Tài liệu đánh giá an toàn chế phẩm probiotic chứa vi khuẩn dạng bào tử trên chuột nhắt trắng swiss albino

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ THỊ PHƯƠNG MAI ĐÁNH GIÁ AN TOÀN CHẾ PHẨM PROBIOTIC CHỨA VI KHUẨN DẠNG BÀO TỬ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG SWISS ALBINO Ngành: Thú y Mã ngành: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Bá Tiếp NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các nội dung nghiên cứu, số liệu tính, kết quả được thể hiện trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố cho việc bảo vệ một học vị nào trong và ngoài nước. Tôi cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ để thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Vũ Thị Phương Mai i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy cô giáo công tác tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam nói chung và các Thầy cô trong Khoa Thú Y nói riêng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Bá Tiếp - Bộ môn Giải phẫu - Tổ chức Phôi thai, khoa Thú Y người đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, anh em, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Vũ Thị Phương Mai ii MỤC LỤC Lời cam đoan ................................................................................................................ i Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt....................................................................................................v Danh mục bảng ........................................................................................................... vi Danh mục hình ........................................................................................................... vii Trích yếu luận văn ..................................................................................................... viii Thesis abstract ...............................................................................................................x Phần 1. Mở đầu ...........................................................................................................1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ..........................................................................................3 2.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic ........................................................................3 2.1.1. Lịch sử probiotic ..............................................................................................3 2.1.2. Khái niệm probiotic ........................................................................................4 2.2. Vai trò của probiotic ........................................................................................4 2.3. Cơ chế hoạt động của probiotic ........................................................................4 2.3.1 Tác dụng trên biểu mô ruột. .............................................................................6 2.3.2. Tác dụng đến hệ vi sinh vật đường ruột............................................................6 2.4. Chế phẩm probiotic..........................................................................................9 2.4.1. Lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic .........................................................9 2.4.2. Thành phần của chế phẩm probiotic ............................................................... 11 2.4.3 Tác dụng của probiotic .................................................................................. 13 2.4.4. Sản phẩm và ứng dụng................................................................................... 14 2.5. Tác động của hệ vi sinh vật đường ruột .......................................................... 15 2.6. Cấu tạo vi thể của ruột non ............................................................................ 17 Phần 3. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu ...................................... 20 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..................................................................20 3.2. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 20 3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 20 3.3.1. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 20 iii 3.3.2. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng ..............................................21 3.3.3. Lượng thức ăn thu nhận gam/con/ngày (ADFI): ............................................. 22 3.3.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể và đánh giá cấu trúc vi thể ..........................22 3.3.5. Phân tích số liệu............................................................................................. 23 Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận .................................................................24 4.1. Đánh giá ảnh hưởng của Neoavi SupaMax đến tỷ lệ nuôi sống và sinh trưởng của chuột Swiss albino ....................................................................... 24 4.1.1. Ảnh hưởng của chế phẩm đến tỷ lệ nuôi sống ................................................24 4.1.2. Ảnh hưởng của liều lượng đến khả năng sinh trưởng .....................................25 4.2. Ảnh hưởng của bổ sung Neoavi SupaMax đến chuyển hóa thức ăn ................33 4.2.1. Ảnh hưởng đến lượng thức ăn thu nhận .........................................................33 4.2.2. Ảnh hưởng của liều lượng chế phẩm đến tỷ lệ chuyển hóa thức ăn.................35 4.3. Ảnh hưởng của Neoavi SupaMax đến biểu mô niêm mạc ruột chuột Swiss albino. ............................................................................................................37 4.3.1. Ảnh hưởng của chế phẩm đến cấu trúc biểu mô ............................................. 37 4.3.2. Ảnh hưởng của chế phẩm Neoavi SupaMax đến kích thước lông ...................40 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ................................................................................... 45 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 45 5.2. Kiến nghị .......................................................................................................45 Phụ lục ...................................................................................................................... 46 Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 49 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADFI ADG Nghĩa tiếng Việt Average Daily Feed Intake (Lượng thức ăn thu nhận hàng ngày) Avarage Daily Gain (Sinh trưởng tuyệt đối) Cs Cộng sự ĐC Đối chứng EC EU FCR European Commission (Ủy ban Khoa học Châu Âu) European Union (Khối liên minh Châu Âu) Feed Conversion Rate (Hệ số chuyển hóa thức ăn) LTATN Lượng thức ăn thu nhận NIZO Trung tâm nghiên cứu Hà lan PNAS Proceedings of the National Academy of Sciences TIFN Top Institute Food and Nutrition (Viện Dinh dưỡng và thực phẩm) TN Thí nghiệm VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotics ................................ 10 Bảng 2.2. Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ ........12 Bảng 3.1. Bố trí thì nghiệm ....................................................................................... 21 Bảng 4.1. Khối lượng của chuột nhắt trắng thí nghiệm qua các tuần tuổi ..................26 Bảng 4.2. Sinh trưởng tuyệt đối của chuột qua các giai đoạn ................................... 29 Bảng 4.3. Sinh trưởng tương đối của chuột qua các tuần tuổi ...................................32 Bảng 4.4. Lượng thức ăn thu nhận của chuột qua các tuần tuổi ................................ 34 Bảng 4.5. Tỷ lệ chuyển hóa thức ăn của chuột qua các tuần tuổi ................................36 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Minh họa cơ chế tác động của probiotic .....................................................5 Hình 2.2. Cơ chế kháng vi sinh vật của Bacteriocin. ...................................................7 Hình 2.3. Cơ chế tác động đến miễn dịch của Lactobacillus plantarum .......................8 Hình 2.4. Vi khuẩn Lactobacillus casei.....................................................................11 Hình 2.5. Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus ............................................................ 11 Hình 2.6. Vi khuẩn Enterococcus faecium ................................................................ 11 Hình 2.7a. Vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................... 11 Hình 2.7b. Nha bào của vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................................... 11 Hình 2.8. Sự phân bố của vi sinh vật có lợi trong ống tiêu hóa ..................................16 Hình 2.9. Cấu tạo ruột non ........................................................................................ 19 Hình 4.1. Chuột thí nghiệm khỏe mạnh, nhanh nhẹn, phân khô ................................. 24 Hình 4.2. Sinh trưởng tích lũy của chuột nhắt trắng qua các tuần tuổi ....................... 27 Hình 4.3. Sinh trưởng tuyệt đối của chuột nhắt trắng qua các tuần tuổi ..................... 30 Hình 4.4. Sinh trưởng tương đối của chuột nhắt trắng Swiss albino...........................33 Hình 4.5. Lông nhung biểu mô tá tràng chuột nhóm đối chứng ............................... 38 Hình 4.6. Lông nhung biểu mô không tràng chuột nhóm được bổ sung Neoavi SupaMax nồng độ thấp ............................................................................. 39 Hình 4.7. Lông nhung biểu mô hồi tràng chuột nhóm được bổ sung Neoavi SupaMax nồng độ trung bình .................................................................... 39 Hình 4.8. Lông nhung biểu mô không tràng chuột nhóm được bổ sung Neoavi SupaMax nồng độ cao ............................................................................. 39 Hình 4.9. Chiều cao và chiều rộng lông nhung biểu mô tá tràng ................................41 Hình 4.10. Chiều cao và chiều rộng lông nhung biểu mô không tràng .........................41 Hình 4.11. Chiều cao và chiều rộng lông nhung biểu mô hồi tràng..............................42 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Thị Phương Mai Tên Luận văn: Đánh giá an toàn chế phẩm probiotic chứa vi khuẩn dạng bào tử trên chuột nhắt trắng Swiss albino. Ngành: Thú Y Tên cơ sở đào tạo: Mã số: 60.64.01.01 Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1. Mục đích nghiên cứu Đánh giá an toàn và tác dụng phụ thuộc liều lượng probiotic Neoavi SupaMax chứa bào tử Bacillus đến một số chỉ tiêu sinh trưởng, chuyển hóa thức ăn và biểu mô ruột non chuột nhắt trắng Swiss albino, là cơ sở khuyến cáo sử dụng probiotic dạng bào tử trong chăn nuôi. 2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp bố trí thí nghiệm một nhân tố đánh giá tác dụng của Neoavi Supa Max đến các chỉ tiêu sinh trưởng, chuyển hóa thức ăn của chuột. - Phương pháp thường quy làm tiêu bản vi thể nhuộm HE. - Kích thước lông nhung được đo bằng phần mềm Infinity Analysis trên kính hiển vi Kniss MBL-2000T (Olympus, Japan). 3. Kết quả nghiên cứu chính - Bổ sung chế phẩm Neoavi SupaMax ở các liều lượng 5x108CFU; 1,25x108CFU và 0,612x108CFU bào tử vi khuẩn Bacillus (tương ứng 1g; 0,25g và 0,0625g chế phẩm trong1 lít nước uống) không ảnh hưởng đến tỷ lệ nuôi sống chuột, 100% số chuột sống và khỏe mạnh. - Nồng độ cao làm tăng sinh trưởng tích lũy; tăng lượng thức ăn thu nhận; giảm tỷ lệ chuyển hóa thức ăn. Tác dụng rõ nhất của chế phẩm ở tuần tuẩn 12 đến 13; ở chuột đực rõ hơn ở chuột cái. - Chế phẩm Neoavi SupaMax có tác dụng đến biểu mô ruột non, làm tăng chiều cao lông nhung, thay đổi chiểu rộng lông nhung biểu mô tá tràng và không tràng ở các mức độ khác nhau. Ở các nồng độ bổ sung chế phẩm không ảnh hưởng đến kích thước lông nhung biểu mô hồi tràng. 4. Kết luận Neoavi SupaMax chứa bào tử vi khuẩn Bacillus chịu nhiệt an toàn với chuột Swiss albino và cho thấy tác dụng tích cực đến tăng trưởng; tỷ lệ chuyển hóa thức ăn và viii biểu mô niêm mạc ruột non. Các tác động này thay đổi theo nồng độ chế phẩm; tuổi và tính biệt của chuột cũng như các phần của ruột non. Những kết quả của nghiên cứu có thể là cơ sở cho việc sử dụng các chế phẩm chứa bào tử vi khuẩn trong thành phần bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi. ix THESIS ABSTRACT Author name: Vu Thi Phuong Mai Thesis title: Safety evaluation of bacterial spores as a probiotic supplement in Swiss albino mice. Major: Veterinary Medicine Institution: Code: 60.64.01.01 Vietnam National University of Agriculture 1. Research purposes Safety evaluation and dose-dependent effects of Neoavi SupaMax containing Bacillus spores on some growth parameters, feed conversion and small intestinal epithelium of Swiss albino mice as background for the usage the product as animal feed supplement. 2. Research Methodology - One factor experimental design for assessing the effects of Neoavi SupaMax containing bacterial spores on nutritional and growth parameters. - Routine methods for microscopic examination with HE staining slides. - Epithelial villum measurement was performed with Infinity Analysis software o using Kniss MBL-2000T microscope (Olympus, Japan). 3. Key research findings - Supplement of probiotic product Neoavi SupaMax in drinking water at three different doses including high, medium and low (5x108CFU; 1,25x108CFU và 0,612x108 CFU Bacillus spores per litter) did not affect survival rates of Swiss albino mice. - High dose supplement of the product led to an increase in BW gain, ADG, feed intake and a decrease in FCR. The highest effect was shown at 12 to 13 weeks of age. The effects were more obvious in male mice. - Neoavi SupaMax affected small intestine epithelia shown in increase of villus height and altered villus width of duodenum and jejunum but did not affect ileum villi. 4. Conclusions Heat resistant Bacillus bacterial spore product Neoavi SupaMax was shown as a safe supplement for Swiss albino mice. The product led to possitive effects on some growth parameters, FCR and small intestinal epithelia. The effects were dose-, mouse age- and gender-dependent. The study can be considered as additional evidence for using bacterial spore in Neoavi SupaMax as animal feed supplements. x PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Sử dụng kháng sinh với mục đích kích thích sinh trưởng, phòng bệnh và điều trị bệnh cho vật nuôi thiếu kiểm soát và là một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật. Tồn dư kháng sinh gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe vật nuôi và người tiêu dùng sản phẩm chăn nuôi. Từ tháng 1 năm 2006, Ủy ban Châu Âu đã cấm sử dụng kháng sinh nhằm mục đích kích thích sinh trưởng (chỉ thị 1831/2003/EEC). Kết quả điều tra của Đậu Ngọc Hào và cs. (2008) cho biết kiểm tra 30 mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt ở Hà Tây, Hưng Yên phát hiện thấy Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline và Tylosine tương ứng 33,3%, 13,3%, 6,7% và 23,3%. Các mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt được lấy từ Thái Bình phát hiện thấy: Tylosine 50%, Sulfamethazine 50%; ở Hưng Yên Chlortetracycline 0%, Tylosine 25%, Sulfamethazine 45% và ở Vĩnh Phúc Oxytetracycline 75%, Tylosine 85%, Sulfamethazine 10%, Chlortetracycline 45%; thức ăn gà thịt phát hiện thấy Tetracycline (30%), Oxytetracycline (23,3%) và Tylosine (43,3%). Trong ngành chăn nuôi công nghiệp trên thế giới, nhiều loại kháng sinh được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi mà các kháng sinh Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline và Tylosine là rất phổ biến (Marcia and Thomas, 2007). Võ Thị Trà An và cs. (2002) ghi nhận ở khu vực thành phố Hồ Chí Minh có 32,6% các cơ sở chăn nuôi gà thịt sử dụng kháng sinh không hợp lý, 44,5% các cơ sở không ngừng thuốc trước khi giết thịt đúng quy định Trong thập kỷ qua, đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm kiếm các phương pháp thay thế sử dụng kháng sinh cũng như tìm kiếm các chất vừa có khả năng kích thích sinh trưởng, an toàn, thân thiện để giảm nguy cơ mắc bệnh đường ruột cho vật nuôi và cải thiện chất lượng sản phẩm cho người tiêu dùng như chế phẩm probiotic, prebiotic, symbiotic, enzymes, axit hữu cơ và các chất phụ gia khác đã và đang được phát triển (Fluton et al., 2002). Tác dụng tích cực của probiotic được chứng minh thông qua khả năng kích thích tính thèm ăn (Nahashon et al., 1994), cải thiện, thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột (Fuller, 1989), cải thiện chức năng tiêu hóa (Collins and Gibson, 1999). Ngoài ra, probiotic kích thích hệ miễn dịch (Perdigon et al., 1999; Collins et al., 1999; 1 Patterson, 2003). Vì vậy, trong chăn nuôi, đặc biệt chăn nuôi công nghiệp, sử dụng probiotic để cải thiện sức khỏe đường ruột qua đó cải thiện sức khỏe và sức sản xuất của vật nuôi (Blok et al., 2002). Tuy nhiên, vẫn còn có những tranh luận về tác dụng của probiotics. Nghiên cứu của Maxwell et al. (1983) and Hong et al. (2002), cho rằng bổ sung probiotic chứa Lactobacillus sp. có tác động tốt đến khả năng tiêu hóa. Một số nghiên cứu khác lại cho rằng bổ sung probiotic có chứa Lactobacillus hoặc Bacillus không ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa của lợn thí nghiệm (Hale and Newton, 1979; Kornegay and Risley, 1996). Những kết luận trái ngược này có thể do có sự khác nhau về đặc tính của vi sinh vật trong chế phẩm, điều kiện bảo quản, và cách thức sử dụng chế phẩm probiotics. Chế phẩm Neoavi SupaMax do Công ty Công nghệ sinh học mùa xuân (Bio Spring) sản xuất với thành phần là bào tử các chủng vi khuẩn Bacillus có thể bổ sung vào thức ăn hoặc nước uống cho gà. Để đánh giá tác dụng của chế phẩm này, xác định liều lượng bổ sung, thời điểm bổ sung là vấn đề cần được quan tâm. Hơn nữa, với bất cứ chế phẩm sinh dược nào, đánh giá an toàn trên động vật thí nghiệm là một trong những điều kiện bắt buộc trước khi ứng dụng. Chính vì vậy, đề tài “Đánh giá an toàn chế phẩm probiotic chứa vi khuẩn dạng bào tử trên chuột nhắt trắng Swiss albino” đã được thực hiện. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Đánh giá tác dụng của probiotic dạng bào tử trong chế phẩm Neoavi SupaMax trên chuột nhắt trắng Swiss albino ở các liều lượng khác nhau là cơ sở khuyến cáo sử dụng chế phẩm an toàn và hiệu quả. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. LỊCH SỬ VÀ ĐỊNH NGHĨA PROBIOTIC 2.1.1. Lịch sử probiotic Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ XX, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc tiêu chảy có xuất hiện ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh. Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel - đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” - The Prolongation of life (1908). Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm triệu chứng táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men - đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotic được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80. Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi. 3 2.1.2. Khái niệm probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” (Fuller, 1989). Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho động vật. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic: (i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”. 2.2. VAI TRÒ CỦA PROBIOTIC Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi, ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu, probiotic được coi là một trong những nguồn thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt. Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh, gồm: tác dụng làm thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ; tăng cường khả năng miễn dịch; giảm phản ứng viêm; ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh; tăng sản xuất các axit béo bay hơi; tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B; tăng hấp thu chất khoáng; làm giảm cholesterol trong máu; tăng năng suất vật nuôi và giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải. Ngoài ra probiotic an toàn với động vật và thân thiện với môi trường. Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng. 2.3. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA PROBIOTIC Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba tác dụng sau: (i) cạnh tranh loại trừ, (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006). Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật. Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị trí 4 bám dính. Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella... Một số nấm men probiotic như Saccharomyces cerevisiae; S. Boulardii không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czerucka and Rampal, 2002). Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sôi với số lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển. Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic sản sinh các chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một số axit hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996). Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù. Năng lực miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân bằng của hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999). Thông qua tương tác với hệ thống miễn dịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai. Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng giống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas et al., 1999). Tuy nhiên, cơ chế tác động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ. Hình 2.1. Minh họa cơ chế tác động của probiotic Nguồn: Yirga H. (2015) 5 Từ ba cơ chế chung nói trên sẽ mang lại những lợi ích không nhỏ cho vật nuôi của chúng ta hiện nay như: - Bảo vệ niêm mạc đường tiêu hóa giúp tăng khả năng thu nhận thức ăn cho con vật, giảm thức ăn dư thừa từ đó giảm đi mùi hôi tác động tới môi trường. - Tác động đối kháng và tác động diệt khuẩn nhờ tiết ra chất bacterin giúp làm giảm các vi khuẩn có hại trong đường ruột. - Luôn giữ được trạng thái cân bằng của hệ vi sinh vật tại đường ruột. - Từ đó làm tăng khả năng chuyển hóa protein và các chất dinh dưỡng trong thức ăn, sẽ giúp làm giảm sản sinh các sản phẩm khí trung gian gây mùi như H2S, NH3 làm giảm mùi hôi của chuồng nuôi. 2.3.1. Tác dụng trên biểu mô ruột Vi sinh vật của probiotic có khả năng bám dính tốt tế bào biểu mô ruột, cạnh tranh nơi cư trú với các vi sinh vật bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng. Do đó, chúng có khả năng giảm kích thích bài tiết và những hậu quả do phản ứng viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn, cũng như đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ thuộc hàng rào niêm mạc ruột. 2.3.2. Tác dụng đến hệ vi sinh vật đường ruột Probiotic có khả năng điều chỉnh thành phần của vi khuẩn đường ruột. Sự sống sót của vi khuẩn phụ thuộc vào bản chất của vi khuẩn. Khi tập trung ở ruột, vi sinh vật trong probiotic tạo nên sự cân bằng tạm thời, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic. Mức độ tác dụng phụ thuộc vào liều lượng của giống vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng nếu bổ sung thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột. Probiotic cư trú ở ruột với những vi khuẩn có lợi và loại trừ các vi khuẩn có đọc lực như E.coli, Salmonella và Clostridium ở những vị trí lông nhung của ruột non, nơi mà vi khuẩn có hại sẽ phá hủy lông nhung. Probiotic tăng cường sức đề kháng bằng cách bảo vệ lông nhung biểu mô ruột, làm tăng chiều cao của lông nhung và tăng độ sâu của các khe nằm giữa lông nhung. Theo cách đó sẽ gia tăng được diện tích bề mặt hấp thu chất dinh dưỡng. Vì vậy, con vật sẽ gia tăng hiệu quả hấp thụ thức ăn. 6 Các nhà khoa học từ Viện nghiên cứu thực phẩm ở Norwich (vương quốc Anh) cho rằng probiotic có thể tiêu diệt mầm bệnh vi khuẩn sống ở ruột gia cầm, do đó giúp loại bỏ mối đe dọa sự ngộ độc thực phẩm vi khuẩn từ chuỗi thức ăn. 2.3.2.1. Cơ chế kháng khuẩn của vi sinh vật probiotic Vi sinh vật probiotic làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng khuẩn ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Các chất kháng khuẩn gồm các acid hữu cơ như: axit lactic, axit acetic…. Sản phẩm tiết của vi khuẩn trong probiotic là Bacteriocin - nhóm peptide hay protein được tổng hợp nhờ ribosome có hoạt tính kháng vi sinh vật (hình 2.2). Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH ruột thông qua sự tạo ra các axit béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, và đặc biệt là lactic. s Hình 2.2. Cơ chế kháng vi sinh vật của Bacteriocin. Nguồn: Cotter et al. (2005) Bacteriocin class I ( như nisin của Lactococcus lactis), gắn vào lớp lipid II, ngăn cản sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, do đó ngăn cản tổng hợp vách tế bào hoặc bám vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào. 7 Bacteriocin class II (đại diện là sakacin của Lactobacillus sake) là các peptide lưỡng tính có khả năng xuyên màng tế bào tạo kênh, lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin), protein không bền nhiệt, tác động trực tiếp lên vách tế bào đích. 2.3.2.2. Cơ chế tăng cường miễn dịch và các hoạt tính khác Probiotic như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột. Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm. Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng. Vi khuẩn probiotics có khả năng huy động các tế bào miễn dịch, hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch thích hợp nhờ một cơ chế phức tạp bắt đầu bằng sự tương tác giữa tế bào probiotic và tế bào của hệ miễn dịch. Một nhóm các nhà khoa học vừa công bố tác dụng của vi sinh vật probiotic ảnh hưởng đến hoạt động của các gene của các tế bào ruột. Đây là kết quả đầu tiên về cơ chế thay đổi các phản ứng miễn dịch của probiotic. Nghiên cứu được thực hiện bởi một nhóm các nhà khoa học của Viện Dinh dưỡng và thực phẩm (TIFN) thuộc Đại học Maastricht và Đại học Radboud (Hà Lan) và trung tâm nghiên cứu Hà Lan NIZO (hình 2.3). Hình 2.3. Cơ chế tác động đến miễn dịch của Lactobacillus plantarum Nguồn: Theo Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) Trong nhóm các tình nguyện viên, một số được bổ sung probiotic sống Lactobacillus plantarum, một số khác tiếp thu các tế bào vô hoạt của chủng probiotic này. Các phân tích biểu hiện gene các tế bào của tá tràng đã được tiến 8 hành và cho thấy hiệu quả của probiotic sống đối với các hoạt động tế bào. Các hoạt động này kích hoạt hệ miễn dịch của cơ thể. 2.4. CHẾ PHẨM PROBIOTIC Probiotic là chất bổ sung vi sinh vật sống có tác dụng tăng cường sức đề kháng cho con vật và con người thông qua cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Trong giai đoạn thai, hệ tiêu hóa hầu như không có vi khuẩn, ngay sau khi sinh ra, vi khuẩn đã bắt đầu xâm nhập vào cơ thể qua thức ăn, nước uống, môi trường qua đường miệng và hình thành hệ vi khuẩn đường tiêu hóa gồm 3 loại: vi khuẩn có lợi, vi khuẩn có hại và vi khuẩn cơ hội. Các vi khuẩn có lợi và hại đều cần thiết để bắt đầu quá trình phát triển hệ miễn dịch. Vi khuẩn có lợi phát triển sẽ khống chế số lượng vi khuẩn có hại, giúp tạo nhóm vitamin B, K, hỗ trợ cho hệ miễn nhiễm của cơ thể một cách thích hợp. Với sự hỗ trợ của vi khuẩn có lợi, hệ miễn dịch ở động vật non được kích hoạt và huấn luyện. Hai vi khuẩn này cùng tồn tại trong đường ruột và có sự đối kháng, cạnh tranh nhau. Bổ sung probiotic sẽ tăng khả năng kháng bệnh, tăng khả năng tiêu hóa hấp thu, giúp con vật khỏe mạnh, ít mắc bệnh. Khi cân bằng nghiêng về vi khuẩn có lợi, cơ thể được bảo vệ tránh các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa hay rối loạn làm giảm khả năng sinh trưởng và sinh sản của con vật. 2.4.1. Lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh (colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau: Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủng probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu hóa và sinh sôi nảy nở. Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch của vật chủ. Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi sinh vật bất lợi khác. 9