Tài liệu đánh giá nguồn gen cây đậu tương cúc bóng tại huyện võ nhai tỉnh thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------------- NGUYỄN THANH HOÀN ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------------- NGUYỄN THANH HOÀN ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành : 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Dương Văn Cường 2. TS. Trần Minh Quân Thái Nguyên - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công bố trước đây. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2019 Tác giả Nguyễn Thanh Hoàn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, Viện khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên. Để hoàn thành được luận văn này tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể. Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Dương Văn Cường và TS. Trần Minh Quân, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị Ma Thị Trang, Vũ Hoài Nam, Hoàng Huyền Trang cán bộ tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, và chị Vũ Thị Ánh cán bộ phòng phân tích hóa học Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Trần Văn Phùng - Viện trưởng Viện Khoa học Sự sống cùng các cán bộ nghiên cứu của viện đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập và hoàn thành đề tài này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang bị kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám đốc, lãnh đạo khoa Xét nghiệm-CĐHATDCN và các anh chị đồng nghiệp thuộc Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn! Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii MỤC LỤC .................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2 3. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ............................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Tổng quan về cây đậu tương ............................................................................ 3 1.1.1. Phân loại học ............................................................................................. 3 1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái phân bố một số loài thuộc chi Glycine ......... 4 1.1.3. Giá trị của cây đậu tương .......................................................................... 5 1.2. Tổng quan về phân loại phân tử....................................................................... 6 1.2.1. Giới thiệu về phân loại phân tử ................................................................. 6 1.2.2. Các gen chỉ thị sử dụng trong phân loại phân tử ....................................... 8 1.2.3. Một số gen chỉ thị trong phân loại thực vật .............................................. 8 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 10 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................... 10 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................ 13 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 16 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 16 2.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 16 2.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 17 2.3.1. Mồi phản ứng PCR .................................................................................. 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv 2.3.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu .............................................................. 17 2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 18 2.4.1. Phương pháp phân loại hình thái thực vật và phân tích sinh hóa hạt ...... 18 2.4.2. Phương pháp xác định mối quan hệ di truyền ......................................... 21 2.4.3. Đăng kí trình tự gen chỉ thị đậu tương nghiên cứu trên ngân hàng gen quốc tế ............................................................................................................... 24 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 25 3.1. Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái của đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên ......................................................................................... 25 3.2. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền của đậu tương Cúc bóng ................ 30 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA .......................................................................... 30 3.2.2. Kết quả khuếch đại các gen chỉ thị rbcL và ITS2 ................................... 32 3.2.3. Kết quả phân tích các gen chỉ thị ............................................................ 33 3.3. Đăng ký trình tự gen chỉ thị lên ngân hàng gen quốc tế ................................ 41 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 42 1. Kết luận ............................................................................................................. 42 2. Đề nghị .............................................................................................................. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BP: Base pair – Cặp bazơ nitơ DNA: Deoxirybonucleic Acid dNTP: Deoxyribonucleotide Triphosphas Kb: Kilo Base – Kilo bazơ nitơ QV: Quality value PCR: Polymerase Chane Reaction rbcL: Ribulose-bisphosphate carboxylase ITS2: The internal transcribed spacer 2 matK: Maturase K TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các mẫu đậu tương nghiên cứu ................................................................ 16 Bảng 2.2. Trình tự mồi phản ứng PCR ..................................................................... 17 Bảng 2.3. Danh mục thiết bị được sử dụng ............................................................... 17 Bảng 2.4. Danh mục hóa chất sử dụng...................................................................... 18 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ....................................................................... 23 Bảng 3.1. So sánh hình thái đậu tương Cúc bóng ..................................................... 28 Bảng 3.2. Hàm lượng một số chất dinh dưỡng của đậu tương Cúc bóng ................. 29 Bảng 3.3. Thành phần axit amin trong protein của đậu tương Cúc bóng ................. 29 Bảng 3.4. Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA ................................................ 31 Bảng 3.5: Hệ số tương đồng trình tự gen rbcL của mẫu đậu tương Cúc bóng với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA ............................................... 35 Bảng 3.6: Hệ số tương đồng trình tự gen ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA ............................................... 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Sơ đồ chu trình nhiệt PCR ........................................................................ 23 Hình 3.1: Hình thái cây đậu tương Cúc bóng .................................................................... 26 Hình 3.2: Rễ và nốt sần đậu tương Cúc bóng .................................................................... 26 Hình 3.5: Quả đậu tương Cúc bóng .......................................................................... 27 Hình 3.6: Hạt đậu tương Cúc bóng ........................................................................... 27 Hình 3.7: So sánh kích thước hạt đậu tương Cúc bóng và DT 84 ............................ 28 Hình 3.8. Kết quả tách chiết DNA tổng số đậu tương .............................................. 31 Hình 3.9. Kết quả khuếch đại chỉ thị rbcL ................................................................ 32 Hình 3.10. Kết quả khuếch đại chỉ thị ITS2. ............................................................ 32 Hình 3.11: Kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự gen rbcL ................... 34 Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị rbcL ..................................... 35 Hình 3.13: Kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự gen ITS2 ................... 36 Hình 3.14. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2 ..................................... 38 Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng và các loài chi Glycine................................................... 39 Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại các loài thuộc chi Glycine xây dựng dựa trên trình tự ITS2................................................................................ 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây đậu tương là một loại cây thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), có hàm lượng dinh dưỡng cao, là cây thực phẩm quan trọng cho người và gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt [1]. Cây đậu tương dễ trồng và thích nghi tương đối rộng ở nhiều vùng khí hậu khác nhau. Tại Việt Nam, hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương, vùng Đông Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, Đồng bằng sông Hồng, Đồng bằng sông Cửu Long. Tổng diện tích 4 vùng này chiếm 66,6% trong tổng diện tích cả nước, còn lại là các vùng Đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên [2]. Các giống đậu tương rất đa dạng phong phú cả về kiểu hình và kiểu gen, đây là nguồn nguyên liệu để chọn tạo giống đậu tương mới cho năng suất và chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn giống. Tuy nhiên, do tập quán canh tác phân tán, chưa có khoanh vùng định hướng phát triển, cùng với sự phát triển của các giống đậu tương mới đang làm mất dần nhiều giống đậu tương bản địa có chất lượng. Mặt khác, một giống có thể có nhiều tên gọi khác nhau hoặc cùng một tên gọi nhưng là các giống đậu tương khác nhau, điều này đã tạo ra nhưng khó khăn trong công tác phân loại và bảo tồn các nguồn gen bản địa. Một số nghiên cứu của Trung tâm Tài nguyên thực vật cho thấy phần lớn các giống đậu tương địa phương đều tập trung ở vùng trung du miền núi phía Bắc. Một số giống đậu tương ở vùng này có nhiều đặc tính nông, sinh học tốt, tuy nhiên đang mất dần giống. Biện pháp tốt nhất để lưu giữ phát triển nguồn gen quý này là phải làm tốt công tác bảo tồn và phục tráng để phát triển ra sản xuất. Đậu tương Cúc bóng là một giống đặc hữu của tỉnh Thái Nguyên. Đã từ lâu Cúc bóng được gieo trồng tại các xã Bình Long, Phương Giao…thuộc huyện Võ Nhai. Giống cho chất lượng thơm ngon, tạo nên thương hiệu đậu phụ An Long nổi tiếng trong vùng. Nhiều năm gần đây diện tích trồng giống đậu tương này đang bị thu hẹp, thay thế bởi các giống mới cho năng suất cao hơn. Đậu tương Cúc bóng Võ Nhai đang phải đối mặt với nguy cơ thoái hóa và mất dần giống. Chính vì vậy, việc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2 phân loại định danh cây đậu tương Cúc bóng là hết sức cần thiết cho công tác nghiên cứu bảo tồn và lưu giữ nguồn gen bản địa. Hiện nay, phương pháp phân loại phân tử DNA barcode (mã vạch DNA), là công cụ hữu hiệu trong việc phân loại định danh loài. Bằng cách so sánh các trình tự nucleotide của chỉ thị mã vạch DNA từ mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu trên thế giới, sự khác nhau giữa các trình tự nucleotide trên đoạn DNA này là cơ sở để phân biệt các loài với nhau. Phương pháp cho kết quả nhanh, chính xác, bổ sung cho phương pháp phân loại học truyền thống [12]. Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài “Đánh giá nguồn gen cây đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được hình thái giống đậu tương Cúc bóng - Xác định được mối quan hệ di truyền giống đậu tương Cúc bóng với các giống đậu tương khác trên thế giới và Việt Nam. - Đăng kí được trình tự gen chỉ thị giống đậu tương Cúc bóng lên ngân hàng gen quốc tế. 3. Đối tượng nghiên cứu Mẫu đậu tương Cúc bóng thu thập tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn Đánh giá được mối quan hệ di truyền của cây đậu tượng trên hai gen chỉ thị rbcL, ITS2. Kết quả của đề tài góp phần bổ sung vào nguồn dữ liệu gen cây đậu tương, là cơ sở khoa học để lựa chọn vùng gen chỉ thị hữu ích trong định danh loài bằng phương pháp DNA mã vạch (DNA barcode). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây đậu tương 1.1.1. Phân loại học Cây đậu tương có đặc điểm phân loại học như sau: - Giới: Plantae (Thực vật) - Bộ: Fabales (Đậu) - Họ: Fabaceae (Đậu) - Phân họ: Faboideae - Tông: Phaseoleae - Phân tông: Glycininae - Chi: Glycine - Phân chi: Glycine, Soya Chi Glycine từng được Carl Linnaeus đưa ra năm 1737 trong ấn bản đầu tiên của quyển Genera Plantarum. Từ Glycine có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp glykys (ngọt) và có thể đề cập đến chất ngọt của củ ăn được sản xuất ở Bắc Mỹ có dạng cây đậu thân leo, Glycine apios, nay là Apios americana. Đậu tương được trồng được xuất hiện đầu tiên trong quyển Species Plantarum của Linnaeus, với tên gọi Phaseolus max L. Việc kết hợp Glycine max (L.) Merr., theo đề nghị của Merrill năm 1917, đã trở thành tên gọi chính thức được công nhận của loài này. Chi Glycine được chia thành 2 phân chi Glycine và Soja. Phân chi Glycine bao gồm 23 loài hoang dã lâu năm. Phân chi Soja bao gồm cây đậu tương được trồng trọt là loài Glycine max và cây đậu dại thuộc loài Glycine soja sieb và zucc. Cả hai loài đều là các loài cây hàng năm. Glycine soja là tổ tiên hoang dại của Glycine max, và chúng mọc hoang ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, và Nga. Phân chi Glycine bao gồm nhiều loài cây dại lâu năm, ví dụ như Glycine canescensvà Glycine tomentella, Glycine clandestina, Glycine falcata...[2], [15]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 4 1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố một số loài thuộc chi Glycine * Glycine falcata Glycine falcata được Mies và Hmowitz phân loại năm 1973. Loài này có nguồn gốc từ Úc, thân có thể bò sát mặt đất hoặc thẳng với lông cứng. Bản lá hơi rộng hình thuôn. Chùm hoa dài, mập với màu sắc trắng tới màu hoa cà nhạt. Quả cong hình lưỡi liềm, rộng bản, có nhiều lông cứng, với hạt hình thuôn hoặc ô van. Glycine falcata khác với các loài khác ở tập tính sinh trưởng, sự phân bố của dải protein ở hạt và không có lớp màng ở vỏ hạt [2]. * Glycine latifolia Glycine latifolia có nguồn gốc từ Úc, thân khỏe bò sát hoặc đôi khi leo. Phiến lá rộng có răng cưa, chùm hoa dài, mảnh, màu tím, quả ngắn, nhiều lông tơ hoặc cứng, được Newell và Hymowitz phân loại năm 1980 [2]. * Glycine tatrobeana Glycine tatrobeana được bentham phân loại năm 1864. Loài này phân bố ở Úc, cây nhỏ thân cứng, bò sát đất hoặc đôi khi leo, phiến lá hình bán cầu. Hoa to hơn Glycine clandestina nhưng quả tương tự [2]. * Glycine canescens Glycine canescens chỉ phân bố ở Úc, loài thân leo, phiến lá nhỏ dài, gân lá có gai, thân có lông hơi cứng, màu trắng xám. Hoa màu hồng, có mùi thơm, quả thẳng. Hạt hình chữ nhật đôi khi bẹt [2]. * Glycine tabacina Glycine tabacina tìm thấy ở Úc, Trung Quốc, đảo Nam Thái Bình Dương của New Caladonia, Vanuati, Fifi, Toga và Newe, vùng trung Tây Thái Bình dương, Ruykyu, đảo Mariana... Thân của loài này có thể bò hoặc leo, phiến lá có răng cưa. Những lá ở đốt phía trên có hình ô van bản hẹp, những lá ở đốt phía dưới thường rộng bản hơn. Chùm hoa thường dài hơn chùm hoa của Glycine clandestina, màu tím đậm, có mùi thơm. Quả cứng, dài, với hạt màu nâu hoặc đen [2]. * Glycine tomentella Glycine tomentella phân bố ở Úc, Trung Quốc, Tân Ghine, Philippines và Đài Loan. Thân cỏ bò hoặc leo có nhiều lông tơ. Lá thường có hình ô van, có gai nhỏ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 5 Cuống hoa ngắn, hoa thường tập trung nhiều ở phía ngọn hơn các loài khác. Hoa màu tím đậm đến tím nhạt. Quả thẳng, cứng và có vết lõm giữa các hạt. Hạt có màu nâu hoặc đen [2]. * Glycine soja Sieb và Zucc Glycine soja phân bố ở Trung Quốc, Liên Bang Nga, Triều Tiên, Nhật Bản và Đài Loan. Nó có thể mọc ở ruộng, bờ rào, dọc đường, bờ sông. Là cây hàng năm, thân bò hoặc leo, lá chét có lông cứng, màu nâu, với hình ô van dài. Hoa có màu tím hoặc đôi khi có màu trắng. Cuống hoa mảnh và ngắn. Quả ngắn, có nhiều lông cứng, hạt hình ô van dài. Những kết quả nghiên cứu về tế bào học, hình thái học, chứng tỏ rằng Glycine soja là tổ tiên hoang dại của đậu tương trồng [2]. * Glycine max Glycine max là loài đậu tương trồng hàng năm, không phát hiện thấy ở loài hoang dại. Dựa trên những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở châu Á và được thuần hoá ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triềuđại Shang (năm 1700-1100 B.C) trước công nguyên [1], [2]. Thân cây thẳng, ít phân cành, dạng bụi, xẻ lá chét lông chim. Phiến lá hình ô van hoặc ô van - elip. Chùm hoa có cuống ngắn, hoa màu tím hoặc trắng. Quả thẳng hoặc cong thường có nhiều lông. Mỗi quả thường có 1 tới 3 hạt, hình tròn hoặc cầu. Vỏ hạt có màu biến đổi từ vàng sáng đến nâu, đen, xanh. Trọng lượng 100 hạt từ 10-20 g [1]. 1.1.3. Giá trị của cây đậu tương Từ lâu, nhiều loài thuộc chi Glycine đã được con người biết đến sử dụng trong cuộc sống hàng ngày, như làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hay trong các bài thuốc dân gian. Tuy nhiên, hiện nay loài Glycine max là loài đậu tương được trồng phổ biến và cho giá trị kinh tế cao nhất. Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương Glycine max chứa 18% dầu, 38% protein, 12-25% lipit, 10-15% gluxit; có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose. Chứa các axit amin cơ bản: isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 6 Ngoài ra, còn chứa các axit amin không thay thế cần thiết cho cơ thể và là một trong những loài thực vật cung cấp protein hoàn chỉnh có chất lượng tương đương với protein động vật [2], [19]. Hạt của loài này được sử dụng trong nhiều món ăn châu Á bao gồm súp, salad và được chế biến thành các sản phẩm thực phẩm đa dạng, bao gồm sữa đậu nành, bánh đậu nành lên men (đậu phụ và tempeh), nước tương, tương miso [19]. Bột làm từ đậu tương được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm chế biến, như một chất ổn định và tăng hàm lượng protein. Dầu chiết xuất từ hạt (dầu đậu nành) được sử dụng rộng rãi trong nấu ăn (margarine, shortening, salad) cũng như trong ngành dược, mỹ phẩm và các sản phẩm phục vụ cho ngành công nghiệp (sơn, mực in, xà phòng, chất khử trùng và linoleum). Dầu đậu tương còn được sử dụng trong sản xuất nhiên liệu sạch như xăng sinh học. Ngoài ra, bột đậu tương sau khi chiết xuất dầu được sử dụng để làm xơ, chất kết dính, hoặc làm thức ăn chăn nuôi. Đậu tương còn là một loại cây trồng phủ đất, phân xanh [2]. 1.2. Tổng quan về phân loại phân tử 1.2.1. Giới thiệu về phân loại phân tử Phân loại học là ngành khoa học về mô tả và sắp xếp quan hệ phát sinh loài và các quan hệ giữa các loài, chi và họ tuân theo những quy định của các hệ thống phân loại nhân tạo và tự nhiên và những Luật quốc tế về danh pháp. Ðể phân loại sinh vật, phương pháp cổ điển được sử dụng phổ biến nhất là phân loại hình thái, dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan sinh sản và sinh dưỡng, phương pháp này đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện. Ngoài ra còn có các phương pháp khác như: Giải phẫu so sánh, cổ thực vật học, sinh hoá học, phương pháp miễn dịch... Hoặc có sự kết hợp giữa các phương pháp để đưa ra kết quả chính xác, các mẫu sẽ được nhận diện bằng các đặc tính hình thái bên ngoài và các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp rất khó để nhận biết như mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái bên ngoài, hoặc chúng bị dập nát, hư hỏng các bộ phận, hoặc mẫu vật bị chết, thậm chí là không thể hoặc khó nhận Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 7 biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài. Trong những trường hợp này phân loại phân tử bằng mã vạch DNA sẽ là phương pháp giúp giải quyết vấn đề trên, vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu mô nhỏ. Ngoài ra nó còn được ứng dụng để kiểm tra thành phần thảo dược trong thực phẩm chức năng hay độ tinh khiết của các sản phẩm sinh học. Hơn nữa, mã vạch DNA còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật, nó còn giúp quá trình phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhiên. Khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003 [14], nhằm giúp nhận diện các mẫu vật. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn (400 - 800 bp) nằm trong bộ gen của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau. Bài báo nghiên cứu của Hebert được coi là ví dụ đầu tiên về phân loại phân tử động vật, dùng đoạn DNA ty thể cytochrome oxidase tiểu đơn vị 1 (CO1). Nghiên cứu thành công này sớm được ứng dụng để xác định loài của các nhóm động vật khác như chim, cá, động vật có vú, động vật lưỡng cư và loài bò sát, mã vạch DNA không chỉ giúp xác định các động vật, thực vật hay các sinh vật sống khác mà nó còn được sử dụng trong kiểm nghiệm thành phần các loại thuốc thảo dược được thương mại hóa trên thị trường, mở ra 1 hướng ứng dụng mới của sinh học phân tử [9]. Một mã vạch DNA cần phải đáp ứng được các yêu cầu sau : 1. Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật. 2. Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao. 3. Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [9]. Xác định loài bằng trình tự đoạn mã vạch DNA gồm năm bước chính. Đầu tiên, mẫu được thu gom và xác định bởi các nhà phân loại. Sau đó, mẫu được tách chiết thu DNA tổng số, trình tự DNA đích sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR và giải trình tự để tạo ra mã vạch. Sau đó các mã vạch được nhập vào hệ thống ngân hàng dữ liệu Barcode (BOLD). Đây là một hệ thống trực tuyến lưu giữ thông tin mã vạch DNA chứa các thông tin như tên phân loại, hình ảnh của loài, GPS tọa độ nơi mà loài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 8 đó đã được tìm thấy, trình tự mã vạch, và các ứng dụng khác như giám sát môi trường, an toàn thực phẩm và y học. Thông tin chuỗi DNA của tất cả các loài đã được nghiên cứu trong nghiên cứu này có thể được truy cập miễn phí cho tất cả mọi người. Tính đến năm 2017, BOLD bao gồm hơn 5,9 triệu chuỗi mã vạch DNA từ hơn 542.000 loài [9]. 1.2.2. Các gen chỉ thị sử dụng trong phân loại phân tử Từ các kết quả nghiên cứu DNA barcode trên thế giới cho thấy, có nhiều đoạn gen được sử dụng làm DNA mã vạch, có thể là những đoạn gen nằm ở trong nhân (nuclear DNA - nDNA), như vùng ITS; Cytb nằm ở ty thể (Mitochondrial DNA mtDNA), vùng kiểm soát (control region); hay matK, rcbL, atpβ, ndnF, 16S nằm ở lục lạp (Chloroplast DNA - cpDNA) [9], [16]. Các gen thuộc cpDNA được chia thành 3 nhóm: Nhóm 1 là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5...), trnA (trnH, trnK...), RNA polymerase (rpoA, rpoB...), các gen tiểu phần ribosome (rps2, rps3...); Nhóm 2 là các gen mã hóa cho những yếu tố thuộc quang hợp như psaA, psaB, psbA, psbB (phytosystem), petA, petB (cytochrome b6f), atpA, atpB (ATP synthase), rbcL, ndhA, ndhB...; Nhóm 3 gồm các khung đọc mở ORF (ycfs) và các gen mã hóa protein như matK, cemA. Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật như: 16S, rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK. Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau. Ví dụ, các đoạn gen như: 18S, 16S, 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các đoạn gen, như: 26S, rbcL, ndnF, atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn gen, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới loài. Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng đã khuyến cáo, chưa có đoạn gen nào được sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật. Vì vậy, việc lựa chọn những đoạn gen đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch DNA là rất cần thiết và đem lại hiệu quả cao [20], [24], [26]. 1.2.3. Một số gen chỉ thị trong phân loại thực vật Ở động vật, các gen ti thể như CO1 và Cytb được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, nhưng khi áp dụng cho các loài thực vật lại biểu hiện tính bảo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 9 thủ cao nên không phù hợp làm DNA mã vạch. Hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Chúng bao gồm thực vật có hạt (hạt trần và hạt kín) cùng với rêu, dương xỉ và các loài có quan hệ gần với dương xỉ,ước tính gần đây đã cho thấy rằng hiện có khoảng 380.000 loài thực vật trên cạn, gồm khoảng 352.000 loài thực vật hạt kín, 1.300 loài thực vật hạt trần, 13.000 loài rêu và dương xỉ. Bởi mức độ tiến hóa của gen mã hóa CO1 ở thực vật chậm hơn động vật rất nhiều, tốc độ tiến hóa của các gen trên ty thể không nhanh như ở động vật, do vậy không đủ sai khác để phân biệt được các loài. Vì vậy, các vùng trong hệ gen lục lạp đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng intron của các gen trnL và trnL-F). Một vùng trình tự thông thường khác cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn DNA ribosome). Tính đến năm 2009, đã có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp [7], [18]. Vùng gen mã hóa ribosome: rDNA là hệ thống đa gen mã hóa RNA của ribosome. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể, từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau. Như vậy, rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi [4]. nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những trình tự hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng. ITS2 một trong những marker phát sinh loài phổ biến nhất cho sinh vật nhân chuẩn, để xác định các loài thực vật và như một locus bổ sung cho CO1 để xác định các loài động vật. Đối với thực vật, độ dài của chuỗi ITS2 từ thực vật hai lá mầm và rêu được phân bố từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 10 100 đến 700 bp, và độ dài của chuỗi ITS2 từ thực vật một lá mầm, thực vật hạt trần và dương xỉ được phân bố từ 100 đến 480 bp. Độ dài trung bình của chuỗi ITS2 đối với cây hai lá mầm, một lá mầm, cây hạt trần, dương xỉ và rêu tương ứng là 221, 236, 240, 224 và 260 bp. Đối với động vật, độ dài chuỗi ITS2 dao động từ 100 đến 1,209 bp (chủ yếu nằm trong khoảng 195 và 510 bp) [24], [26]. Trình tự gen rbcL: Mã hóa các tiểu đơn vị lớn của rubilose -1,5- bisphosphate cacboxylase/ oxygenase. Gen lục lạp rbcL được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật. Việc phân tích hơn 10.000 chuỗi rbcL từ GenBank chứng minh rằng gen rbcL có hiệu quả phân biệt giữa các loài thực vật tới 85%. Do rbcL dễ dàng khuếch đại PCR ở một số loài thực vật, nên được công nhận là một trong những trình tự gen có tiềm năng cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp hơn, nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, như ITS2, matK là mã vạch được đề xuất để xác định cho cây trồng [20], [23]. Trình tự gen matK: Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự với một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [4], [24]. Sau nhiều lần nghiên cứu mở rộng sàng lọc các vùng gen trong hệ gen thực vật các vùng gen ITS, Maturase K (matK), trnH-psbA, tiểu đơn vị lớn của ribulosebisphosphate carboxylase - rbcL đã trở thành mã vạch tiêu chuẩn được lựa chọn nhiều nhất ứng dụng trong phân loại thực vật [16], [24]. 1.3. Tình hình nghiên cứu DNA barcode trong và ngoài nước 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới, có rất nhiều đề tài sử dụng phương pháp DNA barcode để phân loại và giám định loài. Phương pháp cho kết quả nhanh chính xác tên loài, xác định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 11 mối quan hệ di truyền giữa các loài, góp phần trong công tác bảo tồn, lưu giữ những nguồn gen. Năm 2009, Daniel H. Janzen và nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Pennsylvania, Philadelphia công bố kết quả nghiên cứu “Mã vạch DNA cho thực vật”, với mục đích xác định mã vạch DNA tiêu chuẩn cho từng loài thực vật trên cạn. Nhóm tác giả nghiên cứu trên 907 đối tượngthuộc 445 loài thực vật hạt kín, 38 loài thực vật hạt trần và 67 loài chưa được phân loại. Bảy vùng gen được lựa chọn : gen atpF-atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1, psbK-psbI và trnH-psbA. Kết quả thu được, trong số 397 mẫu được giải trình tự thành công trên 7 chỉ thị, sự phân biệt loài đối với từng chỉ thị riêng lẻ dao động từ 43% (rpoC1 ) đến 68% - 69 % ( psbK, psbI và trnH, psbA ), với rbcL và matKlà61%. Nhóm nghiên cứu đã đưa ra khuyến nghị nên kết hợp hai gen chỉ thị rbcL và matK sẽ cho kết quả phân biệt loài cao [13]. Năm 2012, Kuzmina M.L. và cộng sự sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân loại 900 mẫu vật đại diện cho 312 trong số 354 loài thực vật có mạch ở Bắc Cực gần thị trấn Churchill, Manitoba. Nhiều loài thực vật ở đây có khả năng mất đa dạng di truyền do khả năng phân tán hạn chế do đó giảm phạm vi phân bố, và đặc biệt chịu tác động lớn bởi biến đổi khí hậu. Phương pháp này được nhóm tác giả đánh giá là rất hữu ích, xác định nhanh, chính xác. Kết quả nghiên cứu thu được: vùng gen rbcL cho chất lượng kết quả giải trình tự đạt cao nhất là 95% với mẫu vật tươi và 85% đối với mẫu khô (Herbarium). Vùng gen ITS2 cho hiệu quả như nhau đối với mẫu tươi và khô (89% và 88%). Thành công giải trình tự thấp nhất là vùng gen matK (76% mẫu tươi, 45% mẫu khô). Việc phân loại loài dựa trên kết hợp thông tin hai vùng gen rbcL và matK phân biệt được 54% của 286 loài, trong khi rbcL và ITS2 phân biệt 63% của 285 loài. Mức phân loại loài cao nhất (69%) khi kết hợp thông tin trình tự từ cả ba vùng gen. Chỉ thị ITS2 cho kết quả cao trong phân loại các loài có mối quan hệ gần gũi nhau như cây họ cải (Brassicaceae), họ hoa hồng (Rosaceae), họ hòa thảo (Poaceae), họ cói (Cyperaceae), tuy nhiên ở một số trường hợp lại cho hiệu quả phân loại thấp như ở họ Phong lan (Orchidaceae) [22]. Năm 2012, Madesis và cộng sự đã sử dụng phương pháp DNA barcode để phân loại các loài cây họ đậu thuộc vùng Địa Trung Hải, đây là vùng được đánh giá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn