Tài liệu đánh giá hiệu lực của vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp h5 nhị giá chủng re 6 + re 8 sử dụng ở gà, vịt chống lại virus cúm

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ ĐÔNG ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN CÚM VÔ HOẠT TÁI TỔ HỢP H5 NHỊ GIÁ CHỦNG RE-6 + RE-8 SỬ DỤNG Ở GÀ, VỊT CHỐNG LẠI VIRUS CÚM A/H5N6 PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM NĂM 2016 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Lan TS. Tô Long Thành NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: - Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. - Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. - Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thị Đông i LỜI CẢM ƠN Trong suốt 2 năm học tập và hoàn thành luận văn, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo, Ban Chủ nhiệm Khoa Thú y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương, các thầy cô giáo khoa Thú y đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Tô Long Thành và PGS.TS. Nguyễn Thị Lan. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân cùng bạn bè và đồng nghiệp đã động viên giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài. Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập. Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thị Đông ii MỤC LỤC Lời cam đoan ................................................................................................................ i Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii Mục lục ....................................................................................................................... iii Danh mục từ viết tắt ..................................................................................................... v Danh mục bảng ........................................................................................................... vi Danh mục hình ........................................................................................................... vii Trích yếu luận văn ..................................................................................................... viii Thesis abstract............................................................................................................... x Phần 1: Mở đầu ......................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu đề tài ................................................................................................. 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài................................................................. 2 Phần 2: Tổng quan tài liệu ......................................................................................... 3 2.1 Sơ lược về bệnh cúm gia cầm ........................................................................... 3 2.1.1 Khái niệm về bệnh cúm gia cầm....................................................................... 3 2.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm ................................................................................ 3 2.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới ......................................................... 4 2.1.4 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam .................................................. 6 2.1.5 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm........................................................................ 10 2.1.6 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm ...................................................... 10 2.1.7. Miễn dịch chống bệnh của gia cầm................................................................... 11 2.1.8 Phương pháp chẩn đoán cúm gia cầm............................................................. 16 2.2 Virus cúm gia cầm ......................................................................................... 16 2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm type A ......................................... 17 2.2.2 Đặc tính kháng nguyên của virus cúm ............................................................ 19 2.2.3 Độc lực virus ................................................................................................. 20 2.2.4 Sức đề kháng của virus................................................................................... 20 2.2.5 Sự tiến hóa của virus cúm .............................................................................. 21 2.3 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm gia cầm .................................................. 24 2.3.1 Các loại vacxin được dùng hiện nay ............................................................... 24 iii 2.3.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới ....................................... 24 2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Việt Nam ..................................... 25 Phần 3: Nội dung và phương pháp nghiên cứu ....................................................... 27 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 27 3.1.1 Thời gian nghiên cứu ..................................................................................... 27 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 27 3.2 Nguyên liệu, đối tượng dùng trong nghiên cứu ............................................... 27 3.2.1 Đối tượng, vật liệu ......................................................................................... 27 3.2.2 Các loại dung dịch, môi trường ...................................................................... 27 3.3 Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm ............................. 27 3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 28 3.4.1 Nội dung ........................................................................................................ 28 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 28 3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu. ............................................................................. 35 Phần 4: Kết quả và thảo luận................................................................................... 36 4.1. Tình hình dịch cúm gia cầm trong những năm gần đây .................................... 36 4.1.1. Nguyên nhân dịch tại Việt Nam ..................................................................... 36 4.2.1 Phân bố các chủng virus cúm gia cầm ............................................................ 39 4.2.2 Lưu hành virus ............................................................................................... 40 4.3 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của vacxin tiêm cho đàn gà, vịt thí nghiệm ........... 41 4.3.1 Hiệu giá kháng thể của gà khi được tiêm vacxin Re-6 + Re-8 ......................... 41 4.3.2 Hiệu giá kháng thể của vịt khi được tiêm vacxin Re-6 + Re-8 ........................ 44 4.4. Kết quả theo dõi lâm sàng sau khi công cường độc......................................... 47 4.4.1 Kết quả theo dõi lâm sàng .............................................................................. 47 4.4.2 Kết quả xét nghiệm virus bài thải cơ, các cơ quan nội tạng, não. .......................... 58 4.4.4 So sánh hiệu giá kháng thể trung bình và tỷ lệ bảo hộ lâm sàng giữa gà và vịt khi sử dụng vacxin Cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 .......................................................................................................... 62 Phần 5: Kết luận và kiến nghị .................................................................................. 65 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 65 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 66 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 67 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ADN or DNA (Acid Deoxyribo Nucleic) : Axit deoxyribonucleic AI (Avian influenza) : Bệnh CGC ARN or RNA (Acid Ribonucleic) : Axit ribonucleic ATSH : An toàn sinh học Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn CEF (Chicken Embryo Fibroblast) : Tế bào sơ phôi gà CT (Cycle threshold ) : Giá trị ngưỡng vòng của phản ứng ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent assay) : Xét nghiệm miễn dịch gắn men FAO (Food and Agriculture Organnization) : Tổ chức Nông Lương thế giới GMT (Geometric Mean Titre) : Hiệu giá Trung bình lượng giác HA (Haemagglutination assay) : Phản ứng ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutination inhibition) : Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI (Highly pathogenic avian influenza) : Cúm gia cầm thể độc lực cao LPAI (Low pathogenic avian influenza) : Cúm gia cầm thể độc lực thấp MDCK cell (Madin-Darby Cannie Kidney cell) : Tế bào thận chó OIE (Office Internationale des Epizooties) : Tổ chức Thú y thế giới PBS (Phosphate-Buffered Saline) : Dung dịch đệm phôt phát rRT-PCR (Reverse Trancription Polymerase Chain Reaction) : Phản ứng chuỗi polyme phiên mã ngược theo thời gian thực TCID50 (Tissue Culture Infective Dosage) : Liều gây nhiễm 50% tế bào TW : Trung ương WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế thế giới v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin .................................................. 29 Bảng 4.1. Tình hình dịch cúm gia cầm từ năm 2014 - 2016 ........................................ 37 Bảng 4.2. So sánh tình hình cúm gia cầm năm từ 2015 đến 2016 ................................ 38 Bảng 4.3. Phân bố mức hiệu giá kháng thể trong nhóm gà tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1......................................................... 42 Bảng 4.4. Phân bố mức hiệu giá kháng thể trong nhóm gà tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4......................................................... 43 Bảng 4.5. Phân bố mức hiệu giá kháng thể trong nhóm vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 .............................................. 44 Bảng 4.6. Phân bố mức hiệu giá kháng thể trong nhóm vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4......................................................... 45 Bảng 4.7. Kết quả theo dõi lâm sàng đàn gà thí nghiệm sau khi công cường độc với H5N6 clade 2.3.4.4 ............................................................................. 49 Bảng 4.8 Kết quả theo dõi lâm sàng đàn vịt thí nghiệm sau khi công cường độc với H5N6 clade 2.3.4.4 ............................................................................. 51 Bảng 4.9 .Kết quả phát hiện virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4 trên gà ......................... 54 Bảng 4.10 .Kết quả phát hiện virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4 trên vịt ....................... 56 Bảng 4.11. Kết quả mổ khám trên gà .......................................................................... 58 Bảng 4.12. Kết quả mổ khám trên vịt.......................................................................... 60 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc virus cúm type A.................................................................. 17 Hình 2.2. Sự tiến hóa của các clade virus H5N1 theo thời gian ................................... 21 Hình 2.3. Gia hệ virus cúm gia cầm năm 2015 - 2016 ................................................. 23 Hình 4.1. Biểu đồ so sánh diện tích cúm gia cầm ........................................................ 37 Hình 4.2. Phân bố dịch cúm gia cầm........................................................................... 40 Hình 4.3. Mức phân bố hiệu giá kháng thể ở gà với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1....................................................................................................... 42 Hình 4.4. Mức phân bố hiệu giá kháng thể ở gà với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4....................................................................................................... 43 Hình 4.5. So sánh hiệu giá kháng thể trên gà .............................................................. 44 Hình 4.6. Mức hiệu giá kháng thể trong nhóm vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 ............................................................ 45 Hình 4.7. Phân bố mức hiệu giá kháng thể trong nhóm vịt tiêm vacxin Re-6 + Re8 với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4.................................................... 46 Hình 4.8. So sánh hiệu giá kháng thể trên vịt .............................................................. 46 Hình 4.9. Tỉ lệ sống sót của gà sau công cường độc .................................................... 50 Hình 4.10. Tỉ lệ sống sót của vịt sau công cường độc.................................................. 52 Hình 4.11. Mức độ bài thải virus ở nhóm gà ............................................................... 54 Hình 4.12. Mức độ bài thải virus ở nhóm vịt............................................................... 57 Hình 4.13. So sánh hiệu giá kháng thể trung bình và tỉ lệ bảo hộ giữa gà và vịt.......... 62 Hình 4.14. So sánh mức độ bài thải giữa gà và vịt ...................................................... 63 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Đông Tên luận văn: “Đánh giá hiệu lực vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 sử dụng ở gà, vịt chống lại virus cúm A/H5N6 phân lập tại Việt Nam năm 2016’’. Chuyên ngành : Thú y Mã số: 60.64.01.01 Cơ sở đào tạo: Học viện Nông Nghiệp Việt Nam 1. Mục đích nghiên cứu Đánh giá hiệu lực của vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 khi sử dụng ở gà, vịt để chống lại chủng virus cúm gia cầm cường độc H5N6 clade 2.3.4.4B (Lao-like). 2. Phương pháp nghiên cứu a. Hồi cứu về tình hình dịch cúm gia cầm tại Việt Nam từ 2014 đến nay b.Thí nghiệm công cường độc đánh giá hiệu lực vacxin Re-6 + Re-8 chống lại virus H5N6 clade 2.3.4.4 Gà, vịt được chọn từ đàn sạch bệnh, chưa được tiêm phòng vacxin CGC và không có kháng thể kháng kháng nguyên cúm H5. Gà, vịt được lấy máu trước khi tiêm vacxin (khoảng 30% tổng đàn) để kiểm tra kháng thể kháng cúm gia cầm bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1. Bố trí tiêm vacxin cho gà như sau: Tổng số 50 gà được chia thành lô Vacxin (30 con) và lô Đối chứng (20 con). Tiêm vacxin cho 30 gà lô Vacxin với liệu trình 1 mũi lúc 03 tuần tuổi với liều 0,3ml/con. Gà thuộc lô Đối chứng không được tiêm. Bố trí tiêm vacxin cho vịt như sau: Tổng số 50 vịt được con chia thành lô Vacxin (30 con) và lô Đối chứng (20 con). Tiêm vacxin cho 30 vịt lô Vacxin với liệu trình 1 mũi lúc 3 tuần tuổi với liều 0,3 ml/con và nhắc lại lúc 6 tuần tuổi với liều 0,5ml/con. Vịt thuộc lô Đối chứng không được tiêm Ba tuần sau khi tiêm vacxin, gà và vịt được lấy máu và đánh giá hiệu giá kháng thể bằng phương pháp HI với các kháng nguyên tương đồng với chủng vacxin. Công cường độc vào lúc 6 tuần tuổi đối với gà và 9 tuần tuổi đối với vịt, tức là 03 tuần sau khi hoàn tất liệu trình vacxin, liều 106TCID50/100µl/con. Theo dõi lâm sàng trong 10 ngày sau khi gây nhiễm, lấy mẫu swab họng vào ngày thứ 3 và thứ 10 hoặc khi gia cầm chết để định lượng virus bài thải bằng phương pháp rRT-PCR. Đối với gà chết, vịt mổ khám để đánh giá bệnh tích đại thể. viii 3. Kết quả chính - Tình hình dịch bệnh cúm trên đàn gia cầm Việt Nam từ năm 2014 đến nay. - Sự phân bố và lưu hành các chủng virus cúm gia cầm trên địa bàn cả nước. - Đánh giá đáp ứng miễn dịch ở gia cầm được tiêm vacxin - Đánh giá mức độ bảo hộ lâm sàng của vacxin đối với gia cầm được tiêm phòng khi thử thách cường độc với virus H5N6 clade 2.3.4.4B - Đánh giá tác dụng làm giảm bài thải virus ở gia cầm được tiêm phòng 4. Kết luận Từ các nghiên cứu cho thấy: bệnh cúm gia cầm diễn biến phức tạp, xảy ra liên tục ở nước ta từ năm 2014 đến nay, đặc biệt có xuất hiện chủng virus H5N6 mới. Virus cúm H5N1 clade 2.3.2.1c chủ yếu lưu hành ở các tỉnh phía Nam. Các virus H5N6 thuộc về clade 2.3.4.4 và phân thành 2 nhánh phụ là 2.3.4.4A (dòng Trung Quốc) và 2.3.4.4B (dòng Lào) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh Phía Bắc và Bắc Trung bộ. Thử nghiệm hiệu lực vacin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re8 cho thấy: Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) của gà tiêm vacxin Re-6 + Re-8 là 5,2 log2 với kháng nguyên 2.3.2.1 và đạt 3,7 log2với kháng nguyên 2.3.4.4; của vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 là 7,2 log2 với kháng nguyên 2.3.2.1 và đạt 4,3 log2với kháng nguyên 2.3.4. Tỉ lệ bảo hộ lâm sàng của vacxin Re-6 + Re-8 đối với gà và vịt đều đạt mức 90%, gà đối chứng không tiêm vacxin tỷ lệ chết 100% sau 5 ngày, vịt đối chứng tỷ lệ chết 40% sau 10 ngày theo dõi. Đến thời điểm 10 ngày sau công cường độc, gà và vịt thuộc lô vacxin hầu như không bài thải virus hoặc bài thải rất ít (gà 39,95, vịt 40). Vì vậy, có thể sử dụng vacxin Re-6 + Re-8 để phòng bệnh cúm gia cầm do virus Lao- like A/H5N6 2.3.4.4 gây ra. ix THESIS ABSTRACT Author: Tran Thi Dong Thesis title: "Evaluation of effectiveness of Reassortant AIV H5 subtype vaccine, strain Re-6 + strain Re-8 used in chickens and ducks against a virulent strain of HPAI H5N6 isolated in Vietnam in 2016 ''. Major: Animal Health Code: 60.64.01.01 Training institutions: Vietnam National University of Agriculture 1. Purpose of the study Evaluate the effectiveness of Reassortant AIV H5 subtype vaccine, strain Re-6 + strain Re-8 used in chickens and ducks against a virulent strain of HPAI H5N6 clade 2.3.4.4B (Lao-like). 2. Research Methodology a. Review of avian influenza endemic in Vietnam from 2014 to the present b. Evaluation of Re-6 + Re-8 vaccine in the challenge experiment using H5N6 clade 2.3.4.4B virus strain Chickens and ducks are chosen from healthy, non-vaccinated and H5 antibody negative flocks. Poultry blood samples are collected before vaccination (about 30%) to test for antibody against H5N1 antigen by HI method. Vaccine schedule for chickens as follows: A total of 50 chickens were divided into Vaccine (30 heads) and Control (20 heads) groups. Give vaccine to 30 chickens of Vaccine group with a dose of 0.3 ml at 3 week-old. Control group are not vaccinated. Vaccine schedule for ducks as follows: A total of 50 ducks were divided into Vaccine (30 heads) and Control (20 heads) groups. Give vaccine to 30 ducks of Vaccine group with a dose of 0.3 ml at 3 week-old and repeat with a dose of 0.5 ml at 6 weekold. Control group are not vaccinated. Three weeks after vaccination, poultry blood samples are collected and tested for antibody titer by HI method using homologous antigens with vaccine strains. Chickens (6 week-old) and ducks (9 week-old) are challenge with H6N5 clade 2.3.4.4B virus strain with the dose of 106 TCID50/ 100 ul/ head. Clinical monitoring are carried out in 10 days after inoculation. Oro-pharyngeal swab samples are collected at day 3 and 10, or day of death to quantify excreeted viruses by rRT-PCR method. Dead poultry are autopsied for necropsy exams. x 3. Main results - Avian influenza endemic in Vietnam from 2014 to the present. - The distribution and circulation of the avian influenza virus strains in the whole country. - Evaluation of the immune respond against H5 in vaccinated poultry. - Evaluation of protective rate of vaccinated poultry in challenge experiment using H5N6 clade 2.3.4.4B virus strain - Evaluation of the efficacy in reducing amount of excreted virus between vaccinated and non-vaccinated poultry. 4. Conclusion Review of avian influenza endemic in Vietnam showed that: HPAI endemic countinues orcuring complicatedly, repeatedly and locally in Vietnam from 2014, especially with the appearance of new H5N6 virus strain. In the south area, H5N1 clade 2.3.2.1C kept circulating. In the north and north-mid of country, new H5N6 virus strains introduced and circulated with 2 devided groups such as 2.3.4.4A (China-like) and 2.3.4.4B (Lao-like). Evaluation of Re-6 + Re-8 vaccine experiment showed that: The geometric mean antibody titer (GMT) of vaccinated chickens were 5.2 log2 with H5N1 clade 2.3.2.1 HI antigen and 3.7 log2 with H5N6 clade 2.3.4.4 HI antigen. In vaccinated ducks, GMT were 7.2 log2 with H5N1 clade 2.3.2.1 HI antigen and 4.3 log2 with H5N6 clade 2.3.4.4 HI antigen. In challenge experiment using HPAI H5N6 clade 2.3.4.4B, the protective percentage was 90% with both vaccinated chickens and ducks in comparison with 100% chicken controls died within 5 dpi and 40% duck controls died within 10 dpi. Survived vaccinated chickens and ducks excreted mostly no virus. The conclusion was there is possible to use that vaccine in preventing HPAI caused by H5N6 clade 2.3.4.4B (Lao-like) virus. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi gia cầm giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế Nông nghiệp Việt Nam. Những năm gần đây, chăn nuôi là một trong những ngành có bước phát triển mạnh, ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế, xoá đói giảm nghèo và làm giàu trong nông thôn. Tuy nhiên, ô nhiễm môi trường và biến đổi khí hậu đã và đang dẫn đến sự gia tăng và diễn biến phức tạp của dịch bệnh. Những năm gần đây, rất nhiều dịch bệnh mới nổi và tái nổi giữa người và động vật khiến cộng đồng phải lo lắng. Trong những dịch bệnh đó phải kể đến bệnh CGC. CGC là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm khi bị nhiễm bệnh. Bệnh xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, gây thiệt hại về kinh tế và có ảnh hưởng lớn đến tình hình chính trị xã hội. Năm 2003, bệnh CGC type A/H5N1 lần đầu tiên xuất hiện tại Việt Nam với khả năng lây lan nhanh, tỷ lệ chết cao và đặc biệt là lây từ gia cầm sang người. Trong 5 năm gần đây dịch bệnh đã gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gà, đặc biệt xảy ra nhiều ở quy mô chăn nuôi nhỏ lẻ, chưa được tiêm phòng. Người ta còn lo ngại về sự biến chủng của virus này. Mới đây, năm 2014 tại Việt Nam đã phát hiện chủng virus CGC type A/H5N6 tại một số tỉnh như Lạng Sơn, Hà Tĩnh, Lào Cai, Quảng Trị, Quảng Ngãi, Bắc Giang, Phú Thọ, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam. Cho đến nay tại Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp mắc H5N6 trên người, nhưng mức độ nguy hiểm của H5N6 trên đàn gia cầm là rất lớn. Trước tình hình trên, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn có Chỉ thị số 9897/CT-BNN-TY ngày 9/12/2014 về tăng cường các biện pháp phòng, chống dịch bệnh gia súc, gia cầm, cảnh báo trong thời gian tới do thời tiết thay đổi chuyển lạnh, việc buôn bán, vận chuyển, giết mổ gia cầm tăng cao là điều kiện thuận lợi cho virus CGC có thể xuất hiện, lây lan và gây thành dịch lớn. Theo quan điểm của OIE, FAO, WHO, tiêm phòng cho đàn gia cầm có thể được coi như một giải pháp, một công cụ hỗ trợ tích cực để ngăn chặn, khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm ở những vùng có bệnh (OIE, 1992). Trên cở sở đó, từ cuối năm 2005, Việt Nam đã tiến hành tiêm phòng vacxin cúm cho đàn gia 1 cầm và thu được những kết quả tích cực trong phòng chống bệnh cúm gia cầm. Câu hỏi đặt ra là liệu những loại vacxin hiện đang sử dụng tại Việt Nam có thể phòng loại virus cúm H5N6 mới này hay không. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của gia cầm đối với vacxin cúm và khảo sát khả năng bảo hộ của vacxin là một yêu cầu quan trọng nhằm tìm hiểu hiệu quả sử dụng vacxin, từ đó có thể giúp các nhà quản lý đưa ra những chiến lược phòng chống bệnh phù hợp. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá hiệu lực vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 sử dụng ở gà, vịt chống lại virus cúm A/H5N6 phân lập tại Việt Nam năm 2016’’. 1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Đánh giá hiệu lực của vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 khi sử dụng ở gà, vịt để chống lại chủng virus cúm gia cầm cường độc H5N6 clade 2.3.4.4B (Lao-like). 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ĐỀ TÀI - Hiểu biết rõ hơn về bệnh CGC, về virus CGC, đặc biệt là chủng virus cúm Lao- like A/H5N6 2.3.4.4B - Các kết quả thu được là cơ sở đánh giá hiệu quả sử dụng vacxin hiện hành trong phòng bệnh CGC do chủng virus cúm mới xuất hiện. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. SƠ LƯỢC VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM 2.1.1. Khái niệm về bệnh cúm gia cầm Bệnh cúm ở gia cầm (CGC) (Avian Influenza) còn gọi là bệnh cúm gà hay cúm của loài chim. Đây là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae. Đây là những retrovirus, mang vật liệu di truyền là những đoạn phân tử RNA, sợi đối mã (sợi âm tính). Virus CGC gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, gà tây, chim cút, đà điểu, các loài chim cảnh và chim hoang dã. Nguy hiểm hơn, bệnh có thể lây sang người và một số loài thú khác. Trước đây, bệnh này còn được gọi là bệnh dịch hạch gà (fowl plague) nhưng từ Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh CGC tại Beltsville - Mỹ năm 1981, bệnh đã được thay thế với tên gọi là bệnh CGC độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Inluenza - HPAI) để chỉ các virus cúm type A có độc lực mạnh, gây lây lan nhanh, tỷ lệ tử vong cao. Bệnh CGC HPAI là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc độ lây lan rất nhanh với tỉ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh. Virus gây bệnh CGC chủ yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, đà điểu, các loại chim. Virus còn gây bệnh cho cả người và có thể thành đại dịch, vì thế bệnh CGC đang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết (Lê Văn Năm, 2004; Cục Thú y, 2005). 2.1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm Năm 412 trước công nguyên, Hippocrate đã mô tả về bệnh cúm. Năm 1680 một vụ đại dịch cúm đã được mô tả kỹ và từ đó đến nay đã xảy ra 31 vụ đại dịch. Trong hơn 100 năm qua đã xảy ra 4 vụ đại dịch cúm vào các năm 1889, 1918, 1957, 1968 (Cục Thú y, 2004). Đến năm 1901, virus bệnh nguyên được Centany và Savonuzzi xác định là một tác nhân virus qua lọc. Nhưng phải đến năm 1955, người ta mới xác định được virus đó chính là virus cúm type A (H7N1 và H7N7) gây chết nhiều gà, gà tây và các loài khác. Từ sau khi phát hiện ra virus cúm type A, các nhà khoa học đã tăng cường nghiên cứu và thấy virus cúm còn có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi 3 ở những vùng khác nhau trên thế giới và bệnh dịch nghiêm trọng nhất xảy ra đối với gia cầm là những chủng gây bệnh độc lực cao thuộc subtype H5 và H7, như ở Scotland năm 1959 là A/H5N1 (Franklin and Wecker, 1950). Năm 1963, virus cúm type A được phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú xâm nhập vào đàn gà.. Những nghiên cứu về subtype H1N1 đều cho rằng virus cúm type A đã có ở lợn và truyền lây cho gà tây. Ngoài ra, virus cúm subtype H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004;Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004;Trương Văn Dung, 2008). Năm 1971, Beard đã mô tả khá kỹ virus gây bệnh và đặc điểm bệnh lý lâm sàng của gà trong các ổ dịch cúm gà, gà tây khá lớn xảy ra ở Mỹ mà chủng gây bệnh là H7N1. Từ năm 1960 - 1979 bệnh được phát hiện ở Canada, Mehico, Achentina, Braxin, Nam Phi, ý, Pháp, Anh, Hà Lan, Australia, Hồng Kông, Nhật Bản, các nước vùng Trung Cận Đông, các nước thuộc liên hiệp Anh và Liên Xô. Các công trình nghiên cứu có hệ thống về bệnh CGC lần lượt được công bố ở Australia (1975), ở Anh (1979), ở Mỹ (1983-1984), ở Ailen (1983-1984) về đặc điểm sinh học, bệnh học và dịch tễ học, các phương pháp chẩn đoán miễn dịch và biện pháp phòng chống bệnh (Đào Yến Khanh, 2005). 2.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới Virus CGC phân bố khắp toàn cầu, vì vậy dịch bệnh đã xảy ra ở nhiều nước trên thế giới.Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 và có thể là biến chủng H5N1 đầu tiên trên thế giới (Wu et al., 2008). Năm 1977 ở Minesota đã phát hiện dịch ở gà tây do chủng H7N7. Năm 1983 - 1984 ở Mỹ, dịch cúm gà xảy ra do chủng virus H5N2 ở 3 bang Pensylvania, Virginia, Newtersey làm chết và tiêu huỷ hơn 19 triệu gà (Phạm Sỹ Lăng, 2004). Cũng trong thời gian này tại Ireland người ta đã phải tiêu huỷ 270 nghìn con vịt tuy không có triệu chứng lâm sàng nhưng đã phân lập được virus cúm chủng độc lực cao (HPAI) để loại trừ bệnh một cách hiệu quả, nhanh chóng. Năm 1986 ở Australia dịch cúm gà xảy ra tại bang Victoria do chủng H5N2 gây nên. Năm 1997 ở Hồng Kông dịch cúm gà xảy ra do virus cúm type A subtype H5N1. Toàn bộ đàn gia cầm của lãnh thổ này đã bị tiêu diệt vì đã gây tử vong cho con người (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004). Như vậy đây là lần đầu tiên virus CGC đã vượt “rào cản về loài” để lây cho người ở Hồng Kông làm cho 4 18 người nhiễm bệnh, trong đó có 6 người chết (Nguyễn Hoài Tao và Nguyễn Tuấn Anh, 2004). Năm 2003 ở Hà Lan dịch CGC đã xảy ra với quy mô lớn do chủng H7N7, 30 triệu gia cầm bị tiêu hủy, 83 người lây nhiễm và 1 người chết, gây thiệt hại về kinh tế hết sức nghiêm trọng (Phạm Sỹ Lăng, 2004). Cuối năm 2003 đầu năm 2004 đã có 11 quốc gia ở Châu Á là: Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Indonesia, Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Việt Nam và Pakistan đã thông báo bùng phát dịch CGC thể độc lực cao ở gà và vịt. Sự lây lan nhanh chóng dịch CGC xảy ra đồng thời ở một số nước đã trở thành mối quan tâm lớn trên toàn cầu (Tô Long Thành, 2004). Ngoài các ổ dịch do virus cúm H5N1 nêu trên, còn có 7 nước và vùng lãnh thổ khác có các ổ dịch CGC do các chủng khác là Pakistan (H7N3 và H9N2), Canada (H7N3), Mỹ (H7N2), Nam Phi (H6 và H5N2), Ai Cập (H10N7) và Triều Tiên (H7) (Tô Long Thành, 2007). Năm 2007, có 30 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới báo cáo xuất hiện dịch CGC do virus H5N1, đặc biệt là tại Indonesia, dịch CGC dây dưa kéo dài, tại một số quốc gia Châu Phi - nơi được cho là virus CGC có nguy cơ biến đổi cũng đã phát dịch. Các nước khác trong khu vực như: Lào, Campuchia, Myanma, Malaysia, Trung Quốc, Thái Lan cũng đã tái phát dịch. Các quốc gia có ngành chăn nuôi tiên tiến như: Hàn Quốc, Nhật Bản và một số quốc gia ở Châu Âu như: Nga, Hung-ga-ri, Ru-ma-ni, Anh,... cũng ghi nhận có các ổ dịch trên gia cầm. Năm 2008: Dịch CGC phát ra tại 28 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Bangladesh, Benin, Cămpuchia, Canada, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ai Cập, Đức. Đặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn Độ, Israel, Iran, Nhật Bản, Lào, Myanma, Nigeria, Pakistan, Ba Lan, Ru-ma-ni, Nga, Ả - rập Xê-út, Thụy Sĩ, Thái Lan, Togo, Thổ Nhĩ Kỳ, Ukraine, Vương quốc Anh và Việt Nam. Năm 2009: Dịch CGC phát ra tại 17 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Afghanistan, Bangladesh, Cămpuchia, Trung Quốc, Đức, Đặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn Độ, Nhật Bản, Lào, Mông Cổ, Nepal, Nigeria, Nga, Tây Ban Nha, Thái Lan, Togo và Việt Nam. Riêng tại Trung Quốc đã có 7 ca nhiễm virus cúm ở người. Năm 2010: Tám tháng đầu năm 2010 dịch CGC phát ra tại 16 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Bangladesh, Bhutan, Bun-ga-ri, Campuchia, Trung Quốc, đặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn Độ, Israel, Lào, Mông Cổ, Myanma, Nepal, Ru-ma-ni, Nga, Tây Ban Nha và Việt Nam. 5 Tính đến tháng 4/2012 đã có tổng số 55 nước, vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm làm 250 triệu gia cầm chết hoặc bị tiêu huỷ bắt buộc. Đợt dịch CGC năm 2016 nổ ra đầu tiên ở Nigeria từ đầu tháng 3 vừa rồi và đến nay, đã có thêm các quốc gia khác cũng khai báo dịch là Đài Loan, Trung Quốc và Pháp. Trong năm 2016, dịch CGC đã xảy ra ở nhiều nước trên thế giới, cụ thể: Cúm A/H5N1 tại Lào, Lebanon, Bangladesh, Burkini Faso, Cam-pu-chia, Myan-ma, Nigeria, Cameroon, Ghana, Ấn Độ, Pháp; Cúm A/H5N6 tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Hong Kong - Trung Quốc; Cúm A/H5N2 tại Pháp, Mỹ; Cúm A/H5N8 tại Hà Lan, Đức, Pháp, Áo, Ca-na-da, Ba Lan, Ro-ma-ni-a, Croatia, Đan Mạch, Thụy Điển, Hung-ga-ry, Thụy Sĩ, Hy Lạp, Phần Lan, Ấn Độ, I-ran, Israel, Hàn Quốc, Nga; Cúm A/H5N9 tại Pháp; Cúm A/H7N8 tại Mỹ; Cúm A/H7N3 tại Mehi-co; Cúm A/H7N7 tại I-ta-ly. Riêng Trung Quốc đã phát hiện được một số chủng virus cúm như A/H5N1, A/H5N2, A/H5N6, A/H5N8, A/H5N3. Theo thống kê số người bị nhiễm CGC H5N1 của các nước báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO) từ tháng 12/2003 đến 01/2014, đã có tới 649 trường hợp mắc cúm H5N1, trong số đó 385 trường hợp đã tử vong chiếm tới 59%. Indonesia, Việt Nam và Ai Cập là 3 nước có số người tử vong và nhiễm cao nhất do virus cúm H5N1 trên thế giới, và đang được Tổ chức Y tế Thế giớiWHO xác định là quốc gia “điểm nóng” có thể xảy ra dịch cúm mới ở người trong tương lai cần được quan tâm ngăn chặn, do virus cúm H5N1 có được các điều kiện thuận lợi để tiến hoá thích nghi và lây nhiễm trên người. Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới, trong năm 2016, phát hiện ca bệnh Cúm A/H5N1 tại Ai Cập với 8 người mắc bệnh, trong đó có 1 ca tử vong. Cho đến nay, virus cúm A/H7N9 mới chỉ được phát hiện trên người và gia cầm tại Trung Quốc. Năm 2016, Trung Quốc đã ghi nhận 33 ca bệnh Cúm A/H7N9 trên người, trong đó có 1 ca tử vong. 2.1.4. Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam Cuối năm 2003, dịch CGC lần đầu xuất hiện tại Việt Nam ở trại gà giống của Công ty C.P. (Thái Lan) xã Thuỷ Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây, khiến 100.000 gà bị tiêu hủy. Dịch đã nhanh chóng lay lan ra hầu hết các tỉnh trong cả nước. Để thuận lợi cho việc đánh giá về dịch tễ học có thể chia quá trình dịch từ khi xuất hiện vào cuối năm 2003 đến nay thành những đợt dịch sau: 6 * Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004: Cuối tháng 12 năm 2003, dịch CGC thể độc lực cao với tác nhân gây bệnh là virus CGC H5N1. Đây là lần đầu tiên bệnh xuất hiện tại Việt Nam và vì thế nó có thể được coi là một bệnh mới ở gia cầm. Đặc điểm của đợt dịch thứ nhất này là dịch lây lan một cách nhanh chóng với nhiều ổ bệnh xuất hiện cùng một lúc ở nhiều địa phương khác nhau đã gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi gia cầm. Ngay cả các trại gia cầm nằm ở những vùng không có dịch cũng gặp phải những khó khăn trong việc duy trì đàn gia cầm dẫn đến việc phải tiêu hủy. Chỉ trong vòng 2 tháng, đến ngày 27/02/2004 dịch đã xuất hiện ở 2.574 xã, phường (chiếm 24,6%) thuộc 381 huyện, quận, thị xã (chiếm 60%) của 57 tỉnh, thành phố trong cả nước. Tổng số gia cầm bị mắc bệnh, chết và tiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 16,8% tổng đàn, trong đó gà 30,4 triệu con, thủy cầm 13,5 triệu con. Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và bị tiêu huỷ. Theo thống kê cho đến cuối đợt dịch, đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long là những khu vực có tỷ lệ số xã có gia cầm bị mắc bệnh cao nhất (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004). * Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4/2004 đến 11/2004: Dịch CGC thể độc lực cao đã tái xuất hiện vào giữa tháng 4 năm 2004 ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh chủ yếu xuất hiện ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ và hầu như không có trại chăn nuôi qui mô lớn nào bị nhiễm bệnh. Dịch có khuynh hướng xuất hiện ở những vùng có chăn nuôi nhiều thủy cầm. Dịch đã xảy ra ở 46 xã phường của 32 quận, huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh. Thời gian cao điểm nhất là tháng 7 sau đó giảm dần, đến tháng 11 năm 2004 cả nước chỉ có 1 điểm phát dịch. Tổng số gia cầm bị tiêu hủy trong thời gian này là 84.078 con, trong đó có 55.999 gà, 8.132 vịt và 19.947 chim cút (Bùi Quang Anh và Văn Đăng Kỳ, 2004). * Đợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 đến 5/2005: Trong thời gian này dịch đã xuất hiện ở 670 xã của 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam). Dịch xuất hiện nhiều nhất vào tháng 1/2005 với 143 ổ dịch xảy ra trên 31 tỉnh thành phố, số gia cầm tiêu hủy là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan và 551.029 chim cút. Bệnh xuất hiện ở tất cả các tỉnh, thành phố thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long (Ban Chỉ đạo Quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm, 2005). * Đợt dịch thứ 4 từ ngày 06/12/2006 đến 07/3/2007: Sau gần 1 năm (từ ngày 15/12/2005 đến ngày 05/12/2006) khống chế thành công dịch CGC, ngày 7 06/12/2006 dịch CGC đã tái phát tại Cà Mau, Bạc liêu, sau đó dịch xuất hiện ở 6 tỉnh khác (Hậu Giang, Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, Kiên Giang và Sóc Trăng) thuộc đồng bằng sông Cửu Long và 3 tỉnh (Hà Nội, Hà Tây cũ và Hải Dương) thuộc đồng bằng Sông Hồng (Ninh Văn Hiểu, 2006). Đợt này, dịch đã xảy ra ở 83 xã, phường của 33 huyện, quận thuộc 11 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là hơn 100 ngàn con. Các ổ dịch xảy ra chủ yếu ở đàn vịt chăn nuôi nhỏ lẻ, dưới 3 tháng tuổi, ấp nở trái phép và chưa được tiêm phòng vacxin (HNCTY, 2008). * Đợt dịch thứ 5 từ ngày 01/5/2007 đến 23/8/2007: Dịch tái phát ở Nghệ An, sau đó dịch lây lan và được phát hiện tại 167 xã, phường của 70 huyện, quận, thuộc 23 tỉnh. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294,85 ngàn con (gà chiếm 7,31% và thuỷ cầm chiếm gần 93%). Sau hơn một tháng khống chế thành công dịch CGC trong phạm vi cả nước, từ ngày 1/10/2007 dịch đã tái phát tại 15 xã, phường của 9 huyện, thị thuộc 6 tỉnh. Tổng số gia cầm mắc bệnh chết và tiêu huỷ 7.488 con (1.024 gà, chiếm 13,71 % và 6.464 vịt chiếm 86,28%). Từ sau đợt dịch thứ 5, ở Việt Nam trở thành dịch lưu hành, các ổ dịch nhỏ, lẻ xuất hiện rải rác quanh năm. * Năm 2008: Dịch CGC đã xuất hiện tại 80 xã thuộc 54 huyện, quận, thị xã của 27 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm chết và buộc phải tiêu hủy là 106.508 con (gồm 40.525 con gà, 61.027 con vịt và 4.506 con ngan). Chỉ xuất hiện các điểm dịch ở những đàn gia cầm quy mô từ 100 - 2000 con, không được tiêm phòng vaccine (44,59%), hoặc đàn thuỷ cầm mới tiêm phòng một mũi (16,21%), ổ dịch trên thủy cầm chiếm 52,70%. Các ổ dịch xuất hiện thường được địa phương bao vây, xử lý ngay nên hầu như không có hiện tượng lây lan. * Năm 2009: Cả nước đã có 129 ổ dịch tại 71 xã, phường, thị trấn của 35 huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành phố phát dịch CGC là: Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, Điện Biên, Đồng Tháp, Hậu Giang, Khánh Hòa, Nghệ An, Ninh Bình, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Nguyên, Thanh Hóa, TP. Hà Nội, Vĩnh Long và Cao Bằng. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 105.601 con, trong đó gà 23.733 con (chiếm 22,51 %), vịt 79.138 con (chiếm 74,94 %) và ngan 2.690 con (chiếm 2,55 %) (Tống Xuân Độ, 2009). * Năm 2010: Dịch CGC đã xảy ra ở 56 xã, 33 huyện, quận thuộc 20 tỉnh, thành phố là Bắc Cạn, Bắc Ninh, Bến Tre, Cà Mau, Điện Biên, Đồng Tháp, Hà 8