Tài liệu đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen ssiv vào cây sắn

VIỆN KHOA HỌC VÀVÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆNHÀN HÀNLÂM LÂM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HỒNG NGUYỄN THỊ MINH HỒNG ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NỘI - 2018 HÀHÀ NỘI - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HỒNG ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Bích Ngọc Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS. Chu Hoàng Hà. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Minh Hồng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trung tâm tài nguyên thực vật, Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài: “Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn có khả năng chống chịu bệnh và năng suất cao bằng công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ; thời gian thực hiện từ 6/2012 đến 6/2015 do PGS.TS. Phạm Bích Ngọc làm chủ nhiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, và Bộ phận phụ trách đào tạo đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận án. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa, Lãnh đạo khoa và cán bộ trong bộ môn Khoa học cây trồng, Bảo vệ thực vật, khoa Nông Lâm Ngư nghiệp, ĐH Hồng Đức đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi yên tâm công tác, học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Hồng ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 4 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 1.1. Cây sắn và một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn............. 4 4 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại..................................................................................... 4 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền ........................................................ 5 5 1.1.3. Giá trị của cây sắn ............................................................................................. 8 8 1.1.4. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam............................................. 9 9 1.1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn................................. 13 13 1.1.6. Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay ....................................................... 15 15 1.2. Quá trình hình thành và tích luỹ tinh bột ở cây sắn ......................................... 19 1.2.1. Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật ....................................................... 19 19 1.2.2. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan ....................................... 20 20 1.3. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống sắn biến đổi gen ........ 27 27 1.3.1. Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn .................................................................. 27 27 1.3.2. Một số phương pháp chuyển gen ở sắn........................................................... 32 32 1.3.3. Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen ................................................... 35 35 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 43 43 2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 43 43 2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................................. 43 43 2.1.2. Chủng vi khuẩn, vector ................................................................................... 43 43 2.1.3. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm ....................................................................... 43 43 2.1.4. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 44 44 2.1.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 45 45 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 45 45 2.2.1. Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu đánh giá .............................................................................................................................. 45 45 2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử ................................................................. 45 45 2.2.3. Phương pháp phân lập gen và promoter ......................................................... 51 51 2.2.4. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen ................................................. 52 52 2.2.5. Kỹ thuật canh tác, chăm sóc các giố ng sắ n phu ̣c vu ̣ cho nghiên cứu ............. 54 54 iii 2.2.6. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................................... 54 54 2.2.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ........................ 55 55 2.2.8. Phương pháp phân tích sự có mặt của gen chuyển ......................................... 56 56 2.2.9. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của cây chuyển gen............................... 57 57 2.2.10. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu ......................................................... 60 60 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 61 61 3.1. Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột ....................................................................................... 61 61 3.1.1. Lựa chọn các giống sắn sử dụng ..................................................................... 61 61 3.1.2. Thu mẫu và xử lý mẫu sắn .............................................................................. 62 62 3.1.3. Tách chiết ARN tổng số .................................................................................. 63 62 3.1.4. Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số của lá, củ sắn trong các giai đoạn phát triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA ................................................. 64 64 3.1.5. Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột ....................... 65 65 3.1.6. Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và củ sắn ......................................................................................................................... 66 66 3.2. Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen .......................................................................................... 75 3.2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu ............................................................................... 75 75 3.2.2. Phân lập gen SSIV ở sắn ................................................................................. 76 76 3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen ............................................................................. 82 82 3.3. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá ............................................................................ 87 87 3.3.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen chuyển ....................................................................................................................... 87 87 3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển................................................................ 91 92 3.3. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá ................................................................... 87 3.3.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen 87 chuyển .......................................................................................................................87 3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển................................................................ 92 92 iv 3.4. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn .............. 99 99 3.4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây sắn .................................................... 99 99 3.4.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua gen GUS ......................................................................................................................... 106 106 3.4.3. Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột ............. 113 113 Chương 4. BÀ N LUẬN KẾT QUẢ ...................................................................... 118 118 4.1. Sự biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột............................................................................................................. 118 4.2. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc lá .............................................................................................................................. 122 122 4.3. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn ............ 124 124 4.3.1. Hệ thống tái sinh cây sắn .............................................................................. 124 124 4.3.2. Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A. tumefaciens ................................... 126 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 130 130 TÓM TẮT TIẾNG ANH…………………………………………………… 131 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ…………………………………………...…….. 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 137 137 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng của sắn 9 Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng sắn của các vùng trên thế giới trong năm 2014 – 2015 10 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam từ năm 2010 – 2014 12 Bảng 1.4 Một số công trình nghiên cứu tái sinh invitro ở cây sắn 29 Bảng 1.5 Tổng kết một số công trình công bố về chuyển gen vào cây sắn 36 Bảng 3.1 Đặc điểm của một số giống sắn sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 62 Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu RNA tổng số tách chiết từ lá và củ các giống sắn 63 Cơ sở dữ liê ̣u các gen liên quan đế n quá trình sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắ n 66 Bảng 3.4 Trình tự các cặp mồi để khuếch đại các gen quan tâm 75 Bảng 3.5 Trình tự các cặp mồi nhân dòng gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen 76 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen SSIV ở giống KM140 so với gen tham chiếu 78 Vị trí sai khác trong trình tự axit amin suy diễn của protein SSIV của gen phân lập 79 Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S: SSIV:T35S và pBI121C54: SSIV:NOST vào thuốc lá………………………………... 90 Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong lá và trong rễ cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S ở các dòng chuyển gen 97 Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong rễ cây thuốc lá chuyển gen pBI121 – C54: SSIV: NOST ở các dòng chuyển gen 98 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu và môi trường đến khả năng tạo mô sẹo (sau 3 tuần) 100 Bảng 3.12 Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi trên môi trường CI 102 Bảng 3.13 Tỷ lệ phôi soma tạo cây con 104 Bảng 3.14 Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa 105 Bảng 1.3 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 vi Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển gen giống sắn KM140 108 Ảnh hưởng của Kanamycin đến khả năng sống sót của mô sẹo chuyển gen GUS ở giống sắn HB80 và KM140 109 Ảnh hưởng của Kanamycin đến tỷ lệ ra rễ của chồi giống sắn HB80 và KM140 110 Tạo cây sắn HB80 và KM140 chuyển gen GUS thông qua A.tumefaciens 111 Chuyển gen pBI121- C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140 114 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 2.1 Hình 2.2 Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz) Một số phương pháp phổ biến tạo cây sắn biến đổi gen Công thức hóa học của tinh bột Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan Quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây sắn Kết quả tạo mô sẹo phôi hoá ở giống sắn TME 14 Trình tự đoạn cmyc và vị trí của các mồi PCR Quá trình canh tác và thu hoa ̣ch các giố ng sắ n quan tâm ta ̣i Tra ̣i thực nghiê ̣m sinh học Cổ Nhuế phu ̣c vu ̣ nghiên cứu Hình 2.3 Quy trình kiểm tra hàm lượng tinh bột trong lá bằng phương pháp nhuộm iodine Hình 2.4 Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ lá cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ rễ cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121 – C54:SSIV: NOST Hình ảnh minh họa vị trí lá và củ sắn Hình 2.5 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 RNA tổng số tách chiết từ các mẫu củ (A) và lá các giống sắn (B) Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen actin từ cDNA sắn Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPS qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 6 18 20 21 31 32 53 54 58 59 60 62 63 64 67 Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPL qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 68 Phân tích mức độ biểu hiện gen GBSS qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 69 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSI, SSIII, SSIV qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 71 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSII qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 72 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SBE qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR Tách dòng đoạn gen SSIV từ củ sắn Tách dòng promoter C54 ở sắn Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Thiết kế vector pBI121/cmyc Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST 74 77 81 83 84 85 viii Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Hình 3.18 Hình 3.19 Hình 3.20 Hình 3.21 Hình 3.22 Hình 3.23 Hình 3.24 Hình 3.25 Hình 3.26 Hình 3.27 Hình 3.28 Hình 3.29 Hình 3.30 Hình 3.31 Hình 3.32 Hình 3.33 Hình 3.34 Quy trình chuyển gen vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 88 Một số hình ảnh chuyển các gen quan tâm vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 89 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D35S:SSIV:T35S bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R 91 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121C54:SSIV:NOST Kết quả Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển gen SSIV Ảnh điện di RNA tổng số được tách từ các mẫu thuốc lá chuyển gen Kết quả PCR nhân gen actin từ cDNA của lá từ một số dòng thuốc lá chuyển gen 91 92 93 94 Điê ̣n di sản phẩ m RT-PCR của các gen SSIV ở các dòng thuốc lá chuyển gen tương ứng 95 Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 96 Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV: NOST Mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu khác nhau Các khối mô sẹo phân hóa các giai đoạn mô phôi khác nhau ở 5 giống sắn thí nghiệm Chồi và cây sắn tái sinh từ mô sẹo phôi hóa Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biến nạp gen GUS ở giống sắn HB80 và KM140 Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 và KM140 Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140 Cây sắn giống KM140 chuyển gen SSIV được trồng ở nhà lưới Điện di DNA tổng số các dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST 98 101 103 106 107 112 115 115 116 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với cặp mồi promoter C54F/SSIV-R 116 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với cặp mồi virF/R 117 ix DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng Anh Ký hiệu µl Microliter µM Micromolar 2.4D axit 2,4-diclophenoxiaxetic Nghĩa tiếng Việt A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AGPase ADP-glucose pyrophosphorylase AS Acetosyringone BAP 6 – Benzyl amino purine bp Base pair cDNA Complementary DNA CG cặp bazơ nitơ Chuyển gen CIAT International Center for Tropical Agriculture CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Trung tâm nông nghiệp nhiệt đới quốc tế Cộng sự, đồng tác giả Cs, et al., DBE Debranching enzyme DNA Deoxiribonucleic Acid Đỏ ĐF enzyme phân rã tinh bột Đỏ địa phương E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid EtBr Ethidium Bromid FEC Friable embryo callus Mô sẹo phôi hóa GBSS granule-bound synthetase enzyme tổng hợp amylose GUS β –Glucuronidase gene Gen GUS HSPs Heat shock proteins IBA Indol -3- butyric acid Kb Kilo base Kinetin 6 – fufuryl amino purine Km Kanamycin x KM140 KM140 (KM98-1 x KM36) LB Luria –Bertani Môi trường LB M Marker Thang chuẩn mRNA messenger RNA RNA thông tin MS Murashige and Skoog Môi trường MS MTCL Mg Miligam mg/L; mg/mL; ng/g Miligam/lit; miligam/mililit; nanogam/gam NAA α – Napthyl acetic acid nptII Neomycin photphotranspherase gene OD Optical density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Picloram 4-amino-3,4,5 tricloro pyridine - 2cacboxylic acid RM Rooted Medium RT-PCR Realtime polymerase chain reaction SBE Starch branching enzyme enzyme phân nhánh tinh bột SS Starch synthase Enzyme sinh tổng hợp tinh bột SSIV Starch synthase IV Enzyme sinh tổng hợp tinh bột nhóm IV T-DNA Transfer-DNA DNA vận chuyển Môi trường ra rễ Trắng HB Trắng Hòa Bình Trắng NA Trắng Nghệ An WP Working package Dòng không chuyển gen WT X-gluc Nội dung 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide xi 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong những loại cây lương thực chủ lực quan trọng nhất đối với nhiều nước trên thế giới do chúng khả năng cung cấp carbonhydrate cao, thậm chí trong các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như lượng mưa thấp, hạn hán hoặc đất nghèo dinh dưỡng. Hiện nay, trong bối cảnh biến đổi khí hậu làm trái đất nóng lên, nước biển dâng cao, đe dọa an ninh lương thực thế giới và sự cạn kiệt của nguồn nguyên liệu hóa thạch thì cây sắn được coi là cây trồng đem lại giải pháp kép nhằm đạt cả hai mục tiêu: góp phần đảm bảo an ninh lương thực và cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, từng bước thay thế nhiên liệu hóa thạch. Trong kế hoạch 5 năm 2015 - 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đưa ra chủ trương giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn. Kế hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha vào năm 2015 và ổn định diện tích 450.000 ha vào năm 2020, năng suất đạt khoảng 21 tấn/ha. Nếu đạt được theo kế hoạch với mức sản lượng 11 triệu tấn thì vẫn sẽ xảy ra tình trạng tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản xuất ethanol với các nhà máy thức ăn chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn và lượng sắn dùng cho xuất khẩu. Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng như là nguồn lương thực và nguyên liệu công nghiệp. Hiện nay, việc cải tiến cây trồng theo hướng tăng hàm lượng tinh bột là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng và luôn được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Do vậy, các nghiên cứu tìm hiểu về con đường tổng hợp và phân hủy tinh bột ở cây trồng nói chung và đối với sắn nói riêng sẽ góp phần thúc đẩy mục tiêu cải tạo hàm lượng tinh bột. Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và chuyển gen tạo cây sắn có hàm lượng tinh bột cao, phù hợp với mục đích sử dụng phục vụ cho công nghiệp và xuất khẩu là một vấn đề cấp thiết ở nước ta. Ngoài ra, các hướng nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử và di truyền học ở cây sắn chưa được quan tâm và phát triển nhiều. Đặc biệt, chưa có những nghiên 2 cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ các giống sắn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn bằng công nghệ gen. Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đề xuất nhiệm vụ nghiên cứu “Đánh giá hoa ̣t đô ̣ng của mô ̣t số gen liên quan đến tổ ng hơ ̣p, tích lũy tinh bô ̣t và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Bước đầu đã chuyển được gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới sự điều khiển của promotor đặc hiệu C54 vào giống sắn KM140 nhờ A.tumefaciens thông qua FEC. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột. Nội dung 2: Phân lập gen SSIV liên quan đế n khả năng tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t, thiết kế vector chuyển gen. Nội dung 3: Đánh giá khả năng tổng hợp tinh bô ̣t của gen SSIV trên cây thuốc lá mô hình. Nội dung 4: Chuyể n gen SSIV vào cây sắ n. 4. Những đóng góp mới của luận án + Đã phân lập và đánh giá được hoạt động của gen SSIV liên quan đến quá khả năng tổng hợp tinh bột từ lá và củ sắn. + Đã thu được những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pB121C54:SSIV-cmyc:NOST với mức độ tích lũy hàm lượng tinh bột cao hơn so với những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S từ 19,7 – 48,1% và cao hơn 15,6 – 65,7% so với cây đối chứng. + Đây là công trình đầu tiên chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới sự điều khiển promoter đặc hiệu ở củ C54 vào mô sẹo phôi hóa (FEC) của giống sắn KM140 thông qua A. tumefaciens. Kết quả bước đầu thu được 7 dòng sắn chuyển gen dương tính khi kiểm tra với PCR. 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này bao gồm các gen và hệ thống các vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp tinh bột, được phân lập từ các giống sắn quan trọng đã được đánh giá chỉ tiêu nông sinh học tại Việt Nam; cấu trúc vector mang gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector mang gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector chuyển gen và các quy trình đánh giá hoạt động gen chuyển ở mức độ sinh học phân tử. Hơn nữa, hoạt động của các cấu trúc vector chuyển gen SSIV có tăng khả năng tích lũy tinh bột còn được đánh giá, kiểm tra thông qua biến nạp vào cây mô hình thuốc lá, cây sắn giống KM140. Đây chính là tiền đề để phát triển các nghiên cứu ứng dụng tạo nên cây sắn chuyển gen mang tính trạng có lợi. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Đây là đề tài nghiên cứu đầu tiên áp dụng công nghệ gen, công nghệ sinh học hiện đại nhằm tạo giống sắn năng suất cao tại Việt Nam dựa trên cơ sở khảo sát, nghiên cứu hệ gen của chính các giống sắn thu thập tại Việt Nam. Do vậy, phạm vi ứng dụng của đề tài không chỉ ở chuyển gen tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột vào sắn mà còn có thể ứng dụng ở các cây lương thực dự trữ tinh bột khác như khoai tây, khoai lang. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY SẮN VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH BỘT Ở SẮN 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 1.1.1.1. Nguồn gốc Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách đây 5000 năm. Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela và khoảng 2000 năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong khi đó, những lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900 - 200 trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất lâu đời (Rogers, 1965). Ở Châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII, Việt Nam và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ XVIII. Tuy nhiên, đến thế kỷ XIX, nghề trồng sắn và tiêu thụ sắn mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ thuật chế biến ở Brazin bởi các nô lệ. Từ đó đến nay, diện tích, năng suất và sản lượng sắn ngày một tăng (Trần Ngọc Ngoạn, 2007). 1.1.1.2. Phân loại Chi Manihot bao gồm những cây có hoa, hạt kín, có hai lá mầm, họ thầu dầu. Vào năm 1651 Bauhin là người đầu tiên đã dùng danh từ Manihot để chỉ chi này khi ông mô tả một mẫu cây đã được một thày tu Pháp A. Thevet mang từ Brazin về, ông đặt tên loài là Manihot theveti. Có thể cho rằng loài cây đó hiện nay người ta gọi tên là Manihot esculenta Crantz (Rogers, 1965). Năm 1776, Crantz công bố sự mô tả loài với tên Manihot esculenta, căn cứ 5 vào một mẫu cây Merian mang về từ Surinam năm 1726. Sau đó nhiều tác giả đã nghiên cứu về chi Manihot với các cách phân nhóm khác nhau. Đến năm 1938, Cifferi trở lại cách gọi tên của Crantz, ông dùng lại tên loài M.esculenta và không còn phân biệt giữa sắn đắng và sắn ngọt, ông cung cấp một quan niệm về các giống trồng phổ biến (cultivar). Bảng phân loại cuối cùng của Rogers và Appan (1973) là kết quả của một công trình nghiên cứu rất đầy đủ về chi Manihot, tiến hành trong 20 năm với phương pháp phân loại số lượng. 1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái * Thân cây Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1 - 3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng. Thân sắn có khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây. Thân và cành già đã hoá gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số lượng thân phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom. Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bì rất mỏng. Khi nhân vô tính sắn người ta sử dụng các đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh, phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom không bị mất nước (Tribadi và cs., 2010; Ceballos & Cruz, 2012). * Lá sắn Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá. Cuống lá dài từ 3 - 30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tuỳ theo giống (màu vàng, xanh vàng, hồng, đỏ tươi). Phiến lá thường chia 5 - 7 thuỳ nhưng cũng có khi không chia thuỳ. Lá của cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chí thuỳ không đều. Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thuỳ của phiến lá thường giảm. Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô dậu, tầng mô hổng và biểu bì. Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng 30 µm và có khoảng 700 lỗ/mm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Tribadi và cs., 2010). 6 Hình 1.1: Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz) (Nguồ n: Liu và cs., 2011) Chú thích: A. Cây sắn khi trồng ở ruộng; B. Củ sắn khi thu hoạch; C. Cụm hoa; D. Quả sắn; E. Hạt sắn; F. Cây con nảy mầm từ hạt; G. Thân sắn dùng để trồng cây. * Hoa sắn Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ phân cành, ngọn thân. Một số giống sắn không có hoa do không có sự phân hoá hoa hoặc do mầm hoa rụng đi. Những cụm hoa sinh ra từ những cành thấp thường rụng sớm. Cụm hoa gồm một trục dài 2 - 10 cm và các trục bên hợp lại thành chuỳ (Trần Ngọc Ngoạn, 2007). Hoa cái có năm lá đài và có màu sắc sặc sỡ, ngoài rìa có lông. Giữa hoa cái có một bầu hoa 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài. Trên bầu có 3 vòi nhuỵ ngắn với đầu nhuỵ uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn ở bên trong và có lông ở phía ngoài. Có khoảng 8 - 10 nhị đực xếp thành hai vòng và mọc lên từ các thuỳ của mỗi đĩa phía dưới. Bao phấm mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày dính, màng ngoài hạt phấn có gai nhỏ (Ceballos and Cruz, 2012). Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây. Hoa 7 đực thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào cuối buổi chiều. Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn trước khi hoa nở 1 giờ, sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn trong khoảng 30 cm. Tuổi thọ của hạt phấn là 1 tuần còn thời gian tiếp nhận hạt phấn của đầu nhuỵ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang màu nâu, khô đi và rụng chậm nhất sau 1 ngày. Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ tinh kéo dài từ 8 19 giờ (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos and Cruz, 2012). * Quả và hạt Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1 - 1,5 cm. Quả có 3 ngăn được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa 1 hạt. Màu sắc quả thường biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng dến lục hay đỏ tía. Cuống quả phình lên ở chỗ tiếp xúc với quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả. Hạt sắn hình trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu đỏ nâu trên nền kem hoặc xám nhạt (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos & Cruz, 2012). * Rễ sắn Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại làm giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ mọc thẳng cắm xuống đất sau đó các rễ phụ mọc ra, cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ. Rễ mọc ra từ hom đầu tiên thì mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất, rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hoá và dự trữ. Rễ đồng hoá thường cắm sâu trong lòng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây vững chắc. Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành. Khi cây mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ có một số rễ con được tập trung dinh dưỡng phát triển thành củ. Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể có hoặc không có cuống củ (Ceballos & Cruz, 2012). 1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái Cây Sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới (Allem., 2002). Sắn được phân bố phổ biến từ 33 o vĩ Bắc đến 33o vĩ Nam.