Tài liệu đánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra vi sinh vât ̣ truyề n thống và phương phá đo atp quang sinh họ trong qua trìh kiểm tra vê ̣ sinh của dây chuyền sản xuất bia ở việt nam.

Đánh giá sự tương thić h giữa phương pháp kiể m tra vi sinh vâ ̣t truyề n thố ng và phương pháp đo ATP quang sinh học trong quá trình kiể m tra vê ̣ sinh của dây chuyề n sản xuấ t bia ở Viện Công nghiệp thực phẩm Trầ n Thi ̣Hảo Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Vi sinh vâ ̣t; Mã số: 604240 Người hướng dẫn: TS. Phạm Văn Thành Năm bảo vệ: 2011 Abstract. Tổng quan tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam, thực trạng vệ sinh ở một số cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm và vi sinh vật gây ngộ độc thường gặp trong thực phẩm; công nghệ sản xuất bia, những công đoạn cần thiết phải kiểm tra vệ sinh trong sản xuất. Nghiên cứu các phương pháp kiểm tra vệ sinh trong sản xuất hiện nay; giới thiệu về phương pháp ATP quang sinh. Kiểm tra quá trình vệ sinh trong dây chuyền công nghệ sản xuất bia ở cơ sở sản xuất của Viện Công nghiệp thực phẩm; các vị trí kiểm tra là các vị trí trọng yếu của quá trình như các tec lên men và các tec sản phẩm, máy lọc sản phẩm. Trình bày các phương pháp nghiên cứu: phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống; phương pháp xác định độ sạch bằng ATP quang sinh. Đưa ra kết quả và thảo luận: phương pháp phân tích truyền thống; phương pháp ATP quang sinh học. Đánh giá sự tương thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống và đo ATP quang sinh. Khảo sát ứng dụng phương pháp tạo màu xác định tổng số Coliforms trên máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre). Keywords. Vi sinh vật; Sinh học; Vệ sinh; Công nghiệp thực phẩm; Ngộ độc thực phẩm Content. Thực phẩm là nhu cầu thiết yếu hàng ngày của mỗi con người. An toàn thực phẩm đã trở thành vấn đề toàn cầu; trước những hiểm họa luôn rình rập, đe dọa đời sống con người bởi các thực phẩm không an toàn, đòi hỏi mỗi quốc gia phải có những quốc sách để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm. 1 Trên thực tế, một thực trạng còn bức xúc trong ngành sản xuất chế biến thực phẩm ở nước ta là chất lượng vệ sinh còn rất kém ở nhiều cơ sở sản xuất. Những yêu cầu nghiêm ngặt về vệ sinh an toàn thực phẩm trong sản xuất chưa được quan tâm và đầu tư thích đáng. Mặt khác do lợi nhuận mà một số ít nhà cung cấp đã sử dụng các hóa chất độc hại để chế biến, nuôi trồng và sản xuất các sản phẩm thực phẩm; gây ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe người tiêu dùng. Việc sử dụng các thực phẩm không đảm bảo chất lượng vệ sinh có thể gây ngộ độc và gây ra các bệnh tiêu hóa cấp tính cho người sử dụng, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tới tử vong. Về lâu dài, nếu các độc tố tích lũy dần dần tới một ngưỡng nhất định có thể sẽ phát sinh các bệnh nguy hiểm, làm biến đổi cấu trúc gen gây dị tật, dị dạng cho các thế hệ tiếp theo. Trước thực trạng trên, ngoài việc khuyến khích các cơ sở sản xuất thực hiện vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà nước và chính phủ còn chỉ thị về việc tăng cường công tác bảo đảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm để từng bước nâng cao chất lượng sản phẩm. Tuy nhiên phương thức quản lý kiểm tra chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm dựa trên việc kiểm tra chất lượng sản phẩm cuối cùng không đảm bảo được chất lượng vệ sinh sản phẩm trong khi sản xuất. Điều này chỉ được đảm bảo khi có sự kiểm soát chủ động và hệ thống các yếu tố chất lượng và điều kiện vệ sinh trong toàn bộ quá trình sản xuất, chế biến, cung ứng mới có khả năng đảm bảo an toàn thực phẩm. Để đáp ứng được yêu cầu này không gì khác là phải áp dụng các phương pháp kiểm tra nhanh mức độ vệ sinh trong các dây chuyền sản xuất, chế biến thực phẩm . Góp phần vào sự kiểm soát vệ sinh an toàn trong sản xuất đồ uống nói chung và sản xuất bia nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện kiểm tra vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia, với đề tài: “ Đánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra vi sinh vật truyền thống và phương pháp đo ATP quang sinh học trong quá trình kiểm tra vệ sinh của dây chuyền sản xuất bia ở Viện công nghiệp thực phẩm”. I. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Kiểm tra quá trình vệ sinh trong dây chuyền công nghệ sản xuất bia ở cơ sở sản xuất của Viện Công nghiệp thực phẩm. Các vị trí kiểm tra là các vị 2 trí trọng yếu của quá trình như các tec lên men và các tec sản phẩm, máy lọc sản phẩm. Chỉ tiêu lựa chọn kiểm tra là: tổng nấm men, nấm mốc, tổng Coliform và E.coli, tổng vi sinh vật hiếu khí 2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị, hóa chất a. Dụng cụ thiết bị + Máy đo ATP HY_LITE 2 + Máy quang phổ UV-VIS U-1900 + Nồi khử trùng + Tủ ấm + Tủ cấy + Máy đo pH + Pipet tự động, đầu hút + Đĩa petri, giấy nhôm, đèn cồn, bình xịt cồn, đũa thủy tinh,… b. Hóa chất + Plate count agar ( Peptone từ Carein 5,0g; cao nấm men 2,5g; D+ gluco 1,0g; agar 14,0g) Cách pha: Hòa tan 22,5 g PCA trong 1000 mL nước cất. Hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,0 ± 0,2 ở 25 oC. + Lactose broth ( Peptone 10g; lactose 10g; beef extract 6g; nước cất 1000 mL). Cách pha: Môi trường đơn: hòa tan 13g lactose broth trong 1000mL nước cất. Môi trường kép: hòa tan 26g lactose broth trong 1000 mL nước cất. Hòa tan môi trường, sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 6,9 ± 0,2 ở 25 oC. 3 + Brilliant-green lactose (bile) broth ( Peptone 10g; lactose 10g; OX bile 20g; Brilliant – green 13 mL; nước cất 1000 mL). Cách pha: Môi trường đơn: hòa tan 40g trong 1000 mL nước cất. Môi trường kép: hòa tan 80g trong 1000 mL nước cất. Hòa tan môi trường, sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,2 ± 0,2 ở 25 oC. Tryptone Tryptone ( Peptone từ casein ): 20g. NaCl: 5g. Nước cất 1000 mL. Cách pha: Hòa tan môi trường, sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,5 ± 0.2 ở 25 oC. + R2A agar (Yeast extract 0,5; proteose peptone 0,5; casein hydrolysat 0,5; glucose 0,5; starch soluble 0,5; natri pyruvat 0,3; K2HPO4 0,3; MgSO4 0,05; agar 12,0). Cách pha: Hòa tan 15.2 g trong 1000 mL nước cất. Đem hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 15 phút. Sau khử trùng pH 7,2 ± 0,2 ở 25 oC. + Kovacs + Oxidase + Fluoro cult (Tryptone 5,0; NaCl 5,0; Sorbit 1,0; Tryptophan 1,0; 4brom-4chlor-3 indoly –B-D- glactogyranoside (X-gal) 0,08; 4metylumbelliferyl –β-D-glucuronide (MGG) 0.05; 1-isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside 0.1 ). Cách pha: Môi trường đơn: cân 17g/1000mL nước cất 4 Môi trường kép: cân 34g/1000mL nước cất Hòa tan môi trường, sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 6,8 ± 0,2 ở 25 oC. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống Phương pháp truyền thống là phương pháp phổ biến nhất trong các nghiên cứu vi sinh vật học. Trên môi trường đặc mỗi vi sinh vật sẽ phát triển thành khuẩn lạc hoặc sự sinh khí và biểu hiện đục ở ống nghiệm. Dựa trên đấy có thể kiểm tra số lượng vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích của dịch nghiên cứu. Phương pháp đếm khuẩn lạc thường được sử dụng để kiểm tra số lượng nấm men, nấm mốc. 2.2.2.1.1. Phương pháp xác định tổng số Coliform và E.coli Cấy vào 5 ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ kép với một lượng 10 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngược. Tiếp theo, cấy vào 5 ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ đơn với một lượng 1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngược. Cấy vào 5 ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ đơn với một lượng 0.1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngược. Ủ các ống sau khi cho mẫu vào ở nhiệt độ 35oC trong 24 hoặc 48 h và quan sát. Với những ống có biểu hiện đục và sinh khí, chuyển tiếp lần lượt 10 mL , 1mL, 0.1mL vào 5 ống môi trường brilliant kép và 5; 5 ống môi trường Brilliant đơn, nuôi tiếp ở 35oC sau 48 h. sau đấy quan sát và đọc kết quả theo bảng kết quả trong ISO 9308-phần II. Mẫu có coliform với biểu hiện đục và sinh khí ở ống. Chuyển tiếp 10 mL, 1mL, 0.1 mL vào 5 ống môi trường tryptone kép và 5; 5 ống môi trường Tryptone đơn, nuôi tiếp ở 44oC sau 24 h. Cho vào mỗi ống vài giot Kovacs, nếu biểu hiện màu hồng trong ống, chứng tỏ sự có mặt của E.coli. 5 2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc Chuẩn bị dịch pha loãng và môi trường đĩa thạch. Nấu từng loại môi trường thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. Hòa tan môi trường rồi phân phối vào các lọ, khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1mL mẫu với tỷ lệ pha loãng nhất định cho vào các hộp đĩa thạch đã được khử trùng, mỗi mức pha loãng dùng 4 đĩa thạch. Sau đấy rót vào mỗi hộp đĩa khoảng 10 mL môi trường thạch sau khử trùng và để nguội ở 40-50oC. Đậy nắp và xoay tròn mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội đến khi mặt thạch đông lại, ghi số mẫu và nồng độ pha loãng lên mỗi đáy hộp petri và bọc giấy báo rồi đem nuôi ở 35oC và đọc kết quả sau 48h ± 3. 2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí Sử dụng môi trường R2A agar, hòa tan với lượng 15,2g/1000 mL, tiếp theo đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1 mL mẫu hoặc mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri đã được khử trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trường R2A agar đã khử trùng, đậy nắp và xoay tròn đều mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội, đợi khi mặt thạch đông lại hoàn toàn sau đấy ghi tên mẫu và nồng độ pha loãng lên đáy hộp petri, bao giấy rồi đem nuôi ở 35oC trong vòng 48h ± 3. Khi đủ thời gian, đem ra đọc kết quả bằng cách đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch. Sau đấy báo cáo số khuẩn lạc trên một đơn vị thể tích mẫu tương ứng. 2.2.2.2. Phương pháp xác định độ sạch bằng ATP quang sinh Để nghiên cứu ứng dụng phương pháp kiểm tra nhanh vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia bằng đo ATP quang sinh, các bước cần phải tiến hành như sau: - Nhận dạng các điểm kiểm tra: Các điểm kiểm tra được coi là các điểm kiểm soát tới hạn (CCP), đại diện cho hiệu quả của quá trình vệ sinh. Kết quả thu được sẽ phản ánh thực tế hiệu quả của quá trình vệ sinh. Các điểm kiểm tra nói chung được chia làm hai nhóm: Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm và nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm. 6 - Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn cứ sơ đồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp từng vị trí kiểm tra. Thu thập dữ liệu và xây dựng giới hạn thường quy: Nội dung này giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện tại của các vị trí kiểm tra. Những dữ liệu này bao gồm tại các vị trí kiểm tra ở cả trạng thái bẩn và trạng thái đã vệ sinh sạch sẽ. - Xác định các giá trị giới hạn: Sau khi có đủ các số liệu về tình hình vệ sinh ở từng vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất và những kết quả kiểm tra vệ sinh thông thường sẽ tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh bằng ATP quang sinh. - Đo ATP quang sinh bằng thiết bị đo HY_LITE 2. Đặc tính kỹ thuật của máy: + Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU + Có thể lưu hơn 2000 kết quả đo + Tín hiệu nền < 10 RLU + Các dạng kiểm tra: HACCP, Test and store, Test only + Đầu dò: photomultiplier (PMT) loại cực nhạy có chức năng bảo vệ quá tải Trong phương pháp xác định bằng ATP quang sinh có hai dạng dụng cụ lấy mẫu được sử dụng + Que lấy mẫu bề mặt: Bôi lấy mẫu: Rút que lấy mẫu ra khỏi dụng cụ Clean-trace, bôi lên bề mặt kiểm tra với diện tích khoảng 10cm2 Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Clean-trace, ấn xuống và lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây. Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Clean-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả khoảng 10 giây sau đấy. + Que lấy mẫu nước: Bôi que lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Aqua- trace, nhúng que lấy mẫu vào dung dịch kiểm tra 7 Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Aqua-trace, lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây. Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Aqua-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả trong vòng 10 giây sau đấy. 2.2.2.3. Ứng dụng máy đo quang UV-VIS U-1900 Đặc tính kỹ thuật Hệ quang: Ratio beam Bươc sóng: 190-1100nm Độ rộng dải quang phổ: 4 nm Stray light: trong 0.5 % (220 nm NaI; 340 nm NaNO2) Độ chính xác bước sóng: ± 0.5 nm Độ tái lặp bước sóng: ± 0.3 nm Dạng đo: Photometry, Wavelength scan, Time scan, Multiple, Wavelength measurement Photometric range: Abs (-3.000 tới 3.000) % T (0 tới 300%T) Nồng độ (0.000 tới 9999) Photometric Accuracy : ± 0.002 Abs ( 0 tới 0.5 Abs) ± 0.004 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs) % 0.3 T Photometric repeatability : ± 0.001 Abs ( 0 tới 0.5 Abs) ± 0.002 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs) % 0.15 T Tốc độ scan bước sóng: 10, 100, 200, 400, 800, 1200, 2400, 3600 nm/phút Baseline stability (độ trôi ): 0.0004 Abs/h (500nm, 2 tiếng sau khi bật máy) Baseline flatness: ± 0.002 Abs (200 tới 950 nm) Baseline level: ± 0.00015 Abs (500nm) 8 Nguồn sáng: WI và đèn D2 Detector: Silicon photodiode Tiến hành: Các mẫu môi trường phát quang được chuẩn bị. Sử dụng cuvet 20 mm cho phép đo. Chọn dải quét bước sóng tà 190 nm - 1100 nm. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chúng tôi thực hiện kiểm tra vệ sinh ở một số điểm trọng yếu trong dây chuyền sản xuất bia như: + Các tec lên men + Máy lọc sản phẩm + Các tec sản phẩm 3.1. Phƣơng pháp phân tích truyền thống 3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men  Tec lên men 1 Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 1 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x106 5.8 x106 5.2 x104 1.5 x103 Tổng nấm men, nấm mốc 4.2 x 103 3.7 x103 3.2 x103 1.0 x 102 Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0 Tổng Coliform (MPN) 4 2,0 2,0 <2,0  Tec lên men 2 Bảng 3: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 2 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 9 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 4.2 x106 3.7 x106 2.1 x104 1.0 x103 Tổng nấm men, nấm mốc 3.6 x103 3.7x103 1.9 x103 1.0 x102 0 0 0 0 2,0 4,0 2,0 2,0 Tổng E.coli (MPN) Tổng Coliform (MPN)  Tec lên men 3 Bảng 4: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 3 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.7 x106 5.5 x106 4.7 x104 1.8 x103 Tổng nấm men, nấm mốc 3.4 x103 3.3x103 2.6 x103 0.5 x 102 0 0 0 0 4,0 2,0 <2,0 2,0 Tổng E.coli (MPN) Tổng Coliform (MPN) Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm  Máy lọc sản phẩm đợt 1 Bảng 5: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 1 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.2 x103 5.9 x103 3.0 x102 0.5 x102 Tổng nấm men, nấm mốc 5.6 x102 5.7x102 2.0 x102 1.3 x 10 0 0 0 0 2,0 2,0 4,0 <2,0 Tổng E.coli (MPN) Tổng Coliform (MPN)  Máy lọc sản phẩm đợt 2 10 Bảng 6: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 2 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.1 x103 6.0 x103 2.0 x102 5 x10 Tổng nấm men, nấm mốc 4.7 x102 4.8 x102 3.0 x102 12 0 0 0 0 4,0 <2,0 2,0 <2,0 Tổng E.coli (MPN) Tổng Coliform (MPN)  Máy lọc sản phẩm đợt 3 Bảng 7: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 3 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.9 x103 5.7 x103 1.0 x102 20 Tổng nấm men, nấm mốc 5.0 x102 4.7 x102 5.0 x10 12 0 0 0 0 2,0 2,0 2,0 <2,0 Tổng E.coli (MPN) Tổng Coliform (MPN) Kiểm tra ở các tec sản phẩm  Tec sản phẩm 1 Bảng 8: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.3 x103 6.2 x103 10 x102 20 Tổng nấm men, nấm mốc 4.8 x102 4.2 x102 3.0 x10 17 0 0 0 0 2,0 <2,0 2,0 <2,0 Tổng E.coli (MPN) Tổng Coliform (MPN)  Tec sản phẩm 2 11 Bảng 9: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 2 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.0 x103 6.1 x103 8.0 x102 12 Tổng nấm men, nấm mốc 5.7 x102 5.4 x102 6.2 x10 14 0 0 0 0 2,0 <2,0 2,0 <2,0 Tổng E.coli (MPN) Tổng Coliform (MPN)  Tec sản phẩm 3 Bảng 10: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 3 Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x103 4.8 x103 9 x102 17 Tổng nấm men, nấm mốc 4.8 x102 4.5 x102 3.0 x10 11 0 0 0 0 2,0 2,0 2,0 <2,0 Tổng E.coli (MPN) Tổng Coliform (MPN) 3.2. Phƣơng pháp ATP quang sinh học 3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở các tec lên men Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU) 1 Vệ sinh lần 1 6608 5500 6740 2 Vệ sinh lần 2 5460 4673 6580 3 Vệ sinh lần 3 520 510 495 12 4 295 Vệ sinh lần 4 297 285 Khi vệ sinh các tec lên men ở lần rửa thứ 1 và thứ 2 nước còn bẩn, ở các tec đo được đều ở khoảng 6000 RLU. Từ lần 3 trở đi mức độ vệ sinh đã khá hơn, ở các tec đo được khoảng 500 RLU. Kết thúc quá trình kiểm tra (lần 4) mẫu đo được đạt ở mức dưới 300 RLU ở cả 3 tec 3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm Mẫu lấy ở máy lọc sản phẩm được tiến hành sau khi xả tháo vải lọc, xả bỏ cặn lần đầu tiên trên các bản lọc. Bảng 12: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở máy lọc sản phẩm Số thứ tự Tên mẫu Đợt 1 (RLU) Đợt 2 (RLU) Đợt 3 (RLU) 1 Vệ sinh lần 1 790 795 787 2 Vệ sinh lần 2 792 620 690 3 Vệ sinh lần 3 254 265 235 4 Vệ sinh lần 4 150 120 137 Ở hai lần vệ sinh đầu, máy lọc sản phẩm vẫn chưa được sạch, sau lần thứ 3 vệ sinh kết quả RLU ở cả ba đợt đều nhỏ hơn 300 RLU. Ở máy lọc sản phẩm chỉ sau 3 lần đã có thể đạt yêu cầu vệ sinh. 3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm Bảng 13: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở các tec sản phẩm Số thứ tự Tên mẫu 1 Vệ sinh lần 1 870 734 674 2 Vệ sinh lần 2 723 627 580 3 Vệ sinh lần 3 225 243 235 Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU) 13 4 131 Vệ sinh lần 4 127 130 Sau lần 1 và lần 2, quá trình vệ sinh vẫn không thay đổi đáng kế. Đến lần 3, ở tất cả các tec đều đạt kết quả dưới 300 RLU. Cũng như ở máy lọc sản phẩm, tec sản phẩm cũng đạt yêu cầu sau 3 lần vệ sinh. 3.3. Đánh giá sự tƣơng thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống và đo ATP quang sinh 3.3.1. Mẫu đã biết trước nồng độ Để so sánh sự tương thích, chúng tôi chuẩn bị các mẫu thử đã biết trước nồng độ. Mẫu được chuẩn bị từ nấm men Saccharomyces carlbergensis dùng trong sản xuất bia, với nồng độ ban đầu là 3.5 x 106 tế bào/mL Các mẫu được chuẩn bị với nhiều mức nồng độ khác nhau với hệ số pha loãng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 kết quả được trình bày ở bảng dưới đây. Bảng 14: Kết quả phân tích mẫu đã biết trước nồng độ bằng cả phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh. Tên mẫu Tổng vi sinh vật (CFU) Đo ATP (RLU) Mẫu ban đầu 3.5 x 106 2302 Mẫu 10-1 3.5 x 105 747 Mẫu 10-2 3.5 x 104 243 Mẫu 10-3 3.5 x 103 158 Mẫu 10-4 3.5 x 102 132 Qua bảng kết quả ta thấy kết quả đo được từ phương pháp ATP quang sinh và tổng số tế bào nấm men đếm được có sự tương thích, số đơn vị RLU tăng dần khi số lượng tế bào tăng dần. Ở giai đoạn pha loãng giữa nồng độ mẫu 10-4 và mẫu 10-3, kết quả thay đổi không nhiều, nhưng có sự nhảy vọt giữa mẫu 10-1 và 10-2 và đặc biệt là từ mẫu ban đầu so với mẫu đã pha loãng 10 lần ( Mẫu 10-1). 14 3.3.2. Mẫu trên dây truyền sản xuất bia a. Kiểm tra ở tec lên men  Tec 1 Bảng 15: Kết quả phân tích ở tec lên men 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU) Rửa lần 1 5.8 x 106 6608 Rửa lần 2 5.4 x106 5460 Rửa lần 3 5.2 x 104 520 Rửa lần 4 1.5 x 103 295  Tec 2 Bảng 16: Kết quả phân tích ở tec lên men 2 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU) Rửa lần 1 4.2 x 106 5500 Rửa lần 2 3.7 x106 4673 Rửa lần 3 2.1 x 104 510 Rửa lần 4 1.0 x 103 297  Tec 3 Bảng 17: Kết quả phân tích ở tec lên men 3 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU) 15 Đo ATP (RLU) Rửa lần 1 5.7 x 106 6740 Rửa lần 2 5.5 x106 6580 Rửa lần 3 4.7 x 104 495 Rửa lần 4 1.8 x 103 285 Nhận xét: Quá trình vệ sinh, rửa lần 1 và lần 2 chưa có sự thay đổi nhiều thể hiện ở cả phương pháp xác định truyền thống và phương pháp ATP quang sinh. Từ lần rửa thứ 3, ở các tec lên men mới thấy biểu hiện rõ rệt sự thay đổi vệ sinh, và đến lần rửa cuối (lần 4) cùng thì sự đảm bảo vệ sinh mới được hoàn tất. Nếu dùng phương phương kiểm tra nhanh bằng ATP quang sinh thì tec lên men hoàn thành quá trình vệ sinh khi chỉ số RLU nhỏ hơn 300. b. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm  Đợt 1 Bảng 18: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU) Rửa lần 1 6.2 x 103 790 Rửa lần 2 5.9 x103 792 Rửa lần 3 3.0 x 102 254 Rửa lần 4 0.5 x 102 150  Đợt 2 Bảng 19: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 2 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật 16 Đo ATP (RLU) hiếu khí (CFU) Rửa lần 1 6.1 x 103 795 Rửa lần 2 6.0 x103 620 Rửa lần 3 2.0 x 102 265 Rửa lần 4 0.4 x 102 120  Đợt 3 Bảng 20: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 3 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU) Rửa lần 1 5.9 x 103 787 Rửa lần 2 5.7 x103 690 Rửa lần 3 1.0 x 102 235 Rửa lần 4 2.0 x 10 117 Đo ATP (RLU) Nhận xét: Ở máy lọc sản phẩm từ sau lần rửa thứ ba sự đảm bảo vệ sinh đã được hoàn tất, ở cả ba đợt chỉ số RLU đo được đều nhỏ hơn 300. a. Kiểm tra ở các tec sản phẩm b. Tec 1 Bảng 21: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU) Rửa lần 1 6.3 x 103 870 17 Rửa lần 2 6.2 x103 723 Rửa lần 3 10 x 102 225 Rửa lần 4 2.0 x 10 131  Tec 2 Bảng 22: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 2 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU) Rửa lần 1 6.0 x 103 734 Rửa lần 2 6.1 x103 627 Rửa lần 3 8.0 x 102 243 Rửa lần 4 1.2 x 10 127  Tec 3 Bảng 23: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 3 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU) Rửa lần 1 5.4 x 103 674 Rửa lần 2 4.8 x103 580 Rửa lần 3 9.0 x 102 235 Rửa lần 4 1.7 x 10 130 Nhận xét: Ở các tec lên men sau lần rửa vệ sinh thứ 3, các tec đã đạt yêu cầu về vệ sinh, các chỉ số RLU đo được ở cả 3 tec sau lần rửa thứ 3 đều nhỏ hơn 300. 18 3.4. Khảo sát ứng dụng phƣơng pháp tạo màu xác định tổng số Coliform trên máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre) Sử dụng nước thải sau vệ sinh của xưởng sản xuất để kiểm tra Coliforms. Từ nguồn nước thải đã xác định được Coliforms tổng số (ký hiệu M) đem pha loãng ra các nồng độ khác nhau M x 5 -1; M x 10 -1; M x 10 -2 được các mẫu có chứa Coliforms khác nhau để nuôi cấy, sau đó đem đo trên quang phổ UV-VIS. Chúng tôi tiến hành scan bước sóng ở ba mức độ nồng độ ( M x 5 -1; M x 10 -1; M x 10 -2). từ bước sóng 190nm -1100nm, tốc độ 100nm/phút. Kết quả thu được như sau:  Nồng độ M x 10-2mL Bảng 24: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 10-2 ở bước sóng 190 – 1100nm Peak Valley Thứ tự WL Abs WL Abs 1 967 0.467 1078 0.265 2 655 0.930 908 0.322 3 614 0.957 644 0.897 4 284 3.587 559 0.830 5 243 3.776 277 3.551  Nồng độ M x 10-1 Bảng 25: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 10-1 ở bước sóng 190 – 1100nm Peak Valley Thứ tự WL Abs WL Abs 1 972 0.409 1074 0.220 19 2 292 3.646 907 0.258 3 242 3.753 273 3.591  Nồng độ M x 5-1 Bảng 26: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 5-1 ở bước sóng 190 – 1100nm Peak Valley Thứ tự WL Abs WL Abs 1 970 0.447 910 0.306 2 655 0.951 644 0.914 3 614 0.979 558 0.840 4 292 3.637 276 3.587 5 241 3.793 Ở cả 3 mức nồng độ, độ hấp thụ đạt cao nhất ở bước sóng 241nm – 243nm. Tuy nhiên dung dịch tạo màu có màu xanh lục, là vùng nhìn thấy nằm trong dải phổ từ 400 nm- 800nm. Do vậy chúng tôi tiến hành khảo ở vùng bước sóng từ 400 nm – 800 nm. Kết quả thu được như sau:  Nồng độ ban đầu M Bảng 27: Kết quả scan mẫu M ở bước sóng 400 – 800nm Peak Valley Thứ tự WL Abs WL Abs 1 613.5 0.928 569.0 0.825  Nồng độ M x 5 -1 20