Tài liệu đánh giá khả năng biểu hiện hnf 4α trong tế bào gốc cuống rốn người

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG MINH TUẤN ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN HNF - 4α TRONG TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN NGƯỜI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Văn Hạnh 2. TS. Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS. Nguyễn Văn Hạnh – Quyền trưởng phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc TS.Nguyễn Hữu Đức – Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã luôn theo sát, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong cuộc sống cũng như quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn anh Đỗ Trung Kiên, em Nguyễn Thị Nga và các anh chị cán bộ phòng Công nghệ phôi, viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu từ đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào chức năng gan từ tế bào gốc người và chuột”, Mã số: VAST.ĐL.03/16-17, đề tài trọng điểm cấp viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................I LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................... II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................... V DANH MỤC HÌNH ẢNH.................................................................................................. VI DANH MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................................. VII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ..............................................................................................VIII THESIS ABSTRACT ........................................................................................................ IX PHẦN 1. MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................................ 1 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU .......................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích................................................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu..................................................................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3 2.1. TẾ BÀO GỐC .......................................................................................................... 3 2.1.1. Định nghĩa tế bào gốc.............................................................................................................. 3 2.1.2. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc ........................................................................................... 4 2.1.3. Ứng dụng của tế bào gốc......................................................................................................... 7 2.2. TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN ................................................................................ 11 2.2.1. Cấu tạo, chức năng của dây rốn ............................................................................................ 11 2.2.2. Tế bào gốc dây rốn ................................................................................................................ 12 2.2.3. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs.............................................. 15 2.3. NGHIÊN CỨU VỀ BIỆT HÓA HWJSCS .............................................................. 16 2.4. GEN HNF - 4Α ....................................................................................................... 18 2.4.1. Đặc điểm gen HNF - 4α ........................................................................................................ 18 2.4.2. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF - 4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc .................. 19 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 22 3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ........................................................ 22 3.2. NGUYÊN VẬT LIỆU ........................................................................................... 22 iii 3.2.1. Mẫu xét nghiệm ..................................................................................................................... 22 3.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất....................................................................................... 22 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 24 3.3.1. Thu nhận và xử lí dây cuống rốn .......................................................................................... 24 3.3.2. Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn.............................................................................. 25 3.3.4. Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR) ........... 29 3.3.5. Điện di trên gel agarose ......................................................................................................... 32 3.3.6. Phân lập gen HNF - 4α.......................................................................................................... 33 3.3.7. Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit ............................................ 34 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 35 4.1. PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO ............................................................... 35 4.1.1. Phân lập tế bào ....................................................................................................................... 35 4.1.2. Cấy chuyển tế bào.................................................................................................................. 38 4.1.3. Đông lạnh tế bào .................................................................................................................... 39 4.2. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN ........................................ 41 4.2.1. Đánh giá tính ổn định di truyền của TBGTM ..................................................................... 41 4.2.2. Tách chiết RNA tổng số ........................................................................................................ 43 4.2.3. Định lượng RNA tổng số ...................................................................................................... 43 4.2.4. Đánh giá đặc tính TBGTM và biểu hiện gen HNF – 4a trước khi biệt hóa ...................... 44 4.2.5. Đánh giá biểu hiện gen HNF - 4α sau khi xử lý biệt hóa .................................................... 47 4.3. PHÂN LẬP GEN HNF - 4Α ................................................................................... 49 4.3.1. Khuếch đại trình tự mã hóa của gen HNF - 4α.................................................................... 49 4.3.2. Tinh sạch đoạn DNA sau khi khuếch đại............................................................................. 50 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 53 5.1. KẾT LUẬN............................................................................................................ 53 5.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 53 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt HNF - 4α Nghĩa tiếng Việt MSC Mesenchymal Stem Cell iPS cell Induced pluripotent stem cell ES EG DNA Embryonic stem cells Embryonic germ cells RNA cDNA Bp Kb bFGF CHT CT DMEM/F12 dNTP EGF FBS HSC hWJSCs ICM IVF ITS ICSI TBGTM RT – PCR TBG WJ E.coli Taq UV CDS TAE Human hepatocyte nuclear factor - 4 Deoxyribonucleic acid Ribonucleic acid Complement deoxyribonucleic acid Base pair Kilo base Basic fibroblast growth factor Collagenase / hyaluronidase trypsin Collagenase/ trypsin Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 medium Deoxyribonucleotide Triphosphate Epidermal growth factor Fetal bovine serum Hemapoietic stem cell (human umbilical cord Wharton’s jelly Stem Cell) Tế bào gốc phân lập từ lớp Wharton’s jelly dây rốn người Inner cell mass In vitro fertilization Insulin – transferin – selenium Intracytop plasmide sperm injecti Tế bào gốc trung mô Reverse-transcription Polymerase chain reaction Tế bào gốc Wharton’s jelly Escherichia coli Thermus aquaticus Ultra violet (tia cực tím) Coding sequence (trình tự mã hóa) Tris-axit axetic-EDTA v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1. Chức năng của tế bào gốc ................................................................................... 3 Hình 2.2. Cấy ghép tế bào gốc tự thân (bên trái), cấy ghép đồng loại (bên phải) .............. 8 Hình 2.3. Sử dụng iPS cell trong thử nghiệm thuốc ......................................................... 10 Hình 2.4. Cấu tạo của dây rốn........................................................................................... 12 Hình 3.1. Mẫu dây rốn trước khi xử lý ............................................................................. 25 Hình 3.2. Sử dụng dao và panh để chọn lọc phần mô cần sử dụng .................................. 26 Hình 3.3. Mẫu dây rốn trước khi xử lý ............................................................................. 26 Hình 3.4. Tủ nuôi cấy tế bào 37oC, 5% CO2..................................................................... 27 Hình 3.5. Quy trình tách RNA tổng số bằng kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN) ............. 28 Hình 3.6. Nguyên lý RT-PCR ........................................................................................... 30 Hình 4.1. Tế bào bắt đầu mọc ra từ rìa mảnh mô ............................................................. 35 Hình 4.2. Tế bào trước khi cấy chuyển (trái) và ở lần cấy chuyển thứ 4 (phải) ............... 36 Hình 4.3. Tế bào phát triển thành những mảng song song, cuộn xoắn và gối lên nhau ............................................................................................................. 37 Hình 4.4. Tế bào mọc kín đĩa nuôi.................................................................................... 38 Hình 4.5. Tế bào sau khi được ủ với trypsin 0.25% trong 5 phút ở 37 0C ......................... 39 Hình 4.6. Tế bào soi trên kính hiển vi sau khi nhuộm Trypan Blue ................................. 40 Hình 4.7. Nhiễm sắc thể (NST) ở lần cấy chuyển thứ 2 ................................................... 42 Hình 4.8. Điện di đồ tách chiết RNA tổng số ................................................................... 43 Hình 4.9. Điện di đồ RT – PCR mẫu TBGTM sau phân lập ............................................ 46 Hình 4.10. Điện di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau xử lý biệt hóa ............................ 47 Hình 4.11. Điện di đồ PCR khuếch đại CDS của gen HNF - 4α ........................................ 50 Hình 4.12. Kết quả kiểm tra đối chiếu trình tự gen từ genbank.......................................... 52 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Trang thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 23 Bảng 3.2. Hóa chất thí nghiệm ............................................................................................. 23 Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR .................................................................................. 31 Bảng 3.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng đánh giá chỉ thị TBGTM ...................................... 32 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại CDS gen HNF - 4α ................................ 33 Bảng 4.1. Kết quả đo mật độ quang (OD) của các mẫu RNA tách chiết .............................. 44 Bảng 4.2. Trình tự oligonucleotide các mồi được sử dụng................................................... 45 Bảng 4.3. Thống kê biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong tế bào gốc ............................... 46 Bảng 4.4. Trình tự được đọc bằng mồi vector (PacI–HNF-4α và PacI–HNF-4α)............... 51 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể. Khả năng biệt hóa cho phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên hóa. TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG tủy xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) (Phan Kim Ngọc, 2009). Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan và ung thư gan (Cai et al, 2007; Cantz et al, 2008). Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình biệt hóa từ TBG cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người” để phục vụ cho các nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan theo định hướng vừa là yếu tố chỉ thị biệt hóa vừa là tác nhân gây biệt hóa. Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp nghiên cứu sau: Phương pháp phân lập tế bào (Được áp dụng theo A.Petsa (2009)), phương pháp tách RNA tổng số (Kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN)), phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR) (thực hiện theo Kary Mullis (1985)), phương pháp tách gel (Kit Gene Jet gel extraction), phương pháp tách plasmid (Kit Gene Jet plasmid miniprep), phương pháp điện di trên gel agarose (Thực hiện theo Kirkpatrick (1990)). Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được kết quả: nghiên cứu đã phân lập được tế bào gốc cuống rốn có đặc trưng của tế bào gốc trung mô như: dương tính CD90, CD73, CD105, âm tính với các chỉ thị đặc trưng cho tế bào gan là: ALB, HNF - 4α, G6P. Kết quả nghiên cứu cho thấy biểu hiện của gen HNF - 4α âm tính ở tế bào gốc cuống rốn trước xử lý biệt hóa. Sau xử lý biệt hóa với DMSO, chỉ thị gen HNF - 4α đã biểu hiện sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiên cứu đã phân lập thành công gen HNF - 4α với mức độ tương thích 100% với trình tự gen được kiểm tra trên genbank. viii THESIS ABSTRACT Stem cells are the potential cells in the body. The cell's ability to differentiate into other specialized cell types. The umbilical cord stem cells are capable of having all characteristics of pluripotent stem cells such as bone marrow stem cells (Phan Kim Ngoc, 2009). Recently a series of studies have demonstrated to differentiate the umbilical cord stem cells into liver cells, giving hope for the hundreds of millions of patients with hepatitis and liver cancer (Cai et al., 2007; Cantz et al., 2008). However, the exact mechanism of the differentiation from umbilical cord blood stem cells into hepatocytes still need to be clarified. We conducted a study on the topic of "Evaluating the ability of expression HNF - 4α in the umbilical cord stem cells" to serve the study of differentiation from the umbilical cord stem cells into hepatocytes oriented as both an indicator and differentiation. In this thesis, we have used the following research methods: Cellular isolation (Applied by A.Petsa (2009)), total RNA extraction (Kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN)), The Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method (Kary Mullis, 1985), Kit Gene Jet Gel Extraction, Gene Gene Jet Plasmid Miniprep, Agarose gel electrophoresis (Follow Kirkpatrick (1990)). After the implementation of the project, we have obtained the following results: Research has isolated cord stem cells with characterized mesenchymal stem cells such as positive with the CD90, CD73, CD105 markers, negative with specific indicators for hepatocellular carcinoma are: ALB, HNF - 4α, G6P. Results show that the expression of the HNF-4α gene is negative in cord blood stem cells prior to differentiation. After DMSO treatment and 4 weeks of culture, the HNF-4α gene expression was demonstrated. The study successfully isolated the gene HNF - 4α with 100% compatibility with the gene sequence tested on Genbank. ix PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể. Khả năng biệt hóa cho phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên hóa. Với đặc điểm này, TBG có thể được khai thác với nhiều ứng dụng. Nhiều nghiên cứu ứng dụng TBG trong lĩnh vực y sinh học đã được thực hiện nhằm điều trị các bệnh nan y khác nhau như: tiểu đường, liệt do chấn thương tuỷ sống, suy tim do tổn thương cơ tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen…. Đặc biệt, trong chuyên khoa huyết học, TBG có thể điều trị trên 70 loại bệnh lý huyết học khác nhau liên quan đến tổn thương cơ quan tạo máu, một số bệnh di truyền bẩm sinh về chuyển hoá và suy giảm miễn dịch, ung thư máu…TBG còn được sử dụng trong các chuyên ngành khác như: thẩm mỹ, trong nghiên cứu dược lý. Nói cách khác, TBG mở ra một hướng phát triển, biện pháp chữa trị mới với những căn bệnh đến giờ vẫn vô phương cứu chữa, thắp sáng hy vọng về tiềm năng y học của kỹ thuật tái sinh. Trước đây, nguồn TBG sử dụng cho các nghiên cứu chủ yếu là TBG phôi. Nhưng vì phải lấy các TBG này từ phôi cho nên phần lớn các Giáo hội công giáo và chính trị gia đã phản đối gay gắt vì cho rằng đây là vấn đề xâm phạm đến đạo đức, niềm tin tôn giáo (Bongso et al, 2013). Để tìm hướng giải quyết mới cho vấn đề này, các nhà khoa học đã tìm ra TBG từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó có TBG từ người trưởng thành. TBG trưởng thành là TBG đa năng, có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau. Tuy nhiên, việc thu thập TBG gặp phải khó khăn khi lượng tế bào thu được rất ít, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe, tế bào ít tiềm năng và khó biệt hóa. Người ta cũng đã tìm thấy một loại TBG đa năng trong dây rốn của trẻ sơ sinh (TBG nhũ nhi), đây được cho là một phát hiện quan trọng vì có thể thu thập TBG từ dây rốn - vốn được coi là một loại rác thải y tế (Romanow et al, 2003). TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG tủy xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) (Phan Kim Ngọc, 2009). Hiệu quả ứng dụng trong lâm sàng cao hơn vì việc thu thập TBG dây rốn khá dễ dàng, an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe của mẹ và con, có thể chủ động kiểm 1 soát tình trạng nhiễm các bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B, viêm gan C qua việc xét nghiệm trước sinh đối với sản phụ. Bên cạnh đó, tế bào gốc có khả năng biệt hóa và khả năng tự làm mới. Biệt hóa là khả năng tạo ra các tế bào chuyên hóa trong cơ thể trong khi tự làm mới là quá trình duy trì tính gốc không đổi qua các thế hệ tế bào (Tuch, 2006). Nhờ đó, biệt hóa tế bào gốc thành các dạng tế bào chuyên hóa khác đang là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng cao. Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan và ung thư gan (Cai et al, 2007; Cantz et al, 2008). Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình biệt hóa từ TBG cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn. Bên cạnh những tác nhân môi trường trong các môi trường biệt hóa tế bào gốc như dexamethasone hay yếu tố sinh trưởng như FGF (fibroblast growth factor), một số yếu tố phiên mã, ví dụ như gen HNF-4α, cũng đang được tập trung nghiên cứu. Từ đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người” để phục vụ cho các nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan theo định hướng vừa là yếu tố chỉ thị biệt hóa vừa là tác nhân gây biệt hóa. 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Đánh giá được khả năng biểu hiện của gen HNF - 4α trong tế bào gốc người trước và sau khi biệt hóa. Phân lập được gen HNF - 4α phục vụ cho các nghiên cứu sau này dùng làm tác nhân biệt hóa. 1.2.2. Yêu cầu - Phân lập nhân nuôi ổn định được tế bào gốc cuống rốn người. - Đánh giá biểu hiện của gen HNF - 4α ở tế bào gốc cuống rốn người trước và sau khi xử lý biệt hóa. - Phân lập được gen HNF - 4α. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TẾ BÀO GỐC 2.1.1. Định nghĩa tế bào gốc Tế bào gốc là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hóa trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức phận sinh lí. Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế bào gốc có thể tự làm mới với các tính năng riêng biệt (Phan Kim Ngọc, 2009; Ariff et al, 2005). Các tế bào gốc này có thể biệt hóa được thành các tế bào chuyên dụng khác nhau, hoặc thành cả 1 cơ thể hoàn thiện. Hình 2.1. Chức năng của tế bào gốc Nguồn: https://www.cryo-cell.com/cord-blood/about-stem-cells Ngày nay, tế bào gốc được tách và thu nhận từ rất nhiều nguồn (phôi thai giai đoạn tiền làm tổ, thai, cơ thể trưởng thành, sinh phẩm phụ sản). Dưới các điều kiện hiện tại, những tế bào gốc chưa biệt hóa có thể vạn năng (có khả năng biệt hóa thành các tế bào từ ba lá phôi), hay đa năng (chỉ có khả năng biệt hóa thành một số có giới hạn nhất định các tế bào chuyên hóa). 3 2.1.2. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc 2.1.2.1. Đặc tính của tế bào gốc Một tế bào được gọi là tế bào gốc cần có hai đặc tính quan trọng sau: khả năng biệt hóa, và sự tự làm mới (Phan Kim Ngọc, 2009; Gerald et al, 2003; Nair et al, 2007). a) Khả năng biệt hóa Tế bào gốc là tế bào chưa chuyên hóa, vì vậy, nó có khả năng biệt hóa thành các tế bào chức năng chuyên biệt. Thu nhận tế bào gốc ở những giai đoạn khác nhau, tại nơi thu nhận khác nhau…mà khả năng này thay đổi. Tiềm năng biệt hóa của chúng có thể là vạn năng, đa năng, hay là vài tiềm năng. Các tế bào gốc phôi giai đoạn phôi sớm có khả năng biệt hóa thành bất kì một loại tế bào nào của ba lá phôi (ngoại bì, trung bì, và nội bì), thậm chí là cả một cơ thể hoàn chỉnh được gọi là tế bào vạn năng. Các tế bào thu ở gian đoạn phôi nang có khả năng biệt hóa thành hầu hết các tế bào chức năng của cơ thể, tuy nhiên nó không thể hình thành nên cả một cơ thể hoàn chỉnh. Các tế bào này còn được gọi là tế bào đa tiềm năng. Ngoài ra, các tế bào gốc thu nhận tại các cơ quan chuyên hóa của cơ thể trưởng thành chỉ có khả năng biệt hóa thành một số loại tế bào khác nhau. Tiềm năng biệt hóa của chúng rất thấp. Tuy nhiên chúng cũng có những lợi ích riêng mà ở các tế bào khác không có, chúng được biết đến là các tế bào vài tiềm năng. Để xác định tính vạn năng của một tế bào gốc, người ta có thể sử dụng các phương pháp như: sử dụng marker phân tử, kiểm tra tính vạn năng in vitro. Để kiểm tra tính vạn năng in vitro, chúng ta phải thực hiện ba thí nghiệm sau: - Tiến hành tiêm các tế bào gốc cần kiểm tra vào khoang phôi, giai đoạn phôi nang của một loài/giống khác. Nếu là tế bào gốc vạn năng, chúng sẽ sát nhập với các tế bào ICM của phôi nhận thành một khối và từ đó giữa chúng sẽ có sự “phân công” biệt hóa cho nhau. Kết quả là những tế bào tiêm vào sẽ tham gia vào việc hình thành các cơ quan, bộ phận của cơ thể sinh ra, gọi là sự khảm và cơ thể có sự khảm này gọi là thể khảm. Đây là thí nghiệm cho thấy rõ tính vạn năng của các tế bào gốc. Tuy nhiên, phương pháp này không được phép sử dụng ở người. 4 - Thí nghiệm thứ hai là tiến hành tiêm các tế bào gốc ứng viên vạn năng vào tinh hoàn, dưới da, hay vỏ thận của động vật khiếm khuyết miễn dịch. Nếu có tính vạn năng, sau khi tiêm sẽ hình thành các khối u quái chứa các mô khác nhau xuất phát từ cả ba lá phôi, nhưng bị sắp xếp rất rối loạn. - Thí nghiệm thứ ba là các tế bào gốc có khả năng biệt hóa in vitro. Sự biệt hóa tự phát sẽ xảy ra khi nuôi trong môi trường không có lớp feeder, hay nhân tố ức chế bệnh bạch cầu (LIF). Chúng sẽ hình thành những lùm tế bào chứa đầy dịch gọi là thể phôi. Nếu các thể phôi bán vào đĩa nuôi, chúng sẽ biệt hóa thành nhiều kiểu mô và các khối u (Phan Kim Ngọc, 2009). b) Sự tự làm mới Sự tự làm mới có thể được định nghĩa là quá trình tạo ra những bản sao các tế bào gốc, thông qua quá trình nguyên phân. Trong tính tự làm mới, sự phân chia tế bào đối xứng có thể tạo ra hai tế bào gốc, sự phân chia không đối xứng có thể tạo một tế bào gốc, hoặc là một tế bào gốc, hay một tế bào gốc với khả năng biệt hóa có giới hạn (Phan Kim Ngọc, 2009). Hai hoạt động chủ yếu của chu kì tế bào là: tổng hợp DNA để nhân đôi nhiễm sắc thể trong pha S và sự phân chia tế bào trong pha M. Pha G 1 (xảy ra trước pha S và sau pha M) có nhiệm vụ chuẩn bị các vật liệu cho quá trình nhân đôi DNA còn pha G2 (xảy ra sau pha S) tổng hợp vật liệu cho quá trình phân chia tế bào. Pha M là pha diễn ra 2 quá trình quan trọng: nguyên phân (mitosis) và phân bào (cytokinesis). Nhưng không phải tế bào nào cũng trải qua chu trình như vậy mà vài tế bào dừng lại pha G0, tồn tại ở trạng thái nghỉ hay im lặng (trạng thái không phân chia) và đi vào quá trình biệt hóa. Các tế bào này cũng có thể tiếp tục phân chia khi nhận được các tín hiệu ngoại bào kích hoạt quá trình phát triển. 2.1.2.2. Phân loại tế bào gốc Sau khi các kết quả các công trình của Shinya Yamanaka (Đại học Kyoto Nhật Bản) và James Thompson (Đại học Jinconsin của Mỹ) được công bố chính thức, cũng như thuyết tế bào ung thư được nhiều người nghiên cứu thẩm định, tế bào gốc được chia thành năm nhóm chính: - Tế bào gốc phôi (ESC - Embryonic stem cell) (thu nhận từ phôi thai, giai đoạn tiền làm tổ). 5 - Tế bào gốc nhũ nhi (thu nhận từ thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối, màng lót dây rốn). - Tế bào gốc trưởng thành (thu nhận từ cơ thể trưởng thành). - Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC – TBG vạn năng cảm ứng) (được tạo ra từ thao tác in vitro trên chính bộ gene đã biệt hóa chức năng của chúng). - Tế bào gốc ung thư (CSC – Cancer stem cell) (chỉ có trong khối u, và là nguồn gốc của khối u) (Phan Kim Ngọc, 2009). Ngoài ra, dựa vào các chỉ tiêu khác nhau như: khả năng biệt hóa của tế bào gốc, nơi thu nhận tế bào gốc, kiểu tế bào biệt hóa, ta có thể chia các tế bào gốc thành các nhóm tế bào khác nhau. - Dựa vào khả năng biệt hóa: tế bào toàn năng, tế bào vạn năng, tế bào đa năng, tế bào vài tiềm năng…. - Dựa vào vị trí thu nhận: tế bào gốc phôi, tế bào mầm, tế bào gốc ung thư biểu mô phôi, tế bào gốc trưởng thành. - Dựa vào kiểu tế bào biệt hóa: tế bào gốc cơ tim, tế bào gốc xương. 2.1.2.3. Các marker bề mặt của tế bào gốc Nghiên cứu nhận diện tế bào gốc bằng cách xác định chức năng của chúng và nhận diện thông qua các marker của tế bào. Việc nghiên cứu để xác định các kháng nguyên bề mặt là rất cần thiết. Có nhiều marker bề mặt biểu hiện đặc trưng cho các dòng tế bào gốc khác nhau, có thể ví dụ mội số marker đặc trưng như sau: - CD14: Kháng nguyên tế bào bạch cầu đơn nhân. Các tế bào gốc trung mô biểu hiện âm tính (Phan Kim Ngọc, 2009). - CD34: Là marker đầu tiên được dùng để nhận diện các tế bào tạo máu người và là marker được sử dụng phổ biến cho việc thu nhận quần thể tế bào tiền thân nội mô, tế bào tiền thân tạo máu, tế bào nội mô trưởng thành. Ngoài ra CD34 còn biểu hiện dương tính ở dòng tế bào tiền thân lympho, tế bào tiền thân dòng tủy, tiền thân đại thực bào, bạch cầu hạt, tiền thân hồng cầu (Phan Kim Ngọc, 2009). Đối với tế bào gốc trung mô, CD34 biểu hiện âm tính. - CD45: Một tyrosine phosphatase A được biết là marker HSC của các tế bào tiền thân dòng tủy và âm tính trong các tế bào gốc trung mô thu được từ cuống rốn 6 người. Sử dụng kháng nguyên CD45 để loại trừ tế bào gốc máu trong quần thể tế bào gốc trung mô thu nhận từ cuống rốn người và như vậy có thể phân lập được quần thể tế bào (Karen et al, 2008). - CD90 biểu hiện dương tính với các tế bào gốc trung mô thu được từ cuống rốn. - CD73: Được gọi là ecto - 5' - nucleotidase là enzyme bề mặt tế bào liên kết glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) được tìm thấy trong hầu hết các mô. CD73, được định nghĩa như là một kháng nguyên phân biệt lymphocyte, có chức năng như là một phân tử đồng tín hiệu trên các tế bào lympho T và là một phân tử kết dính quan trọng cho sự liên kết lymphocyte với nội mô (Bin Zhang (2010). Marker CD73 là marker bề mặt cho kết quả dương tính với các tế bào gốc trung mô (Teresa et al, 2016). - CD105: Endoglin (CD105), một glycoprotein màng tế bào biểu hiện chủ yếu trên các dòng tế bào trong hệ thống mạch máu, và biểu hiện quá nhiều trên các tế bào màng nội mạc tử cung, có liên quan đến sự phát triển của mạch máu và là dấu hiệu mạnh mẽ của việc hình thành vi mạch. CD105 bám vào một vài factor trong nhân tố tăng trưởng chuyển hóa (TGF-Transforming Growth Factor-beta), điều chỉnh các chức năng tế bào khác nhau bao gồm sự tăng sinh, phân biệt và di chuyển. Trong các khối u ác tính ở người có các biểu hiện khác nhau, CD105 được biểu hiện rất mạnh trên các tế bào nội mạc của cả mạch máu ở trong và ngoài tử cung, trong khi nó được biểu hiện yếu hoặc không có trong tế bào ung thư (Fonsatti et al, 2003). Sử dụng kết hợp các marker kháng thể bề mặt đơn dòng liên hợp ta sẽ nhận diện đươc nhóm tế bào gốc trung mô theo Bin Zhang (2010). 2.1.3. Ứng dụng của tế bào gốc 2.1.3.1. Cấy ghép tế bào gốc Cấy ghép tế bào gốc đang là một phương pháp hữu hiệu nhất để chữa trị một số bệnh hiểm nghèo như ung thư, các bệnh về gan… Các tế bào gốc đưa vào cơ thể có chức năng bù đắp vai trò của các tế bào hỏng, hoặc có thể là phụ giúp trong quá trình hóa trị liều cao. Khi cấy ghép các tế bào gốc, chúng phải được thu nhận và làm giàu thông qua nuôi cấy hay các phương pháp khác để sau đó đưa vào cơ thể bệnh nhân. Trong cơ thể bệnh nhân, các tế bào gốc này sẽ biệt hóa và khôi phục lại những 7 tổn thương, mất mát trong bệnh nhân. Hiện nay, có hai phương pháp cấy ghép tế bào gốc: cấy ghép tự thân, cấy ghép đồng loại. Cấy ghép đồng loại là cấy ghép tế bào gốc của người khác, có thể là người thân hoặc người khả năng phù hợp với cơ thể bệnh nhân về các chỉ tiêu sinh lý hóa. Điều này dẫn tới một số hạn chế như thải loại ghép, thời gian chờ đợi nguồn cho tế bào gốc… Khác với nó, cấy ghép tự thân là sử dụng chính tế bào gốc của bệnh nhân, ghép vào cơ thể của họ. Vì thế giảm thiểu được khả năng thải loại ghép và tránh tình trạng chờ đợi nguồn cho. Do đó, cấy ghép tế bào gốc tự thân đang là một phương pháp đầy hứa hẹn cho nền y học hiện nay. Hình 2.2. Cấy ghép tế bào gốc tự thân (bên trái), cấy ghép đồng loại (bên phải) 2.1.3.2. Công nghệ mô, cấy ghép cơ quan Mục tiêu của công nghệ mô là tái tạo các cấu trúc sinh học bằng sửa chữa thay thế các mô bị tổn thương. Ba yếu tố cấu thành nên công nghệ mô là: (1) tế bào phải 8 hiện diện để tạo ra mô cấu trúc; (2) nhân tố phát triển thích hợp và các kích thích biệt hóa cho tế bào phải tồn tại để biến đổi tế bào thành dòng thích hợp; (3) các chất nền làm giàn giáo hoạt động giúp cho sự bám dính bề mặt tế bào, sự biệt hóa và sự trưởng thành mô mong muốn (Phan Kim Ngọc, 2009). Hai ứng dụng của các tế bào gốc thường thấy trong công nghệ mô là tái tạo da có liên quan đến sự hình thành cấu trúc của các phiến hai chiều và sự hình thành xương liên quan đến quá trình tái cấu trúc của cấu trúc bên trong dạng ba chiều. 2.1.3.3. Liệu pháp gen Liệu pháp gen có thể được phát huy bằng cách sử dụng tế bào gốc biến đổi di truyền như một vector mang gen chuyển. Để ứng dụng thành công liệu pháp gen tế bào gốc, đòi hỏi các gen liệu pháp được đưa vào đang còn khả năng tự làm mới hay trong các thế hệ con cháu đã biệt hóa của chúng. Nguyên tắc đảm bảo có sự tồn tại của gen mục tiêu trong các tế bào chủ thì gen chuyển phải được sát nhập vào một trong các nhiễm sắc thể của tế bào hoặc có sự hợp nhất gen mục tiêu vào bên trong các vi nhiễm sắc thể trong quá trình tổng hợp. Ngoài ra, trong liệu pháp gen tế bào gốc còn tiến hành sửa chữa bộ gen, đầu tiên phân phối các phân tử sửa chữa vào tế bào, sao cho việc này không làm mất chức năng SCs và đồng thời phải sửa chữa thành công trực tiếp lên trình tự gen trong các SCs (Phan Kim Ngọc, 2009). Các rủi ro do hệ thống mang gen có thể gây ra và sự đáp ứng thải loại miễn dịch. Sử dụng tế bào gốc đưa gen vào cơ thể, nghĩa là thu nhận tế bào sinh dưỡng trưởng thành của cơ thể dùng để cho nhân, nhân này được chuyển vào tế bào trứng loại bỏ nhân và sau đó tế bào này sẽ phát triển tạo thành phôi mới. 9 2.1.3.4. Kiểm nghiệm hóa chất Hình 2.3. Sử dụng iPS cell trong thử nghiệm thuốc Nguồn: http://dpbio2017.blogspot.com/2015/10/stem-cells.html Đối với các tế bào ở các mô non, khối u lành tính; thì những tế bào gốc là những tế bào bình thường về di truyền, đồng nhất trong quần thể, nên có thể nuôi cấy và duy trì trong một thời gian dài, và khắc phục được hạn chế của các kết luận dựa trên chức năng gen. Do vậy, tế bào gốc là công cụ quan trọng cho sự phát triển các hệ thống mô hình in vitro thử nghiệm thuốc và hóa chất, ngoài ra chúng còn có tiềm năng dự đoán trước độc tính trong cơ thể người. 2.1.3.5. Biến đổi gen động vật Có thể chuyển gen bằng cách biến đổi di truyền các tế bào gốc. Các phương pháp thường dùng như: chuyển NST, lai tế bào, dung hợp vi tiêm tế bào, chuyển DNA bằng calcium phosphate, vi tiêm DNA, sử dụng retrovirus vector và điện khoan…Các tế bào gốc phôi ở giai đoạn 16 – 32 tế bào được sử dụng để biến nạp gen bằng cách nhiễm với vector virus. Sau khi chọn ra các tế bào đã được biến nạp gen chuyển, tiến hành đưa chúng vào phôi khác ở giai đoạn phôi nang để tạo ra động vật chuyển gen thể khảm. Tỷ lệ các phôi sống sau thao tác khá cao (80%), trong đó 90% biểu hiện tính trạng của gen chuyển. Tiếp đó, người ta tiến hành lai tạo qua các đời, để thu được động vật đồng hợp tử về các tính trạng mong muốn đã được chuyển trước đó (Phan Kim Ngọc, 2009). 10