Tài liệu đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin ở một số giống ngô chịu hạn khác nhau

.. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------- NGUYỄN PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ CHỊU HẠN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác [4]. Cây ngô không chỉ cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn. Tuy nhiên trong những năm qua, do hạn chế về điều kiện tƣới tiêu, tập quán canh tác và đặc biệt là việc chọn giống chịu hạn đƣa vào sản xuất chƣa đƣợc chú trọng, thêm vào đó là diễn biến thời tiết phức tạp, hạn hán thƣờng xuyên xảy ra nên năng suất ngô của nƣớc ta vẫn còn thấp. Nƣớc ta có 75% diện tích là đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm không đồng đều giữa các vùng, do vậy tình trạng hạn hán thƣờng xuyên diễn ra dẫn đến năng suất cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng bị giảm. Năm 2004, tỉnh Đắc Lắc có trên 28000 ha ngô bị hạn, trong đó mất trắng 60% và giảm năng suất 40%. Để hạn chế ảnh hƣởng của hạn tới năng suất ngô, trong những năm gần đây nƣớc ta đã tuyển chọn và mở rộng trồng những giống ngô lai có khả năng chịu hạn tốt, cho năng suất cao. Ngoài ra, cũng có nhiều công trình nghiên cứu đến khả năng chịu hạn của cây ngô. Đó là kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô trên đồng ruộng [17], đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô non trong điều kiện hạn nhân tạo [11], [18]), nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tạo mô sẹo của ngô [14]. Có một số công trình nghiên cứu về ngô đã tiếp cận phân tích các đại phân tử DNA nhƣ: phân lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA genome [6]), phân lập gen dehydrin từ cDNA [25]). Những nghiên cứu ở mức độ phân tử nhằm mục đích tìm kiếm và phân tích gen liên quan đến đặc tính chịu hạn của cây ngô. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính chịu hạn của cây ngô nói riêng và cây trồng nói chung do nhiều gen quyết định, trong đó có gen cystatin. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống ngô theo hƣớng nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin ở một số giống ngô chịu hạn khác nhau”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn của một số giống ngô ở giai đoạn cây non. -Xác định đƣợc mối liên quan giữa hoạt tính của enzyme α – amylase, protease, chiều dài rễ với khả năng chịu hạn của một số giống ngô. - Phân lập và xác định đƣợc trình tự gen cystatin ở một số giống ngô có khả năng chịu hạn khác nhau. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả năng chịu hạn bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo ở giai đoạn 3, 5, 7, 9 ngày gây hạn. - Xác định hoạt tính của α – amylase, protease trong hạt của 10 giống ngô nghiên cứu. - Xác định chiều dài rễ 5 ngày tuổi ở giai đoạn cây non. - Tách chiết DNA tổng số của 10 giống ngô nghiên cứu. - Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen cystatin ở một số giống ngô. - Tách dòng gen cystatin ở 2 giống ngô: một giống chịu hạn tốt và một giống chịu hạn kém. - Xác định trình tự gen cystatin ở giống ngô có khả năng chịu hạn kém. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY NGÔ 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., là một loại cây lƣơng thực thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo (Gramineae), bộ hòa thảo (Graminales). Căn cứ vào kết quả nghiên cứu khảo cổ học, tế bào học, di truyền học…cho thấy cây ngô có nguồn gốc từ Châu Mỹ, ngô lan truyền sang Châu Âu và phần còn lại của thế giới sau khi có sự tiếp xúc của ngƣời Châu Âu với Châu Mỹ. Ở Việt Nam ngô đƣợc trồng vào thế kỷ thứ XVII. Dựa vào hạt có mày hay không có mày, hình thái bên ngoài và cấu trúc nội nhũ của hạt, ngô đƣợc phân thành các loài phụ: ngô bọc, ngô đá, ngô răng ngựa, ngô đƣờng, ngô nổ, ngô bột, ngô nếp, ngô đƣờng bột, ngô bán răng ngựa. Từ các loài phụ căn cứ vào màu sắc hạt và màu sắc lõi ngô để phân thành các thứ. Đây là cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngoài ra ngô còn đƣợc phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trƣởng và thƣơng phẩm [8]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học Ngô là cây lƣơng thực chỉ thấy ở dạng cây trồng bao gồm các bộ phận: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt. Ngô có hệ rễ tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo. Tuy nhiên ngô có bộ rễ phát triển rất mạnh, nên có khả năng hút nƣớc rất khỏe, hơn nhiều loài cây trồng khác. Hệ rễ của cây ngô hoàn chỉnh chia thành 3 nhóm: rễ mầm, rễ đốt, rễ chân kiềng. Rễ mầm mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nƣớc, thức ăn khi cây còn non. Rễ đốt mọc vòng quanh các đốt thấp của thân. Đây là loại rễ quyết định quá trình sinh trƣởng phát triển của cây ngô, nó giúp cây hút nƣớc và các chất dinh dƣỡng suốt đời sống của cây. Rễ chân kiềng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn mọc quanh các đốt thấp sát mặt đất. Rễ này giúp cây chống đỡ và bám chặt vào đất, chúng cũng tham gia hút nƣớc và thức ăn. Số lƣợng rễ, số lông rễ và độ dài rễ khác nhau ở mỗi giống. Đây là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng chịu hạn của cây. Thân ngô đặc, đƣờng kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m. Thân ngô trƣởng thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Thân ngô ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận chuyển chất hữu cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ. Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Các bộ phận của lá bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa lá. Theo hình thái và vị trí trên thân, lá ngô đƣợc chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá bẹ, lá bi. Số lá, độ lớn của lá phụ thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số lá ngô thƣờng biến động từ 15 - 20 lá. Đặc điểm nổi bật là lá ngô có rất nhiều khí khổng. Trung bình một lá ngô có từ 2 - 6 triệu khí khổng, trên 1mm2 lá có từ 500 - 900 khí khổng. Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ tới điều kiện hạn hán. Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng… Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Cơ quan sinh sản đực (bông cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau. Hoa đực nằm ở đỉnh cây. Hoa cái phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách nhiều nhƣng chỉ có từ 1 - 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Số bắp trên cây phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ và phân bón. Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi, nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt bao xung quanh hạt là một màng nhẵn. Lớp alơrôn nằm dƣới vỏ hạt. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa 70 - 78% khối lƣợng hạt với giá trị dinh dƣỡng khá cao so với các loại hạt ngũ cốc khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn Phôi ngô có: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dƣới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm. Trong bốn phần này thì lá mầm thƣờng phát triển rõ rệt nhất. Phôi ngô lớn chiếm 8 - 15% trọng lƣợng hạt. Màu sắc hạt phụ thuộc đặc tính di truyền của giống và chủng loại, vì vậy hạt ngô có nhiều màu sắc khác nhau nhƣ: trắng, vàng, tím, da cam, đỏ…Mỗi bắp ngô có từ 200 1000 hạt phụ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh, sinh thái, trung bình mỗi bắp có từ 500 - 600 hạt. Quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây ngô đƣợc chia thành hai giai đoạn: giai đoạn sinh dƣỡng và giai đoạn sinh thực. Giai đoạn sinh dƣỡng đƣợc tính từ khi gieo đến trỗ cờ. Giai đoạn sinh thực đƣợc tính từ trỗ cờ đến chín hoàn toàn. Căn cứ vào đặc điểm quá trình sinh trƣởng phát triển có thể chia ra các giai đoạn sinh trƣởng phát triển quan trọng sau đây: giai đoạn hạt nảy mầm và mọc; giai đoạn từ mọc đến 3 lá; giai đoạn từ 3 lá đến 7 lá; giai đoạn từ 7 lá đến trổ cờ; giai đoạn từ trỗ cờ đến tung phấn, phun râu; giai đoạn từ thụ phấn đến chín [8]. Trong từng giai đoạn cây ngô yêu cầu các điều kiện khác nhau và mỗi giai đoạn đều có ảnh hƣởng khác nhau đến các yếu tố tạo thành năng suất và chất lƣợng hạt ngô [8]. 1.1.3. Giá trị kinh tế của cây ngô Ngô là một trong những cây lƣơng thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu. Bên cạnh vai trò cung cấp lƣơng thực cho con ngƣời, ngô còn là nguyên liệu quan trọng của công nghiệp chế biến thức ăn gia súc và công nghệ sinh học. Nhiều nƣớc đang sử dụng ngô để chế biến ethanol - năng lƣợng sạch của tƣơng lai. Ngô là cây lƣơng thực nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất cả các nƣớc trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Nếu nhƣ ở châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; châu Á là cơm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 http://www.lrc-tnu.edu.vn (gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Ngoài ra, bắp ngô bao tử còn đƣợc sử dụng làm rau cao cấp, lấy hạt làm nguyên liệu chế biến các mặt hàng có giá trị dinh dƣỡng cao nhƣ sữa ngô, ngô ngọt đóng hộp, đóng lọ… Ngô là thức ăn giàu năng lƣợng, là thành phần quan trọng trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc và gia cầm. Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng trong thức ăn tổng hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tƣởng cho đại gia súc, đặc biệt là bò sữa. Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp. Ngƣời ta đã sản xuất khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lƣơng thực - thực phẩm, công nghiệp dƣợc và công nghiệp nhẹ. Ngoài ra ngô còn là nguồn hàng hóa xuất khẩu có giá trị cao. Trên thế giới hàng năm lƣợng ngô xuất nhập khẩu khoảng 70 triệu tấn đem lại nguồn lợi nhuận kinh tế lớn [9]. Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là cây màu quan trọng nhất đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau. Cây ngô không chỉ cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn [4]. 1.1.4. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô Thành phần hydratcacbon ở ngô chủ yếu là tinh bột (60 - 70%), lipid chủ yếu là acid béo, protein ở dạng zein chiếm đa số, hàm lƣợng đƣờng khoảng 3,5%, lƣợng tro khoảng 1 - 2,4%, chất khoáng chiếm trên 60% khối lƣợng của phôi [8]. Tinh bột ngô hình tròn, hình đa diện, góc cạnh rõ rệt, kích thƣớc khoảng 8 - 35 µm. Tinh bột tập trung chủ yếu ở nội nhũ và đƣợc chia thành hai dạng là tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh bột sừng). Đặc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 http://www.lrc-tnu.edu.vn điểm tinh bột của nội nhũ hạt là một tiêu chuẩn để phân loại loài ngô phụ. Hàm lƣợng tinh bột ở ngô tẻ (68%) nhiều hơn ở ngô nếp (65%) [8]. Tỷ lệ chất béo trong hạt ngô tƣơng đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung trong mầm ngô. Trong chất béo của ngô có 50% là acid linoleic, 31% là acid oleic, 13% là acid panmitic và 3% là stearic. Hàm lƣợng lipid là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt [5]. Tỷ lệ protein trong hạt ngô 8 - 12%. Protein chính của ngô là zein, một loại prolamin gần nhƣ không có lysine và tryptophan. Protein của ngô đƣợc chia thành 3 loại chính: protein hoạt tính (enzyme), protein cấu tạo và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất. Hàm lƣợng protein cũng nhƣ các thành phần amino acid bị thay đổi bởi những tác động của các yếu tố di truyền (giống) và môi trƣờng, kỹ thuật canh tác. Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm. Ngô cũng có nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6..). Vitamin PP hơi thấp cộng với thiếu tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP. Riêng ngô vàng chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [9]. 1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 1.1.5.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới Với những giá trị kinh tế và sử dụng của mình, cây ngô đƣợc xem là cây lƣơng thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu chỉ đứng thứ ba sau lúa gạo và lúa mỳ. Ngô là cây có địa bàn phân bố rộng nhất thế giới, trải rộng từ 40o N đến gần 55o B, từ độ cao 1 - 2 m đến 400 m so với mực nƣớc biển [9]. Do đó ngô đƣợc trồng ở hầu hết các nơi trên thế giới nhƣ Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi và Châu Á. Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô giữa các châu lục có sự chênh lệch nhau tƣơng đối lớn đƣợc thể hiện ở bảng 1.1 [58]. Diện tích trồng ngô giữa các châu lục có sự chênh lệch nhau, trong đó Châu Mỹ là khu vực có diện tích trồng ngô lớn nhất, năm 2008 là Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 http://www.lrc-tnu.edu.vn 60,4 triệu ha đến năm 2010 là 63,1 triệu ha, chiếm gần 40% diện tích ngô trên toàn thế giới. Đứng thứ hai là Châu Á chiếm 33,2%. Châu Âu có diện tích trồng ngô thấp, chiếm khoảng 8,7% diện tích trồng ngô thế giới. Châu Mỹ là khu vực có năng suất cao nhất đạt 71,0 tạ/ha, đứng thứ hai là khu vực Châu Âu: 60,6 tạ/ha, thấp nhất là Châu Á: 45,8 tạ/ha (năm 2010). Sở dĩ Châu Á có năng suất thấp nhƣ vậy là do khu vực này có điều kiện bất thuận nhƣ; hạn hán, lũ lụt, đất canh tác chƣa thuận lợi. Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn 2008 - 2010 Khu vực Diện tích Năng suất Sản lượng (Triệu ha) (Tạ/ha) (Triệu tấn) 2008 2009 2010 2008 2009 2010 2008 2009 2010 Châu Âu 15,4 13,8 14,1 60,5 60,7 60,6 93,2 84,0 85,6 Châu Á 52,4 53,5 53,7 45,5 43,8 45,8 238,4 234,5 246,1 Châu Mỹ 60,4 61,4 63,1 68,6 71,9 71,0 439,5 441,5 447,9 Thế giới 161,2 158,8 161,9 51,3 51,6 52,1 827,5 819,7 844,4 (Nguồn FAOSTAT, 2011) Giai đoạn 2008 - 2009, Châu Mỹ có năng suất tăng mạnh, tăng 3,3 tạ/ha; Châu Âu tăng nhẹ: 0,2 tạ/ha; khu vực Châu Á có năng suất giảm (giảm 1,7 tạ/ha) do các điều kiện bất thuận. Về sản lƣợng, Châu Mỹ là khu vực dẫn đầu sản lƣợng ngô trên toàn thế giới, năm 2008 đạt 439,5 triệu tấn chiếm 53,1% tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế giới. Đứng thứ hai là khu vực Châu Á đạt 238,4 triệu tấn, chiếm 28,8% tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế giới. Năm 2010 Châu Mỹ đạt 447,9 triệu tấn, chiếm 53,0% tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế giới, khu vực Châu Á đạt 246,1 triệu tấn, chiếm 29,1% tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế giới. Nhƣ vậy, trong giai đoạn từ năm 2008 đến năm 2010 diện tích trồng ngô trên toàn thế giới tăng không đáng kể, nhƣng do áp dụng các thành tựu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 http://www.lrc-tnu.edu.vn khoa học kỹ thuật tiên tiến, đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên năng suất và sản lƣợng ngô của thế giới có sự nhảy vọt, nhất là ở các nƣớc có nền kinh tế phát triển có điều kiện thâm canh cao và sử dụng 100% giống ngô lai trong sản xuất. Bên cạnh đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các giống ngô chuyển gen có năng suất cao, có khả năng chống chịu sâu bệnh cũng góp phần đƣa sản lƣợng ngô thế giới tăng cao. Tình hình sản xuất ngô ở các nƣớc trên thế giới cũng có sự khác nhau [58]. Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2010 Diện tích Năng suất Sản lượng (Triệu ha) (Tạ/ ha) (Triệu tấn) Argentina 2,90 78,12 22,68 Mỹ 32,96 95,92 316,17 Brazin 12,81 43,75 56,06 Trung Quốc 32,52 54,60 177,54 Ấn Độ 7,18 19,60 14,10 Tên nước (Nguồn FAOSTAT, 2011) Trên thế giới, Mỹ là nƣớc có diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô lớn nhất đạt 32,96 triệu ha, với tổng sản lƣợng đạt 316,17 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 95,92 tạ/ha. Kết quả trên có đƣợc, trƣớc hết là nhờ sự đầu tƣ cho nghành nông nghiệp, không ngừng cải thiện các kỹ thuật canh tác, đồng thời ứng dụng công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống đã góp phần đƣa năng suất và sản lƣợng ngô của nƣớc này cao hơn các nƣớc khác. Các giống cây trồng chuyển gen đƣợc tạo ra nhờ công nghệ sinh học đã đƣợc trồng phổ biến, đem lại lợi nhuận nông nghiệp cao, trong đó nƣớc Mỹ tập trung vào các cây mũi nhọn là bông, đậu tƣơng và ngô. Có thể nói Mỹ và Trung Quốc là hai nƣớc có diện tích trồng ngô lớn nhất và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác. Mỹ và Trung Quốc, cùng với Ấn Độ là những nƣớc xuất khẩu ngô lớn, các nƣớc nhập khẩu ngô chính là Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malaysia, Mexico, châu Phi…[9]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.5.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam Trƣớc đây, sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ và phân tán, chủ yếu là tự cung tự cấp theo nhu cầu của hộ nông dân. Ngành sản xuất ngô nƣớc ta thực sự có những bƣớc tiến vọt do áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật, đặc biệt là việc sử dụng các giống ngô lai và mở rộng diện tích trồng ngô lai vào sản xuất, kết hợp các biện pháp kỹ thuật canh tác theo yêu cầu của giống mới. Bảng 1.3. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô của Việt Nam từ 2006 - 2010 Diện tích Năng suất Sản lượng (1000 ha) (tấn/ha) (1000 tấn) 2006 1033,10 3,73 3854,50 2007 1096,10 3,93 4303,20 2008 1440,20 3,18 4573,10 2009 1089,20 4,01 4371,70 2010 1126,39 4,09 4606,80 Năm (Nguồn FAOSTAT, 2011) Từ năm 2006, năng suất và sản lƣợng ngô của Việt Nam đã có những bƣớc nhảy vọt cao nhất từ trƣớc tới nay. Tốc độ tăng trƣởng diện tích, năng suất và sản lƣợng ngô của Việt Nam cao hơn nhiều lần, lợi nhuận trồng ngô lai cao hơn hẳn các loại cây trồng khác. Năm 2006, diện tích trồng ngô của cả nƣớc (trong đó diện tích trồng ngô lai chiếm ƣu thế) đạt 1.033.100 ha, tổng sản lƣợng trên 3.730.000 tấn. Năm 2008, diện tích trồng ngô tăng lên 1.440.200 ha, tổng sản lƣợng lên tới hơn 4.573.100 tấn. Đến năm 2009, do quá trình công nghiệp hóa diễn ra mạnh, diện tích đất dành cho các ngành công nghiệp và du lịch đƣợc mở rộng, diện tích đất nông nghiệp bị giảm nên diện tích trồng ngô ở nƣớc ta giảm còn 1.089.200 ha và sản lƣợng cũng giảm xuống còn 4.371.700 tấn (giảm 4,4% so với năm 2008). Nhờ việc đƣa các giống ngô lai chịu hạn, năng suất cao nhƣ C919, LVN10,…và các giống ngô Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn lai do Viện nghiên cứu ngô cung cấp vào sản xuất đã đƣa năng suất ngô trong nƣớc tăng lên dù diện tích và sản lƣợng đều giảm. Năm 2010 diện tích trồng ngô đạt 1.126.390 ha, tăng 3,3% so với năm 2009, sản lƣợng đạt trên 4.606.800 tấn, cao nhất từ trƣớc tới nay [58]. Tuy nhiên, sản lƣợng ngô của Việt Nam vẫn thấp hơn so với sản lƣợng ngô thế giới. Có nhiều nguyên nhân khiến sản lƣợng ngô của nƣớc ta chƣa cao nhƣ: do chƣa tập trung sản xuất ngô, do điều kiện khí hậu, tập quán canh tác,…Ngoài ra, tại một số vùng miền núi khó khăn về sản xuất lúa nƣớc nên nông dân phải trồng ngô làm lƣơng thực thay thế gạo, làm thức ăn chăn nuôi. Các giống ngô đƣợc trồng đều là các giống truyền thống của địa phƣơng, giống cũ nên năng suất rất thấp. Do đó, sản lƣợng ngô trong nƣớc không đủ phục vụ cho con ngƣời cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi. Hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một lƣợng lớn ngô, đậu tƣơng làm thức ăn cho gia súc. Chính vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu để có biện pháp cải tạo giống ngô theo hƣớng tăng năng suất và chất lƣợng là rất cần thiết. 1.2. ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ 1.2.1. Hạn và ảnh hưởng của hạn tới cây trồng 1.2.1.1. Khái niệm hạn Nƣớc là thành phần bắt buộc của tế bào sống, có nƣớc thực vật mới hoạt động bình thƣờng đƣợc. Nhƣng hàm lƣợng nƣớc trong thực vật không giống nhau, thay đổi tùy thuộc loài hay các tổ chức khác nhau của cùng một loài thực vật. Hàm lƣợng nƣớc còn phụ thuộc vào thời kỳ sinh trƣởng của cây và điều kiện ngoại cảnh mà cây sống. Cung cấp nƣớc cho cây là điều kiện không thể thiếu đƣợc để đảm bảo thu hoạch tốt. Việc thỏa mãn nhu cầu nƣớc cho cây là điều kiện quan trọng nhất đối với sự sống bình thƣờng của cây. Ngƣợc lại, hạn là hiện tƣợng xảy ra khi cây bị thiếu nƣớc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hạn là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nƣớc của thực vật do môi trƣờng gây nên làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Hạn cũng có thể đƣợc định nghĩa là sự thiếu lƣợng nƣớc do mƣa hoặc tƣới nƣớc trong một thời gian dài tạo ra sự cạn kiệt độ ẩm trong đất và gây nên tổn thƣơng cho thực vật [12]. Có ba loại hạn cơ bản: hạn đất, hạn không khí và hạn sinh lý. Hạn đất xảy ra khi lƣợng nƣớc dự trữ cho cây hấp thu trong đất bị cạn kiêt nên cây không hút đủ nƣớc và mất cân bằng nƣớc. Hạn không khí xảy ra khi độ ẩm không khí quá thấp làm cho quá trình thoát hơi nƣớc của cây quá mạnh, cây không hút đủ nƣớc và dẫn đến mất cân bằng nƣớc trong cây. Hạn sinh lý xảy ra do trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây hút đƣợc nƣớc mặc dù trong môi trƣờng không thiếu nƣớc. Hạn sinh lý kéo dài cũng tác hại nhƣ hạn không khí và hạn đất. Nếu hạn đất kết hợp với hạn không khí thì mức độ tác hại với cây tăng lên gấp nhiều lần. 1.2.1.2. Ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với hạn. Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học. Hạn tác động lên cây theo hai hƣớng chính là làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nƣớc trong cây [12]. Mức độ thiếu hụt nƣớc càng lớn thì càng ảnh hƣởng xấu đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây, nếu thiếu nƣớc nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cƣờng quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nƣớc, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thƣơng và chết. Đối với thực vật nói chung và cây ngô nói riêng, hạn ảnh hƣởng nhất tới hai quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây đó là giai đoạn cây non và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 http://www.lrc-tnu.edu.vn giai đoạn ra hoa. Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo trồng. Nó làm giảm 50% năng suất cây trồng và có khi còn hơn thế nữa. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây ngô Ngô là cây trồng không đòi hỏi nhiều nƣớc và có khả năng chịu hạn cao. Để tổng hợp đƣợc 1 kg chất khô ngô cần 260 - 349 kg nƣớc, trong khi lúa cần 400 - 500 kg, đậu tƣơng cần 500 - 530 kg. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nƣớc của ngô chỉ là 30%, còn của đậu tƣơng là 50% [12]. Nhu cầu về nƣớc và khả năng chịu hạn của cây ngô qua từng thời kỳ sinh trƣởng có khác nhau. Ở thời kỳ đầu cây ngô phát triển chậm, tích lũy ít chất xanh nên không cần nhiều nƣớc. Ở thời kỳ 7 - 13 lá ngô cần 28 - 35 m3 nƣớc/ngày/ha. Thời kỳ xoắn nõn, trổ cờ, phun râu cần 65 - 70 m3 nƣớc/ngày/ha. Ở giai đoạn cây non khi gặp hạn cây có thể dễ dàng vƣợt qua, nếu ở những giai đoạn sau nhƣ giai đoạn từ 10 lá, trỗ cờ, tung phấn, phun râu mà gặp hạn thì dẫn đến năng suất giảm đáng kể. Đặc tính chịu hạn của cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng mang tính đa gen. Trên thực tế vẫn chƣa tìm đƣợc gen thực sự quyết định tích chịu hạn của cây ngô mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn. Để đánh giá tính chịu hạn của cây ngô ngƣời ta dựa vào các đặc điểm nhƣ: hình thái bộ rễ, kích thƣớc lá, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, tỷ lệ cây hai bắp, tỷ lệ cây không bắp, sự chênh lệch thời gian tung phấn và phun râu, các gen quy định tính chịu hạn…[14]. 1.2.3. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và di truyền của tính chịu hạn của cây ngô 1.2.3.1. Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn của cây ngô Trong điều kiện thiếu nƣớc cực đoan cây ngô có hai cơ chế chủ yếu để chống chịu hạn, đó là sự thích nghi và phát triển của bộ rễ, đồng thời duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào để hút đƣợc nhiều các phân tử nƣớc từ môi trƣờng [12]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn Vai trò của bộ rễ: nhiều nghiên cứu cho thấy cây ngô sống trong môi trƣờng thiếu nƣớc có bộ rễ dài, khỏe, mập, có sức đâm sâu hơn để hút đƣợc nƣớc ở những tầng đất sâu. Rễ ngô có khả năng đâm sâu gần 2 m và lan rộng trên 2 m. Rễ ngô có khả năng phân nhánh rất mạnh với sự phát triển đặc biêt của lông hút (ƣớc tính trên 1mm2 bề mặt rễ ngô có trên 400 lông hút). Vì vậy cả bộ rễ ngô có tổng số bề dài và bề mặt tiếp xúc với đất rất rộng để hút đƣợc nhiều nƣớc hơn khi gặp hạn [14]. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: là một đặc tính của tế bào khi tế bào bị mất nƣớc do hạn, nóng, lạnh…Khi tế bào bị mất nƣớc dần dần, các chất hòa tan sẽ đƣợc tích lũy trong tế bào chất (nhƣ: đƣờng, acid hữu cơ, amino acid, các ion…), các chất này có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận đƣợc những phân tử nƣớc ít ỏi còn trong đất. Bằng cơ chế nhƣ vậy thực vật có thể chịu đƣợc sự mất nƣớc trong thời gian ngắn [16]. 1.2.3.2. Cơ sở hóa sinh của tính chịu hạn của cây ngô Chịu hạn ở thực vật thƣờng là kết quả của nhiều cơ chế đáp ứng stress hoạt động đồng thời. Một số cơ sở hóa sinh của tính chịu hạn bao gồm: hoạt độ enzyme  - amylase, protease, acid abscisic (ABA), proline… Enzyme  - amylase thuộc nhóm hydrolase có trong cơ thể động vật (nƣớc bọt, tụy tạng), thực vật (hạt hòa thảo nảy mầm), nấm mốc, vi khuẩn. Ở thực vật, sự tăng hoạt độ của  - amylase sẽ làm tăng hàm lƣợng đƣờng do tinh bột bị thủy phân, nên làm ảnh hƣởng tới sự điều hòa áp suất thẩm thấu khi cây gặp hạn. Vì thế, dựa vào sự biến động hàm lƣợng  - amylase cũng có thể sơ bộ đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu. Protease đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể thực vật, nhất là trong thời kỳ nảy mầm của hạt. Nó tham gia vào quá trình phân giải protein dự trữ trong hạt nhằm cung cấp amino acid cho thời kỳ phát triển đầu tiên của cây. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 http://www.lrc-tnu.edu.vn Protease cũng tham gia vào phân giải các protein lạ hoặc protein bị biến tính khi gặp điều kiện cực đoan (hạn, lạnh, nóng…) [7]. Abscisic acid (ABA) là hocmone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh sinh lý, sinh trƣởng và phát triển, đáp ứng với môi trƣờng của thực vật bậc cao. ABA đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình của tế bào thực vật nhƣ: sự phát triển của hạt, sự ngủ, sự nảy mầm, sinh trƣởng phát triển, đáp ứng với stress của môi trƣờng. ABA chủ yếu đƣợc tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress của môi trƣờng. Khi cây gặp hạn, ABA có vai trò điều chỉnh sự trao đổi nƣớc trong cây hạn chế sự mất nƣớc và làm cây thích nghi đƣợc với điều kiện khô hạn. Về cơ chế ngƣời ta cho rằng ABA làm biến đổi điện hóa qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K+ [16]. Proline là một amino acid có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu trong tế bào, đồng thời là một amino acid ƣa nƣớc có khả năng giữ và lấy nƣớc cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ tƣơng tác với protein màng, ngăn chặn sự phá hủy của màng và các phức protein khác. Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy khi cây trồng gặp hạn thì cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp proline [7]. 1.2.3.3. Cơ sở di truyền của tính chịu hạn của cây ngô Tính chịu hạn ở cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng do nhiều gen quy định, các gen liên quan đến tính chịu hạn đã đƣợc phân lập nhƣ: HSP, LEA, LTP, P5CS, cystatin…  HSP (Heat Shock Protein) HSP có ở hầu hết các loài thực vật và chiếm khoảng 1% protein tổng số của lá. HSP xuất hiện trong cả các quá trình sinh trƣởng bình thƣờng và các giai đoạn biệt hóa mô của thực vật, chúng đƣợc tổng hợp thêm trong điều kiện cực đoan của môi trƣờng. Dựa vào khối lƣợng phân tử, ngƣời ta phân loại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn HSP ở thực vật ra làm 6 nhóm: HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP20, HSP8,5 [48]. Trong đó, nhóm HSP70, HSP60 có đại diện của chất môi giới phân tử (MGPT), MGPT là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau, chúng tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho phân tử protein mới tổng hợp, chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự huỷ hoại của protein chƣa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu sự phân giải protein bị biến tính. Nhóm HSP 8,5 (Ubiquitin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhƣng không phải là MGPT, chúng có hoạt tính proteinase và thực hiện chức năng phân giải protein nhƣng không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn các protein này gây độc cho tế bào. Các nhóm HSP100, HSP90 đều có tính bảo thủ cao và có hoạt tính ATPase. Một số tìm thấy trong tế bào bình thƣờng nhƣng phần lớn chúng sinh ra khi gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, nóng, lạnh. Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự co cụm của protein và tái hoạt hoá protein biến tính [45]. Trong tế bào thực vật, HSP tập trung thành các hạt sốc nhiệt HSG (Heat Shock Granules). Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử, các hạt HSG gồm các hạt HSP và mRNA. Các HSP gắn kết trên các RNA polymerase để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình bị stress nóng. Sau sốc nóng, các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein [42].  LEA (Late embryogenis abudant protein) Khi cây trồng gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ: nóng, lạnh, phèn, mặn, hạn,…làm cho tế bào bị mất nƣớc, LEA là loại protein đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi, nó là một trong những nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nƣớc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn của tế bào. Nhóm gen mã hóa loại protein LEA còn đóng vai trò quan trọng trong sự chịu khô của hạt. Khi hiện tƣợng mất nƣớc xảy ra, RNA của chúng xuất hiện trong hạt đang hình thành và dần trở thành một lƣợng lớn gồm nhiều loại RNA thông tin khác nhau trong hạt chín và bị phân giải hết trong quá trình nảy mầm. Ngoài ra LEA không những điều chỉnh quá trình mất nƣớc khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nƣớc bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra. Mức độ phiên mã của gen LEA đƣợc điều khiển bởi ABA và mức độ mất nƣớc của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào. Nhiều gen LEA đã đƣợc nghiên cứu, phân lập, xác định chức năng. Một đặc điểm nổi bật của nhóm protein này là: giàu acid amin không ƣa nƣớc, không chứa cystein và tryptophan, có vùng xoắn  và có khả năng chịu nhiệt. Chúng thay thế vị trí nƣớc trong tế bào và thực hiên các chức năng nhƣ: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, hủy protein biến tính và điều chỉnh áp suất thẩm thấu [12],[50].  LTP (Lipid Transfer Protein) Các protein vận chuyển lipid LTP (Lipid Transfer Protein) là protein có liên quan tới đặc tính chịu khô hạn ở thực vật. LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nƣớc. Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress môi trƣờng (muối, hạn). Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu và đtg nhận thấy rằng hàm lƣợng của mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress muối, hạn hay hàm lƣợng ABA ngoại bào tăng cao [34]. LTP đƣợc chia thành hai dạng khác nhau về khối lƣợng phân tử. Dạng thứ nhất có khối lƣợng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối lƣợng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2). Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại proline [32]. Có thể Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 http://www.lrc-tnu.edu.vn nói LTP đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn.  Gen P5CS (gen mã hóa enzyme Pyrroline-5-carboxylate synthetase) Nhóm gen P5CS mã hóa tổng hợp pyrroline-5-carboxylate synthetase. Enzyme P5SC giữ vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa sinh tổng hợp proline ở thực vật. Các nghiên cứu sử dụng enzyme này nhằm mục đích điều khiển hàm lƣợng proline để thích ứng và tăng cƣờng khả năng chống chịu của cây đối với các bất lợi về áp suất thẩm thấu và oxy hóa của môi trƣờng đã đƣợc thực hiện ở nhiều loài cây khác nhau. Nhƣ vậy, sự biểu hiện của gen P5CS mạnh sẽ làm tăng hàm lƣợng proline, có vai trò tăng áp suất thẩm thấu của tế bào và cây trong điều kiện hạn hán [15]. 1.2.4. Cystatin và vai trò của cystatin với tính chịu hạn 1.2.4.1. Cystatin Cystatin (CYS) là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase. Trong cơ thể sống, cysteine proteinase thực hiện nhiều chức năng quan trọng nhƣ: Trƣởng thành protein, làm mới protein để phù hợp với những thay đổi bên ngoài và loại bỏ protein bất thƣờng, protein gấp cuộn [29]. Khi thực vật gặp hạn, cysteine proteinase hiện diện nhƣ những proteinase tham gia vào quá trình thủy phân protein dự trữ. Quá trình này có thể bị cản trở bởi những chất ức chế proteinase đƣợc gọi là cystatin [22]. Cystatin đƣợc phân bố ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật cho thấy đây là nhóm chất đóng vai trò quan trọng với sự tồn tại, sinh trƣởng và phát triển của sinh vật [40]. Sự sai khác về kích thƣớc, khối lƣợng của phân tử protein, về số lƣợng và vị trí các liên kết disulphide…là căn cứ để phân loại cystatin thành 4 họ [29]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 http://www.lrc-tnu.edu.vn Cystatin họ 1, đƣợc biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc các nhóm carbohydrate, nó có trọng lƣợng phân tử khoảng 11kDa, gồm 100 gốc amino acid [35]. Cystatin họ 2, là protein có hai liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu carbon cuối cùng và đƣợc glycosyl hóa, có trọng lƣợng phân tử khoảng 13 24 kDa với 115 amino acid [21]. Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết tƣơng, nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết là các phức hợp phân tử cystatin có trọng lƣợng phân tử cao (60 - 120 kDa) với khoảng 355 gốc amino acid có chứa các liên kết disulfide. Các Kininogen giữ vai trò quan trọng trong quá trình đông tụ máu. Ngƣời ta đã tìm thấy ở các cystatin họ I và II dạng pentapeptide GlnVal-Val-Ala-Gly và trình tự tƣơng đồng Gln-X-Val-Y-Gly ở các cystatin họ II. Ngoài ra, trình tự Phe-Ala-Val đƣợc định vị gần đầu carboxyl và dipeptide Phe-Try gần đầu amino, là trình tự bảo thủ của cystatin họ II nhƣng không tìm thấy ở các cystatin họ I và III. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng vùng pentapeptide và dipeptide này đóng vai trò quan trọng trong việc bám với cysteine proteinase [35]. Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động vật và thực vật, ngƣời ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [44], gồm hầu hết các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với hầu hết các cystatin họ I và II. Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên đƣợc nghiên cứu sâu sắc nhất. Nó có mối liên hệ về mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng gà (Barett). Oryzacystatin cũng đƣợc xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng mặt của liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide cũng đƣợc tạo thành bởi Gln-ValVal-Ala-Gly ( gốc thứ 57 - 61) và khối lƣợng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 http://www.lrc-tnu.edu.vn