thông, mỗi bướm có thể đẻ 200-300 quả trứng. Trứng hình bầu dục màu xanh nhạt, sau chuyển sang màu hồng sẫm. Sâu non từ 5-6 tuổi, toàn than màu nâu đen ánh bạc xen lẫn các điểm trắng, toàn phân phủ nhiều lông độc. Lớn đẫy sức có thể dài 60mm. Nhộng màu nâu cánh gián hoặc màu hạt dẻ, thuộc loại nhộng màng, có kén màu trắng sang chứa nhiều long của sâu non bao bọc. + Đặc điểm sinh vật và quy luật phát sinh gây hại: Trưởng thành: ngài đực có xu tính ánh sáng mạnh, ngài cái thích đẻ trứng ở trên lá thông trong rừng được trồng 5 năm trở lên. Sau khi vũ hóa 1-2 giờ, ngài bắt đầu giao phối và sau một thời gian thì đẻ trứng. Thường đẻ trứng vào ban đêm. Lª Anh TuÊn 12 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT Trung bình trong 1 đêm đẻ hơn 200 quả trứng. Sâu non mới nở di chuyển bằng cách nhả tơ. Sau khi nở khoảng nửa ngày, sâu non bắt đầu ăn lá [4]. V.2/ Sâu khoang (Spodoptera litura) Sâu khoang là loại sâu đa thực, ăn rất nhiều loại cây trồng trong đó bao gồm cả các loại rau bắp cải, su hào, rau muống...Sâu khoang thuộc họ ngài đêm Noctuidae thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera, phân bố rộng ở Việt Nam và các nước trên thế giới. Theo tác giả Phạm Thị Nhất [2] thì sâu khoang có một số đặc điểm sau: + Đặc điểm hình thái: Bướm có thân dài 16 – 21 mm, cánh trước xòe rộng 37 – 42 mm có màu nâu vàng, trên cánh có nhiều đường vân đẹp, hình bầu dục có màu xám, xung quanh màu vàng, cánh sau màu trắng xám loang, phản quanh màu tím. Trứng sâu khoang hình bán cầu, mặt trứng có nhiều đường khía dọc ngang, lúc mới đẻ có màu trắng vàng sau chuyển thành màu vàng tro, sắp nở có màu vàng tối. Trứng đẻ thành từng ổ hình bầu dục, dẹt và được phủ một lớp lông màu nâu vàng bên trên. Sâu non hình ống, màu xanh xám tro, vạch lưng màu vàng, có khoang đen ở đốt bụng thứ nhất, gần đầu có 2 chấm đen, sâu đẫy sức dài 38- 51 mm. Sâu làm nhộng ở trong đất, nhộng dài 18- 20 màu nâu đỏ bóng láng. + Tập tính sinh hoạt : Sau khi nở 1 vài ngày, sâu sống tập trung rồi sau đó mới phân tán. Ở tuổi 1, 2 sâu khoang chỉ gặm chất xanh chừa lại màng và gân lá. Tuổi 3 trở đi sâu phân tán và ăn khuyết lá, sâu phá hoại mạnh vào ban đêm, ngày ẩn nấp dưới mặt đất. Bướm hoạt động về đêm, đẻ trứng ở lá, một bướm cái có thể đẻ 1000 trứng. Hàng năm sâu thường phát sinh gây hại mạnh vào tháng 4 đến tháng 10 [2] 3/ Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae ) Sâu xanh bướm trắng là loại sâu hại chủ yếu trên các loại rau cải, xu hào, sâu xanh bướm trắng thuộc bộ cánh phấn Lepidoptera. Lª Anh TuÊn 13 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT Theo tác giả Phạm Thị Nhất [2] thì sâu xanh bướm trắng có một số đặc điểm sau: + Vòng đời của sâu: Ở nhiệt độ 17,4oC và ẩm độ 78,5 % vòng đời sâu kéo dài khoảng 30 ngày, còn ở nhiệt độ 29,3oC và ẩm độ 79,1 % thì vòng đời sâu xanh bướm trắng chỉ kéo dài 19,5 ngày. + Đặc điểm hình thái: Bướm có thân dài từ 15 – 20 mm, cánh trước có màu trắng xòe rộng từ 40 – 50 mm, trứng hình vỏ phích có nhiều khía dọc. Sâu non có nhiều chấm đen, sâu đẫy sức dài 28 – 35 mm. Nhộng màu xanh nhạt hơi vàng dài từ 18 – 20 mm, dính một đầu trên lá rau, hai bên sườn có những chấm đen thưa, giữa lưng nổi hẳn lên một đường như hình xương sống. + Tập tính sinh hoạt: Hàng năm sâu thường xuất hiện nhiều vào tháng 2 đến tháng 5, chúng gây hại chủ yếu trên nhóm rau họ thập tự ( rau cải, su hào, cải bắp, súp lơ...). Bướm cái đẻ trứng rải rác từng quả trên lá rau, một bướm có thể đẻ được 150 trứng. Sau khi nở sâu non bắt đầu gặm nhấm lá xanh và chừa lại màng lá, từ tuổi 2 trở đi sâu cắn thủng lá làm lá bị khuyết [2] 4/ Sâu tơ ( Plutella xylostella ) Sâu tơ là loại sâu hại nguy hiểm trên rau họ thập tự, sâu thuộc họ ngài rau Yponomeutidae, bộ Thysanoptera. Sâu tơ hại tất cả các loại rau họ cải có giá trị kinh tế như bắp cải, su hào, súp lơ... gây thiệt hại về năng suất cũng như chất lượng rau. Ở tất cả các nước có trồng rau họ cải trên thế giới đều có nguy cơ bị sâu tơ tấn công, đặc biệt là các nước trong vùng Nam và Đông Nam Châu Á. Theo tác giả Phạm Thị Nhất [2] thì sâu tơ có một số đặc điểm sau: + Đặc điểm hình thái: Sâu tơ có bướm nhỏ, dài từ 6 – 7 mm, cánh trước xòe rộng 13 – 16 mm màu nâu xám, dọc mép trong có đường sọc màu nhạt hơn, chia thành ba đoạn. Cánh sau có màu xám, có lông nhỏ dài và mịn. Trứng sâu tơ hình bầu dục, hơi tròn và dài khoảng 4 – 5 mm. Sâu non hình ống, màu xanh nhạt có nhiều đốt thân, mỗi đốt thân có nhiều lông tơ, sâu đẫy sức dài khoảng 9 – 12 mm, đầu màu nâu vàng có các phiến cứng trên có những chấm màu nâu nhạt. Nhộng sâu tơ màu xanh nhạt hoặc vàng nhạt, dài 6 – 10 mm được bọc trong kén mỏng màu trắng xốp, dạng lưới. Lª Anh TuÊn 14 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT + Vòng đời sâu: Từ 20 – 22 ngày, sâu non có 4 tuổi, thời gian phát triển kéo dài khoảng 11- 15 ngày, nhộng 7 ngày, các lứa sâu tơ nở gối nhau liên tiếp trong suốt vụ rau. + Tập tính sinh hoạt: Bướm hoạt động cả ngày lẫn đêm, ban ngày đậu ở mặt dưới lá, sâu non mới nở đục lá tạo thành các đường rãnh. Từ tuổi 2 sâu sống ngay trên mặt lá và ăn lá, để lại biểu bì lá tạo thành các lỗ trong mờ. Sâu non thường nhả tơ để di chuyển [2]. VI/ Một số kết quả đạt được trong phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Beauveria bassiana 1/ Trên thế giới Vài chục năm gần đây, các công trình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana trở nên phong phú và phát triển trên thế giới. Tác giả Phạm Thị Thùy (2004) cho biết: Ở Úc, các nhà khoa học đã sử dụng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ bọ hung hại mía và bọ hung hại củ cải đường đạt hiệu quả tốt, những loài bọ hung trên rất khó phòng trừ bằng thuốc hóa học. Các nhà khoa học sử dụng nấm Beauveria bassiana ở nồng độ 8 x 107 bào tử/ ml để phòng trừ ruồi hại rễ bắp cải, thí nghiệm ngoài đồng ruộng được tiến hành với 15ml dung dịch nấm trên 1 cây, kết quả cho thấy nấm Beauveria bassiana đạt hiệu quả cao với ruồi hại bắp cải, nấm Beauveria bassiana đã làm giảm mật độ của sâu và nhộng khoảng 70%. Tại Nhật Bản năm 1988 một số nhà khoa học đã phòng trừ ròi hại rễ củ cải bằng nấm Beauveria bassiana. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Dùng 1 bó củ cải có 10 trứng ròi hại rễ để trong 1 lọ. Trứng được sắp xếp quanh củ cải với mỗi trứng đặt cách nhau 3cm. Nồng độ bào tử nấm đưa vào thí nghiệm là 1 x 109 bào tử/ml ( nấm phát triển trên môi trường PDA ) với 5 lần nhắc lại, kết quả cho hiệu lực trên 75% ( trong điều kiện nhiệt độ 23 oC và ẩm độ không khí trên 70% ) sau 10 ngày thí nghiệm. Lª Anh TuÊn 15 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT Ở Mỹ, người ta còn dùng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ ruồi trắng hại lá khoai lang. Trường Đại học tổng hợp Florida (USA) phối hợp với liên đoàn Ciba và Geigy sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana để phòng trừ tập đoàn sâu voi hại rễ cây chanh và các côn trùng hại khác. Ở Trung Quốc, các tác giả Am và Wu đã sử dụng chủng nấm Paecilomyces farinosus và Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông đạt hiệu quả cao [8]. 2/ Ở Việt Nam Từ năm 1990 thế kỷ XX, với sự giúp đỡ của Cục Bảo vệ thực vật và được sự tài trợ của tổ chức bánh mỳ thế giới, năm 1991 nhờ chương trình Công nghệ sinh học cấp nhà nước, Trung tâm sinh học Viện Bảo vệ thực vật đã nghiên cứu nấm Beauveria bassiana, với mục đích: Xác định nấm Beauveria bassiana có trên một số sâu hại cây trồng, đồng thời tiến hành nghiên cứu để tìm khả năng phát triển của nấm Beauveria bassiana trên một số trường hợp nhân tạo nhằm tiến tới nghiên cứu hoàn thiện quá trình sản xuất tạo chế phẩm trừ sâu sinh học. Kết quả nghiên cứu sản xuất, thử nghiệm và ứng dụng chế phẩm nấm trừ sâu hại cây trồng đến nay đã đạt được nhiều thành công đáng kể. Năm 1992 – 1993, Phạm Thị Thùy và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm chế phẩm nấm Beauveria bassiana trừ sâu đo xanh hại đay tại hợp tác xã Liên Khê (Châu Giang – Hưng Yên). Kết quả đạt 66,4% - 86,4% tỷ lệ sâu chết sau 7 – 10 ngày phun thuốc. Năm 1995-1996 tác giả đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm Beauveria bassiana trừ sâu hại cây trồng và đã được thử nghiệm trên rầy nâu hại lúa ngoài đồng ruộng ở một số địa phương, kết quả sau 10 ngày phun hiệu lực trừ rầy nâu đạt từ 50 – 60 % và kéo dài đến 15 ngày sau phun thuốc. Năm 1998, Phạm Thị Thùy và cộng sự đã ứng dụng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông Dendrolimus punctatus ở Lâm trường Hà Trung – Thanh Hóa và Lâm trường Phù Bắc Yên – Sơn La, kết quả phun nấm Beauveria bassian với nồng độ 4 x 10 13 bào tử/ha, tỷ lệ sâu róm thông Lª Anh TuÊn 16 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT chết trung bình sau một tháng là 78,2%, sau 1,5 tháng thì tỷ lệ sâu chết trung bình đạt 93,6% trong điều kiện nhiệt độ trung bình là 29,1 oC và ẩm độ trung bình là 83,7%. [4], [6] Các ứng dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana phòng trừ sâu hại rau của tác giả Phạm Thị Thùy và cs từ năm 2002 đến nay đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, điển hình là phòng trừ sâu xanh bông, sâu tơ, sâu xanh bướm trắng hại rau ở An Hải – Hải Phòng năm 2001, ở Đồn Bẩm – Đồng Hỷ – Thái Nguyên năm 2002 – 2004. [8] Tóm lại: Nấm Beauveria bassiana có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng, đặc biệt là sâu róm thông, do đó việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất để tạo chế phẩm nấm Beauveria bassiana đạt chất lượng là hoàn toàn cần thiết, nhằm cung cấp cho nông dân để phòng trừ sâu hại cây trồng đạt hiệu quả cao theo hướng bảo vệ môi trường. Lª Anh TuÊn 17 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I/ THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU: 1. Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm nấm côn trùng thuộc Trung tâm Đấu tranh sinh học – Viện Bảo vệ thực vật – Từ Liêm – Hà Nội. 2. Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2010 đến hết tháng 5/2010 II/ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU: 1. Chủng vi sinh vật sử dụng: Chủng vi nấm Beauveria bassiana do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. 2. Một số côn trùng sử dụng trong thí nghiệm: - Sâu róm thông (Dendrolimus punctatus) thu bắt tại rừng thông Đông Sơn – Thanh Hóa. Lấy sâu tuổi 2 – 3 thử nghiệm - Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) thu bắt và nuôi tại Viện BVTV bằng lá rau để lấy sâu tuổi 2 – 3 làm thử nghiệm. - Sâu khoang (Spodoptera litura) thu bắt và nuôi tại Viện BVTV bằng lá rau để lấy sâu tuổi 2 – 3 làm thử nghiệm. - Sâu tơ (Plutella xylostella) thu bắt và nuôi tại Viện BVTV bằng lá rau lấy sâu tuổi 2- 3 làm thử nghiệm. 3. Dụng cụ và hóa chất dùng trong thí nghiệm : a) Hóa chất gồm: - Agar - Pepton - Glucoza Lª Anh TuÊn 18 MSSV: 506301090 Khãa luËn tèt nghiÖp Khoa CNSH & MT - NaNO3 - FeSO4 - Muối khoáng, cồn, nước cất, chất bám dính agral b) Một số thiết bị và dụng cụ: - Kính hiển vi, - Buồng đếm hồng cầu, - Nồi khử trùng, - Tủ sấy, - Tủ định ôn, - Buồng cấy nấm, - Dụng cụ thủy tinh và một số dụng cụ khác. III/ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana. Sử dụng phương pháp lên men bề mặt ( lên men xốp) Môi trường sản xuất ( mt cơ bản) - Cám gạo - Bột ngô - Bột đậu tương ( Phạm Thị Thùy .2004.) - Trấu - Nước 1.1/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana trên môi trường sản xuất. Bố trí thí nghiệm với 4 công thức: - Công thức 1: 80% cám gạo, 10% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước. Lª Anh TuÊn 19 MSSV: 506301090