Tài liệu đánh giá, chọn lọc một số dòng, giống lúa triển vọng kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử dna

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------------ ðẶNG CAO CƯỜNG ðÁNH GIÁ, CHỌN LỌC MỘT SỐ DÒNG, GIỐNG LÚA TRIỂN VỌNG KHÁNG BỆNH BẠC LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------------ ðẶNG CAO CƯỜNG ðÁNH GIÁ, CHỌN LỌC MỘT SỐ DÒNG, GIỐNG LÚA TRIỂN VỌNG KHÁNG BỆNH BẠC LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng Mã số: 60.62.05 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI - 2011 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và thông tin trích dẫn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2011 Tác giả ðặng Cao Cường Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Phan Hữu Tôn, người ñã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. ðồng thời, tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo và cán bộ, bộ môn Di truyền – Giống, bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, các thầy cô, cán bộ trong khoa Nông Học, Khoa Công Nghệ Sinh Học và Viện Sau ðại Học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia ñình, bạn bè ñã luôn ñộng viên, ủng hộ, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2011 Tác giả ðặng Cao Cường Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. ii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN.....................................................................................................................i LỜI CẢM ƠN...........................................................................................................................ii MỤC LỤC................................................................................................................................iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU......................................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG..................................................................................................vii DANH MỤC CÁC ðỒ THỊ...............................................................................................viii DANH MỤC CÁC HÌNH..............................................................................................vviiiii 1. MỞ ðẦU..............................................................................................................................1 1.1 ðặt vấn ñề.................................................................................................... 1 1.2 Mục ñích và yều cầu ................................................................................... 2 1.2.1 Mục ñích ................................................................................................................2 1.2.2 Yêu cầu ..................................................................................................................2 2. TỔNG QUAN VỀ VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU.............................................................4 2.1 Nghiên cứu bệnh bạc lá lúa......................................................................... 4 2.1.1 Lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh bạc lá.......................................................4 2.1.2 ðặc ñiểm triệu chứng của bệnh bạc lá lúa...........................................................5 2.1.3 ðặc ñiểm của vi khuẩn xanthomonas oryzea pv.oryzae.....................................7 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh và phát triển và phòng trừ bệnh............9 2.1.5 Các phương pháp ñánh giá tính kháng bạc lá....................................................11 2.2 Chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá nhờ chỉ thị phân tử............................ 12 2.2.1 Cơ chế kháng bệnh..............................................................................................12 2.2.2 Khả năng di truyền tính kháng bệnh bạc lá .......................................................15 2.2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá .................21 2.2.4 Các phương pháp chọn tạo giống kháng bạc lá.................................................27 2.3 Các vấn ñề cần giải quyết khi chọn tạo giống kháng bạc lá ..................... 30 2.3.1 Hai vấn ñề cần giải quyết với công tác chọn giống kháng bạc lá ....................30 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. iii 2.3.2 Xu hướng của chọn giống lúa kháng bạc lá .....................................................31 2.4 Các thành tựu ............................................................................................ 31 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................33 3.1 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 33 3.2 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 33 3.3 Thời gian, ñịa ñiểm và phương pháp bố trí thí nghiệm ............................ 35 3.3.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu......................................................................35 3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ñồng ruộng.......................................................35 3.3.3 ðiều kiện thí nghiệm ngoài ñồng ruộng ............................................................35 3.4 ðánh giá chất lượng .................................................................................. 36 3.4.1 ðánh giá một số chỉ tiêu chất lượng thương trường và xay xát .......................36 3.4.2 ðánh giá mùi thơm..............................................................................................37 3.4.3 ðánh giá hàm lượng amylose.............................................................................37 3.4.4 Một số chỉ tiêu chất lượng phân tích, chất lượng nấu nướng khác ..................38 3.5 ðánh giá khả năng kháng và kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá ...................................................................................................................... 38 3.5.1 Lây nhiễm nhân tạo (thực hiện trên thí nghiệm chọn lọc các dòng, giống triển vọng)..............................................................................................................................38 3.5.2 Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR.....40 3.6 ðánh giá một số ñặc ñiểm nông sinh học quan trọng............................... 42 3.7 Xử lý số liệu và chọn lọc dòng, giống lúa triển vọng ............................... 43 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, THẢO LUẬN..............................................................46 4.1 Năng suất và các ñặc ñiểm nông sinh học ................................................ 46 4.1.1 Thời gian sinh trưởng..........................................................................................46 4.1.2 Chiều cao cây, chiều dài bông và ñặc ñiểm nông sinh học khác .....................48 4.1.3 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất ....................................................54 4.1.4 ðánh giá một số sâu bệnh trên ñồng ruộng .......................................................57 4.2. Chỉ tiêu chất lượng cơ bản ....................................................................... 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. iv 4.2.1 ðánh giá chất lượng phân tích và nấu nướng....................................................58 4.3.2 Chất lượng xay xát và thương trường................................................................62 4.3 Kết quả ñánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá.......................................... 64 4.3.1 Lây nhiếm nhân tạo.............................................................................................64 4.2.2 Kết quả PCR kiểm tra gen kháng bạc lá............................................................68 4.4 Kết quả chọn lọc các dòng, giống triển vọng............................................ 69 4.5 Chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá bằng kỹ thuật PCR của các cá thể tốt ... 72 4.5.1 Chọn lọc gen xa5 và Xa7 trong quần thể F2 của tổ hợp (PA2 x IRBB5)......72 4.5.2 Chọn lọc gen Xa4 và Xa7 trong quần thể F2 (T65-1 x IRBB7).....................74 4.5.3 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các bố, mẹ trong các tổ hợp lai trong vụ xuân 2011 (vụ nghiên cứu quần thể phân ly)..............................................................76 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ...........................................................................................78 5.1 Kết luận ..................................................................................................... 78 5.1.1 Kết luận cho thí nghiệm khảo sát tập ñoàn........................................................78 5.1.2 Kết luận cho thí nghiệm chọn lọc cá thể tốt từ quần thể phân ly F2................78 5.2 ðề nghị ...................................................................................................... 79 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................80 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Ký hiệu tắt Nội dung CNSH Công nghệ sinh học TGST Thời gian sinh trưởng KL1000 Khối lượng 1000 hạt NSLT Năng suất lý thuyết NSTT Năng suất thực thu IRRI Internationnal Rice Research Institute – Viện nghiên cứu lúa quốc tế AFLP Amplified Fragment Length Polymorphic AND PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp, kỹ thuật chỉ thị phân tử nhằm nhân một ñoạn DNA ñã biết trước. RFLP Restriction fragment length polymorphism – sự ña hình về chiều dài của những ñoạn cắt giới hạn. RADP Randomly amplified polymorphism – ña hình các ñoạn DNA ñược nhân ngẫu nhiên SDS Sodium dodecyl sulphate SSRs Simple sequence repeats – kỹ thuật chỉ thị phân tử nhằm nhân hoặc lai các ñoạn lặp DNA nguyên bản ALP Amplicon length polymorphism- sự ña hình về chiều dài những ñoạn DNA ñược nhân lên trên cơ sở nhân gen PCR DAF DNA amplificatinon fingerprinting - Phương pháp nhân DNA in vân tay dùng rất nhiều ñoạn mồi ñơn ngắn SSCP Single strand confortmation polimophism MRDHV Moderately repeat, dispersed and highly variable DNA, minisatelite STS Sequence Tagged site EDTA Ethylendiamine tetra acetic acid Tris-HCl (Tris hydroxylmethyl) amino methane Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 ðặc ñiểm , nguồn gốc các Xa – gen kháng bệnh bạc lá lúa (Ogawa,1993).............18 2.2 Bản ñồ liên kết di truyền với gen quy ñịnh tính trạng nông sinh học quan trọng với RFLP ñánh dấu........................................................................................................24 3.1 Tên các dòng, giống tham gia thí nghiệm.....................................................................34 3.2 Danh sách các chủng vi khuẩn ñược sử dụng ñể lây nhiễm nhân tạo......................39 4.1 Thời gian sinh trưởng của các dòng khảo sát (ngày)..................................................47 4.2 Chiều cao cây, chiều dài bông và một số ñặc ñiểm nông sinh học khác..................50 4.3 Các ñặc ñiểm hình thái của lá ñòng của các dòng khảo sát........................................52 4.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất................................................................54 4.5 ðánh giá một số sâu, bệnh khác trên ñồng ruộng.......................................................58 4.6 ðánh giá chất lượng phân tích và nấu nướng của các dòng khảo sát........................60 4.7 ðánh giá chất lượng xay xát và thương trường của các dòng, giống........................63 4.8 Phản ứng của các dòng dẳng gen với các chủng vi khuẩn lây nhiễm.......................65 4.9 So sánh kết quả xác ñịnh gen kháng bằng PCR và kết quả lây nhiễm nhân tạo trên các mẫu giống .........................................................................................................66 4.10a Tiêu chuẩn chọn lọc của các dòng giống triển vọng...............................................69 4.10b ðặc ñiểm của 3 dòng triển vọng chọn ñược ............................................................70 4.11 Chọn lọc gen kháng Xa7 và xa5 trong quần thể F2 của tổ hợp (PA2 x IRBB5).............................................................................................................................73 4.12 Chọn lọc gen kháng Xa4 và Xa7 trong quần thể F2 của tổ hợp (T65-1 x IRBB7).............................................................................................................................75 4.13. Một số ñặc ñiểm nông sinh học của dòng bố, mẹ của các tổ hợp lai.....................76 4.14 So sánh ñặc ñiểm nông sinh học và năng suất quan trọng của dòng mẹ và con (cá thể) ñược chọn...................................................................................................77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. vii DANH MỤC CÁC ðỒ THỊ STT Tên ñồ thị Trang 4.1: Năng suất thực thu của các dòng tham gia khảo sát...................................................56 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1. ðiện di kiểm tra gen kháng Xa4 ...................................................................................68 4.2: ðiện di sản phẩm gen xa5 sau khi ủ bằng Enzyme DraI...........................................73 4.3. ðiện di chọn lọc gen kháng Xa7...................................................................................74 4.4. ðiện di chọn lọc gen kháng Xa4...................................................................................75 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. viii 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Lúa là cây lương thực quan trọng với người dân trên thế giới trong ñó có Việt Nam. Trên 80% tổng sản lượng lương thực hàng năm của nước ta là lúa gạo, chính vì vậy sản xuất lúa ñã, ñang và vẫn là một ngành quan trọng nhất trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn nước ta. Một giống lúa tốt ra ñời phải hội ñủ các yếu tố năng suất cao, chất lượng tốt, kháng sâu bệnh và chống chịu ngoại cảnh bất lợi, trong ñó nhu cầu về giống chất lượng tốt và kháng bệnh ñang ñược các nhà khoa học nghiên cứu rộng rãi. Nước ta với ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm là môi trường thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh hại phát triển trong ñó có bệnh bạc lá lúa. Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae (X.oryzae) gây ra là một loại bệnh ñặc biệt nguy hiểm. Bệnh làm giảm năng suất từ 10 – 80 %, thậm chí là mất trắng (Lã Vĩnh Hoa, Tống Văn Hải và cộng sự năm 2009 [7]). Ở nước ta bệnh hoành hành rộng rãi trên nhiều tỉnh trong cả nước không những chỉ vụ mùa mà cả lúa xuân ñặc biệt ở vùng lúa thâm canh ñã gây giảm năng suất nghiêm trọng. Cho tới nay, nhiều biện pháp ñã ñược các nhà nông học ñưa ra như các biện pháp phòng trừ hóa học, các biện pháp canh tác và sử dụng giống kháng bạc lá. Trong ñó sử dụng giống kháng ñược coi là một hướng có hiệu quả cả về mặt kinh tế và môi trường. Hiện nay, các nhà khoa học ñã xác ñịnh ñược khoảng 32 Xa - gen có khả năng kháng ñược bệnh bạc lá như: Xa4, xa5, Xa7, Xa21, .....[28]. Sử dụng các giống lúa có chứa các Xa - gen kháng bệnh là biện pháp phòng chống bệnh có hiệu quả nhất hiện nay. Nhưng trên thực tế là vi khuẩn X. oryzae có tính ña dạng hình thành các nhóm nòi có ñộc tính gây bệnh rất khác nhau. Vì vậy, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 1 mỗi gen kháng ñược những chủng nhất ñịnh, có gen kháng ñược nhiều chủng. Cùng với việc xác ñịnh các Xa - gen có khả năng kháng bệnh với các nhóm nòi khác nhau, một yêu cầu bức thiết là xây dựng chương trình chọn tạo các giống lúa kháng bệnh bạc lá hữu hiệu. Theo nghiên cứu của Phan Hữu Tôn, Bùi Trọng Thủy năm 2002 và 2004 ñã xác ñịnh ñược Việt Nam có 12 chủng vi khuẩn X. oryzae các gen kháng hữu hiệu là xa5 là một gen lặn, Xa7 kháng mạnh, Xa21 thì kháng vừa các gen kháng này có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo giống kháng bệnh bởi chúng có khả năng kháng ñược hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến của Việt Nam. ðể chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tiến hành lai quy tụ nhiều tổ hợp nhằm mục ñích tạo giống chứa gen kháng bạc lá, năng suất cao, chất lượng tốt. Chính vì vậy tiến hành chọn lọc bằng chỉ thị phân tử DNA kết hợp lây nhiễm nhân tạo là một cách chọn lọc hữu hiệu các giống và các vật liệu chứa nguồn gen này. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: "ðánh giá, chọn lọc một số dòng, giống lúa triển vọng kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA ". 1.2 Mục ñích và yều cầu 1.2.1 Mục ñích - Chọn lọc ñược một số dòng, giống chứa gen kháng bạc lá, năng suất cao, chất lượng khá . - Chọn lọc từ quần thể phân ly của một số tổ hợp lai, một số cá thể chứa gen kháng bạc lá và tiềm năng cho năng suất cao nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về nguồn gen phục vụ công tác chọn giống. 1.2.2 Yêu cầu - ðánh giá ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất, chất lượng của các dòng, giống triển vọng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 2 - ðánh giá khả năng kháng ngoài ñồng ruộng qua lây nhiễm nhân tạo của các dòng, giống khảo sát. - Khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA. - Tuyển chọn một số dòng, giống chứa gen kháng bạc lá (Xa4, xa5, Xa7), có năng suất cao, chất lượng khá. - Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc các cá thể chứa gen kháng bạc lá từ quần thể phân ly. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 3 2. TỔNG QUAN VỀ VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Nghiên cứu bệnh bạc lá lúa 2.1.1 Lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh bạc lá Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae (X.oryzae) gây ra. Bệnh ñược phát hiện ñầu tiên ở Fukuoku, Nhật Bản vào năm 1884 [41]. Nghiên cứu về bệnh bạc lá cũng ñược bắt ñầu từ Nhật Bản vào năm 1901, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào sinh thái học và các hóa chất kiểm soát bệnh. Sau ñó những hoạt ñộng nghiên cứu ñược mở rộng dần, từ nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh ñến những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, sinh thái học, các chủng vi khuẩn, dự báo dịch bệnh, nghiên cứu khả năng gây bệnh, khả năng chống chịu và các biện pháp phòng trừ hóa học (Ezuka.A.,Kaku.H.,2000) [31]. Tiếp theo Nhật Bản là một loạt các nước thông báo về dịch bạc lá lúa. Sự xuất hiện của bệnh ñược công bố ở các nước Australia, Bangladesh, Cambodia, Indonesia, Ấn ðộ, Hàn Quốc, Malaixia, Srilaca, Thái Lan, Philiphine, Mỹ, Tây Âu và Việt Nam…. [34]. Sự xuất hiện bệnh bạc lá ñã gây thiệt hại nghiêm trọng ñến mùa vụ tới 50% sản lượng ở nhiều nước trồng lúa trên thế giới. Nghiên cứu ở các nước cho thấy bệnh làm giảm sản lượng hạt với mức ñộ khác nhau tùy thuộc vào giai ñoạn sinh trưởng, mức ñộ nhiễm bệnh của từng giống và ñiều kiện thời tiết (S.S.Gnanamanickam và cộng sự, 1999) [34]. Bệnh bạc lá ñược nhắc ñến ở nước ta khi hòa bình lập lại 1954. Từ năm 1954 – 1975, cùng với những tiến bộ trong công tác cải tiến giống, bệnh bạc lá trở lên phức tạp và khó phòng trừ. Các giống lúa mới chống bệnh kém lại ñược gieo trồng tập trung trên diện tích lớn, thêm vào ñó các kỹ thuật thâm canh như lạm dụng quá nhiều phân vô cơ và tăng vụ ñã tạo ñiều kiện cho bệnh phát triển. Bệnh bạc lá từng gây thiệt hại nặng cho các ñịa phương như Bắc Giang (1956Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 4 1957), ðông Triều - Quảng Ninh (1961) và trở thành dịch lớn ở ñồng bằng sông Hồng những năm 1968-1975 (Hà Minh Trung, 1996) [23]. Cho tới nay ñã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh bạc lá ñược công bố như Lê Lương Tề, Tạ Minh Sơn, Nguyễn Hữu Thụy, Nguyễn ðặng Long, Phan Hữu Tôn, Bùi Trọng Thủy…. Những công trình nghiên cứu ñã tập trung vào mặt sinh học, sinh thái và dịch tễ học, kỹ thuật chuẩn ñoán bệnh và ñặc biệt là nghiên cứu các chủng vi khuẩn, nguồn gen khác bệnh nhằm phục vụ công tác chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá. 2.1.2 ðặc ñiểm triệu chứng của bệnh bạc lá lúa Ở vùng nhiệt ñới, bệnh bạc lá có 3 triệu chứng ñiển hình ñó là: bạc lá, vàng nhợt và héo xanh (Kresek) (B.Cottyn và CS 1994) [26]. Triệu chứng bệnh ñã ñược S.H.OU mô tả như sau: Bệnh thường xuất hiện từ giai ñoạn ñẻ nhánh ñến trỗ, trường hợp nghiêm trọng bệnh còn xuất hiện ở giai ñoạn mạ. Trên mạ: Triệu chứng bệnh không thể hiện ñặc trưng như trên lúa do ñó dễ nhầm lẫn với bệnh khô ñầu lá sinh lý. ðầu tiên xuất hiện những ñốm nhỏ mọng nước ở rìa mép lá, mút lá và những vệt có ñộ dài ngắn khác nhau. Các ñốm này to dần, lá chuyển sang màu vàng khô nhanh rồi chết. Trên lúa: Vết bệnh bắt ñầu từ rìa lá, cách ngọn lá khoảng vài cm, vết bệnh phát triển dọc theo phiến lá cả chiều dài lẫn chiều rộng. Quanh vết bệnh thường có ñường viền gợn sóng phân biệt giữa phần bệnh và phần khỏe. Các vết bệnh có thể bắt ñầu từ một hoặc hai bên bìa lá. Trên những giống dễ bị nhiễm bệnh, lá bị bệnh thường héo tàn ñi như ñổ nước rôi, lá tàn ñi rồi chết. Trên mô bệnh còn tươi vào buổi sáng quan sát thấy những giọt dịch màu trắng sữa do vi khuẩn tiết ra. Giọt dịch này chuyển sang màu vàng rơm ñọng lại thành hình cầu nhỏ li ti rồi rơi xuống nước [12]. Triệu chứng ñiển hình là héo xanh (Kresek) ñược Reitsma và Schure mô tả như sau: Triệu chứng ñầu tiên xuất hiện là ñốm mọng nước ở ngay ñầu mặt cắt của lá, lá chuyển sang màu xanh xám nhanh chóng. Toàn bộ lá bắt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 5 ñầu bị héo và cuộn lại theo gân giữa, thường thì gần giữa biến màu hơi vàng. Lá bị cuộn lại thay ñổi nhanh chóng sang màu xám nhạt, cây con chết dần. Trên các cây con sống sót các nhảnh phát triển chậm lại và biến thành màu vàng nhợt [48]. Theo Lê Lương Tề thì ở Việt Nam bệnh bạc lá chủ yếu là bạc lá. Tác giả còn cho biết triệu chứng bạc lá trên ñồng bằng sông Hồng chia làm hai dạng: Bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xanh. Loại hình bạc lá gợn vàng là phổ biến ở hầu hết các giống và các mùa vụ, còn bạc lá héo xanh thường chỉ xuất hiện trên một số giống lúa. Thông thường ranh giới giũa mô bệnh và mô khỏe trên phiến lá là khá rõ rệt, có ranh giới theo ñường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi có có một ñường viền màu nâu xẫm, ñứt quãng hay không ñứt quãng. Trong ñiều kiện ẩm, nhiệt ñộ tương ñối cao thì trên vết bệnh xuất hiện những giọt dịch vi khuẩn tròn, nhỏ keo ñặc lại có màu hơi vàng ñục, khi rắn cứng có màu nâu hổ phách, màu nước vối [14], [15], [16]. Còn theo Tạ Minh Sơn thì trong cùng một ñiều kiện, mức ñộ lây nhiễm như nhau thì các giống ñịa phương cây cao còn giữ nguyên hình dạng lá bệnh, còn các giống mới nhập nội thấp cây thì lá thường bị táp ñi dễ mủn nát [13]. Trên ñại thể có thể căn cứ từ những ñặc ñiểm triệu chứng trên ñể phát hiện ñược bệnh. Tuy nhiên khi vết bệnh quá cũ hoặc biến ñổi quá trình theo giống và tùy ñiều kiện môi trường bên ngoài, nhất là ở giai ñoạn mạ … có thể nhầm lẫn với hiện tượng khô ñầu lá sinh lý. Do ñó ñể phát hiện ñược bệnh sớm và chính xác cần có thêm phương pháp chuẩn ñoán. Theo Goto (1965) một cách thử nghiệm ñơn giản ñể phát hiện bệnh là cắt mẫu lá có vết bệnh ñiển hình rồi nhúng trong dung dịch fuchsin loãng [35]. Các nhà khoa học của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội cũng ñã tham khảo phương pháp giọt dịch và phương pháp ép trên lam kính ñể phát hiện giọt dịch vi khuẩn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 6 2.1.3 ðặc ñiểm của vi khuẩn xanthomonas oryzea pv.oryzae a) ðặc ñiểm sinh vật học Theo Tagami Y và OU thì vi khuẩn xanthomonas có hình gậy ngắn tròn ở hai ñầu. Kích thước 1 - 2µm x 0,8 - 1µm, có một tiêm mao, nhuộm màu gram âm và không hình thành nha bào. Tế bào vi khuẩn có màng nhầy bao bọc và ñược liên kết với nhau thành một khối vững chắc ngay cả trong nước. Khuẩn lạc màu vàng rơm, dịch vi khuẩn tiết ra kết thành các hạt keo màu vàng, không hòa tan trong nước (Tạ Minh Sơn, 1987) [13]. Theo Reddy và OU (1974), phân lập vi khuẩn trong môi trường Wakimoto và ủ ở nhiệt ñộ 25 – 300C. Nhận thấy vi khuẩn chậm phát triển và có màng nhầy màu vàng rơm, nhuộm màu gram âm, kích thước từ 1,1 – 1,2µm x 0,4 – 0,6µm [46]. Trong môi trường nhân tạo khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng hình tròn, có màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm màu gram âm. Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hóa gelatin, không tạo NH3, indol, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axit trong môi trường có ñường [15]. Theo Fang (1957) (dẫn theo Lê Thị Phương Lan) [9]. ðường saccaroza là nguồn các bon ưa thích ñối với vi khuẩn song ở một chừng nào ñó thì vi khuẩn sử dụng các bon từ các nguần khác nhau (trừ Fructoza). Theo tác giả thì vi khuẩn bị ức chế trên môi trường glucoza trên môi trường khoai tây vì có thể glucoza sinh ñộc tố trong khi hấp khử trùng. Vi khuẩn có thể sinh trưởng trong phạm vi pH từ 4,0 - 7,8, tối thích là 6,0 - 6,5. Theo Kiraly và cộng sự (1974), nhiệt ñộ tối thiểu cho vi khuẩn sinh trưởng là từ 5 - 100C, tối thích là 25 - 300C, và tối ña là 400C. Ở khoảng 500C các tế bào vi khuẩn bị phân giải trong 10 phút [8]. Con ñường xâm nhập của vi khuẩn bạc lá xanthomonas oryzea pv.oryzae: Vi khuẩn xâm nhập vào tế bào cây chủng thông qua thủy khổng và Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 7 vết thương trên lá và rễ. Sau khi lây bệnh chúng tập trung xung quanh thủy khổng rồi xâm nhập vào hệ thống mao mạch. Sự lây lan của vi khuẩn xẩy trong ñiều kiện mưa và gió chủ yếu trong dông bão và tưới tiêu nước (Dath và Devadath, 1983), [27]. Phạm vi ký chủ của vi khuẩn xanthomonas oryzea pv.oryzae là khá rộng ngoài cây lúa vi khuẩn còn sống trên một số loại cỏ. Singgh (1971) cho biết, vi khuẩn xanthomonas oryzea không thể sống ñược trong ñất và chỉ sống ñược 15- 38 ngày trong nước. Nhưng Murty và Devadath (1982) cho rằng cũng tùy vào từng loại ñất. Theo Kauffman và Reddy (1975) vi khuẩn không thể tồn tại trong hạt giống quá 2 tháng còn trong rơm rạ vi khuẩn có thể sống ñược 3 - 4 tháng [37], [45]. b) Thành phần nòi Những nghiên cứu ở viện nghiên cứu Lúa Quốc Tế IRRI ñã khẳng ñịnh tính chuyên hóa ký sinh của vi khuẩn xanthomonas campestris pv. Oryzae trên bộ giống chỉ thị nòi (Mew và cộng sự, 1982) [40]. Ở Nhật Bản, nghiên cứu nòi ñược tiến hành từ năm 1957, khi phát hiện thấy giống Asakase kháng bệnh trở lên nhiễm bệnh. Họ ñã xác ñịnh ñược 5 nòi vi khuẩn. Philippin ñã xác ñịnh ñược 6 nhóm loài vi khuẩn và ở Indonexia có 9 nhóm nòi [13], [39]. Ở Việt Nam cũng có những nghiên cứu về thành phần nòi vi khuẩn. Tạ Minh Sơn ñã sử dụng tổng hợp bộ giống chỉ thị nòi của Nhật Bản và IRRI ñã xác ñịnh ñược ở nước ta có 10 nhóm vi khuẩn, nhưng có 4 nhóm phổ biến nhất. Nhóm I tập trung ở các tỉnh ñồng bằng Bắc Bộ, nhóm II tập trung ở các tỉnh thuộc ñồng bằng Nam Bộ, nhóm III, IV có rải rác ở khắp cả nước. So với thành phần nòi ở các nước thì thành phần nòi của Việt Nam khác hẳn với thành phần nòi của Nhật Bản. Một số nhóm nòi ở Philippin và Indonexia ñều có ở Việt Nam [13]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 8 Theo kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn (2004), bằng phương pháp nuôi cấy tế bào kết hợp với kỹ thuật PCR ñể nhận diện loài vi khuẩn xanthomonas oryzea pv.oryzae ñã phân lập ñược 154 isolate và xác ñịnh chúng thuộc 12 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau ñánh số thứ tự từ 1 tới 12. Hai chủng 2 và 3 rất phổ biến và tồn tại hầu hết các vùng trồng lúa ở Việt Nam [20]. Kết quả nghiên cứu của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội trong những năm gần ñây cho thấy: Ở phía bắc nước ta ñã xác ñịnh ñược 15 nhóm vi khuẩn xanthomonas oryzea pv.oryzae trong ñó có 5 chủng chiếm ưu thế tuyệt ñối, hơn 80% quần thể vi khuẩn trên ñồng ruộng [18], [32]. 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh và phát triển và phòng trừ bệnh a) Các yếu tố ảnh hưởng tới phát sinh, phát triển của bệnh Sự phát sinh, phát triển của bệnh có liên quan tới khí hậu, thời tiết. Tổng lượng mưa, gập lụt và gió mạnh và mức nước tưới trong ruộng, nhiệt ñộ cao trong thời gian sinh trưởng của cây cũng làm tăng mức ñộ bệnh. Devadath (1985) cho biết nhiệt ñộ tối thích làm cho bệnh phát triển là 24,3 – 34,00C. Ở nhiệt ñộ dưới 180C hoặc trên 37,20C ñều kìm hãm sự phát triển của bệnh. Nhiệt ñộ ảnh hưởng rất rõ khi tiến hành lây nhiễm nhân tạo. Vết bệnh phát triển ở 25 – 280C nhiều hơn là vết bệnh phát triển ở 17 – 210C. Nhiệt ñộ thích hợp nhất cho lây nhiễm bệnh là 21,3 – 32,70C. Nhiệt ñộ dưới 16,70C hoặc trên 37,40C ñều không thích hợp cho vết bệnh phát triển. Theo tác giả ngoài nhiệt ñộ ñược coi là yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng và phát triển của bệnh thì ñộ ẩm là nhân tố cho sự hình thành và phát triển của bệnh khi ñộ ẩm thấp ñạt 60,3% ñến 77,5% sẽ hạn chế sự phát triển của bệnh (Tạ Minh Sơn) [13]. Sự phát triển của bệnh biến ñổi theo mùa rõ rệt. Gió, bão không những là nhân tố lan truyền vi khuẩn mà còn tạo ra các vết thương cơ học trên lá lúa cho vi khuẩn xâm nhập. Ở miền Bắc nước ta bệnh phát sinh gây hại ở tất cả Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 9 các vụ trồng lúa nhưng bệnh gây nặng nhất vào vụ mùa [13], [15].Các yếu tố kỹ thuật trồng trọt cũng ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển của bệnh, trong ñó phân bón, nhất là phân ñạm vô cơ có ảnh hưởng rất rõ ñến mức ñộ phát triển của bệnh. Căn cứ vào nhiều thí nghiệm tiến hành ở Viện Bảo vệ Thực vật và trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội thì bón lượng ñạm cao cây lúa xanh tốt, thân lá mềm yếu, hàm lượng ñạm tự do tích lũy khá cao ñều làm cho lúa bị bệnh nặng hơn nhiều so với bón ñạm ít [16]. b) Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá Xuất phát từ những cơ sở về ñặc ñiểm sinh học của vi khuẩn gây bệnh người ta ñã ñề ra các biện pháp phòng trừ tổng hợp: Sử dụng các giống lúa kháng bệnh ñể gieo trồng là biện pháp chủ ñạo trong phòng trừ bệnh bạc lá. Xử lí hạt giống trước khi gieo nếu lô hạt bị nhiễm. ðiều khiển sự sinh trưởng của cây tránh giai ñoạn lúa làm ñòng - trỗ trùng với ñiều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển. Bón phân ñúng kỹ thuật, ñúng giai ñoạn, bón ñạm nặng ñầu nhẹ cuối, bón thúc sớm cân ñối với kali theo tỷ lệ nhất ñịnh (1:1). Ruộng lúa nhất cần ñiều chỉnh mức nước thích hợp, nên ñể mức nước nóng (5 - 10cm), nhất là sau khi lúa ñẻ nhánh, nếu thấy bệnh chớm xuất hiện thì có thể rút nước, tháo nước ñể khô ñồng ruộng trong khoảng từ 2 ñến 3 ngày ñể hạn chế sự sinh trưởng của cây. Có thể dùng 1 số thuốc hóa học ñể phòng trừ bệnh nhằm hạn chế sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá như Kasuran 0.1 – 0.2 %; Sankel 1/200… Ngoài ra cần phải tiến hành biện pháp vệ sinh ñồng ruộng, diệt trừ cỏ dại và kí chủ. Tuy nhiên, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh là biện pháp chủ ñộng, hiệu quả và khả thi nhất, không gây ô nhiễm môi trường và tạo sản phẩm sạch. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………….. 10