Tài liệu Đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học, điều trị u nhú thanh quản người lớn tại viện tai mũi họng trung ương

1 ĐẶT VẤN ĐỀ U nhú thanh quản (UNTQ) hay Papilloma thanh quản (TQ) là loại u lành tính, do sự quá sản của các tế bào vảy, hình thành các nhú nhô lên bề mặt biểu mô [7],[11]. Đặc điểm lâm sàng của loại u này là có xu hướng lan rộng và dễ tái phát sau phẫu thuật. Bệnh có thể gặp ở cả người lớn và trẻ em; tỷ lệ gặp UNTQ của trẻ em ở Mỹ là 4.3/ 100.000 dân, của người lớn là 1.8/ 100.000 dân [7],[21] và biểu hiện bệnh của hai thể này là hoàn toàn khác nhau. Ở trẻ em u nhú có xu hướng lan rộng gây khó thở và tái phát sau phẫu thuật nhưng đến tuổi dậy thì u thoái triển, ít có khả năng trở thành ác tính. Ở người lớn u phát triển thường có tính khu trú nhưng không có xu hướng thoái triển và ngược lại có thể bị ung thư hóa [7],[10],[23]. Được mô tả lần đầu vào thế kỷ XVII bởi Marcellus Donalus, UNTQ đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà lâm sàng và giải phẫu bệnh trên khắp thế giới [25],[57]. Cùng với sự phát triển của ngành sinh học phân tử và hóa mụ miễn dịch, nguồn gốc bệnh sinh của UNTQ do HPV (Human Papilloma Virus) đã được xác định, trong đó typ 6 và typ 11 được coi là những typ phổ biến nhất [8],[17],[28]. U nhú thanh quản là một bệnh khụng khó trong chẩn đoán đặc biệt với sự phát triển của nội soi; nhưng điều trị còn nhiều khó khăn với diễn biến dai dẳng và dễ tái phát. Bệnh sinh liên quan nhiều đến HPV, nghiên cứu về HPV trong u nhú thanh quản là bước đầu giúp cho việc tìm ra một phương pháp điều trị hiệu quả, triệt để. 2 Tại Việt Nam, UNTQ cũng đã được các nhà lâm sàng Tai Mũi Họng quan tâm và đã được nghiên cứu khá nhiều. Tuy nhiên, hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung vào UNTQ ở trẻ em, trong khi các trường hợp UNTQ ở người lớn ít được đề cập [6],[10]. Các công trình nghiên cứu đều tập trung vào đặc điểm lâm sàng, diễn tiến của bệnh, phương pháp điều trị UNTQ [6],[9],[14]. Những nguyên nhân gây UNTQ cũng đã được đề cập tới trong một số công trình nghiên cứ, song chưa có công trình nghiên cứu nào khẳng định sự hiện diện của HPV trong UNTQ người lớn cũng như mối liên quan của nó với lâm sàng và mô bệnh học. Chính vỡ lớ do trên chúng tôi nghiên cứu đề tài này với hai mục tiêu sau: 1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi trong u nhú thanh quản người lớn. 2. Xác định tỷ lệ nhiễm HPV trong cỏc mụ sinh thiết. Đối chiếu kết quả nhiễm HPV với đặc điểm lâm sàng và kết quả mô bệnh học trong u nhú thanh quản người lớn. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU 1.1.1 Thế giới Vào thế kỷ XVII những triệu chứng của bệnh UNTQ đã được Marcellus Donalus mô tả lần đầu tiên với các triệu chứng lâm sàng khàn tiếng và khó thở. Năm 1863, Wirchow đã tiến thêm một bước khi ông mô tả tổn thương mô bệnh học của u nhú TQ: “Tổn thương u nhú là tổn thương cơ bản của mụ liờn kết”. Sau này khi kính hiển vi quang học ra đời người ta đã biết chính xác về tổn thương mô bệnh học của u nhú TQ: đó là sự quả sản lành tính của các tế bào biểu mô vảy [37]. Đến năm 1923, Uhlman là người đầu tiên nghĩ tới nguyên nhân của bệnh là do virus. Ông đã làm một thử nghiệm cấy ghép và đã thành công khi cấy mảnh u nhú TQ của một bé gái 6 tuổi lên cánh tay của chính em bé đó, rồi lấy mảnh ghộp đú cấy vào âm đạo chó [57]. Năm 1957, Stewart và Eddy đã gây được 23 loại u khác nhau ở chuột, thỏ khi sử dụng virus papiloma lấy ở tuyến mang tai của chuột nhắt. Những phát hiện trên về virus sinh u nhỳ xột trờn góc độ lịch sử có thể được coi là các phát hiện sớm song sự việc gần như chỉ dừng lại ở đó một thời gian khá dài vì không tạo ra được những sao chép (replicates) của HPV trong ống nghiệm. Cho tới tận những năm 70 của thế kỷ 20, sự kiện phát hiện các clon trong virus học phân tử mới làm sáng tỏ dần các HPV có hình thái, chức năng cơ bản gì và từ hiểu biết về virus sinh u nhú ở bò, được triển khai sang người. 4 Từ quan sỏt cỏc tổn thương trên lâm sàng, người ta lý giải các tổn thương đó qua các cơ sở khoa học của y sinh học phân tử kết hợp với hình ảnh vi thể. Năm 1973, Boyle nhờ có kính hiển vi điện tử đã xác định được Human Papilloma Virus (HPV) [22]. Năm 1982, Mounts và Shah KV phân biệt được DNA của HPV ở thanh quản nhờ kỹ thuật lai vết DNA (Sounthern blot DNA hybridization). Vào thời điểm này, do kỹ thuật bị hạn chế nên chỉ làm sạch và mới nhận ra được týp 6 của HPV. Từ đó đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu nói lên sự có mặt của loại virus này trong tổn thương của UNTQ [25], [35]. Hiện nay, đã tìm thấy khoảng 150 typ HPV, trong đó có >50 typ gây bệnh (bao gồm 10 typ gây bệnh ở da và >40 typ gây bệnh ở niêm mạc). Các typ gây bệnh dần dần được xác nhận là có nguy cơ thấp (thường sinh u lành), nguy cơ trung bình (có thể sinh u lành và u ác tớnh) và nguy cơ cao (thường sinh ung thư). Nhóm thường sinh u lành có tới 20 typ, trong đó các typ 6, 11 được quan tâm hơn cả vì thường gõy cỏc u sùi ở vùng hậu môn, dương vật và âm hộ, thanh quản, hạ họng, thực quản. HPV – 6 và 11, cùng trong một nhóm, là hai loại virut chủ yếu gây u nhú ở đường hô hấp. HPV – 6 hiện diện ở cả trẻ em và người lớn, HPV – 11 gặp nhiều ở trẻ em trong các thể nặng [25]. - Nhóm nguy cơ thấp, bao gồm cỏc típ 6, 11, 1, 5, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 19. - Nhóm nguy cơ trung gian bao gồm cỏc típ : 31, 33, 35, 51, 52. - Nhóm nguy cơ cao gồm cỏc típ : 16, 18, 30, 39, 40, 45, 56, 58. 1.1.2 Việt Nam Năm 1960: Nguyễn Văn Đức, bước đầu đưa ra nhận xét qua 26 ca u nhú TQ gặp tại khoa Tai Mũi Họng – Bệnh viện Bạch Mai. Từ năm 1989-1994, Lờ Xuõn Cành áp dụng phương pháp bấm UNTQ thông qua soi thanh quản trực tiếp để điều trị u nhú thanh quản trẻ em [6] Năm 1994 Nhan Trừng Sơn đó cú tổng kết u nhú TQ qua 10 năm (1985- 1994) tại bệnh viện Nhi đồng I Thành Phố Hồ Chí Minh. 5 Năm 2000 tại Hội nghị Tai Mũi Họng Việt Pháp lần thứ V Nguyễn Thị Ngọc Dung và Nguyễn Văn Đức đó cú những nhõn xột ban đầu về bệnh u nhú TQ người lớn tại Trung tâm Tai Mũi Họng ở thành phố Hồ Chí Minh [9]. Năm 2004 Nguyễn Thị Minh Tâm đã nghiên cứu “ Đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học, điều trị u nhú thanh quản người lớn tại viện Tai Mũi Họng Trung Ương” qua luận văn chuyên khoa cấp II. Năm 2005, tác giả Nguyễn Thị Ngọc Dung nghiên cứu về ứng dụng phương pháp nội soi cắt hút trong điều trị u nhú TQ và khảo sát sự liên quan giữa mẹ nhiễm HPV và con mắc bệnh UNTQ [8]. Năm 2007, Đoàn Thị Nguyệt Ánh nghiên cứu ảnh hưởng của mở khí quản trong quy trình điều trị u nhú trẻ em tại viện TMHTW [1]. 1.2. GIẢI PHẪU – SINH LÝ THANH QUẢN 1.2.1. Giải phẫu [3], [11] Thanh quản là một thành phần của ngã tư đường ăn và đường thở. Thanh quản ở vùng cổ giữa, dưới xương móng và đáy lưỡi, ở ngay dưới trước của họng. Phía trên thông với họng miệng và phía dưới với khí quản. Giới hạn trên tương ứng với chỗ giáp đốt sống cổ 5-6, giới hạn dưới ở bờ trên đốt sống cổ 7. Thanh quản được cấu tạo bởi một khung gồm 9 loại sụn khác nhau, liên kết với nhau bởi dây chằng, các khớp và cơ. 1.2.1.1 Khung sụn Có hai loại sụn: sụn đơn (sụn giáp, sụn nhẫn, sụn nắp thanh quản, sụn liên phễu) và sụn kép (sụn phễu, sụn sừng, sụn chêm, sụn vừng, sụn thóc). 1.2.1.2 Các dây chằng và khớp * Các màng và dây chằng - Màng giáp – móng - Màng nhẫn – giáp - Màng nhẫn – khí quản - Dây chằng nhẫn – phễu * Các khớp: khớp nhẫn – giáp, khớp nhẫn – phễu 6 1.2.1.3 Các cơ Thanh quản di chuyển bởi các cơ: lên trên bởi các cơ trõm múng, xuống bởi các cơ dưới móng. Vận động ở trong TQ có 3 loại cơ: - Cơ căng dây thanh hay cơ nhẫn giáp - Cơ mở thanh môn (cơ nhẫn phễu sau). - Các cơ khép thanh môn (cơ nhẫn phễu bên, cơ liên phễu). 1.2.1.4 Cấu trúc trong thanh quản * Niêm mạc thanh quản: Khung sụn TQ, các dây chằng và các cơ bên trong TQ được phủ bởi một lớp niêm mạc, phủ kín khắp lòng TQ như sau: - Biểu mụ lỏt tầng bao phủ bề mặt dây thanh và phần trên tiền đình TQ. - Biểu mô trụ có lông chuyển bao phủ phần còn lại của TQ, tức vùng thanh thất Morgani và vùng dưới thanh môn. - Biểu mô rung động hình trụ không có ở vùng hai dây thanh, dây chằng phễu- nắp TQ, mặt TQ của sụn phễu và khoang liên phễu. Ở các vùng này chỉ có biểu mô phẳng nhiều lớp. - Các tuyến nhày phân bố ở: + Băng thanh thất. + Mặt sau nắp TQ. + Bờ của nếp phễu – nắp TQ. + Mặt dưới của dây thanh. Như vậy, trong niêm mạc TQ có tuyến nhầy và nang lympho. Lớp dưới niêm mạc lỏng lẻo, trừ ở dây thanh, do đó TQ dễ bị phù nề gây khó thở, đặc biệt là ở trẻ em. 7 Hình 1.1. Cấu trúc vi thể dây thanh [5] * Thanh quản được chia làm 3 tầng: - Thượng thanh môn: là tiền đình TQ, giới hạn trước bởi sụn nắp, ở sau bởi các sụn phễu, hai bên bởi các nếp đi chếch xuống từ sụn nắp tới sụn phễu. TQ loe rộng như một cái phễu thông với hầu. + Phía dưới tiền đình là băng thanh thất: hai nẹp nhỏ hơn dây thanh, nằm song song với dây thanh. + Buồng Morgagni: là khoảng rỗng giữa dây thanh và băng thanh thất. - Tầng thanh môn: gồm hai dây thanh, mấu thanh âm và khe thanh môn. + Dây thanh: giống như một cái nẹp đi từ cực trước (góc sụn giáp) ra cực sau TQ (sụn phễu). Cấu tạo gồm 3 lớp: lớp niêm mạc là lớp tế bào Malpighi mỏng bám sát và dây chằng, không có mạch máu; lớp cân và lớp cơ. + Thanh môn: là khoảng cách hình tam giác giữa hai dây thanh. Đầu trước của thanh môn gọi là mép trước, đầu sau gọi là mép sau. Thanh môn là nơi hẹp nhất của TQ. - Tầng hạ thanh môn: từ phía dưới dây thanh đến hết bờ dưới sụn nhẫn Kích thước thanh môn: Sơ sinh 1 tuổi 10 tuổi Người lớn 4,5 – 5,6 mm 7 mm 9 -10 mm 12 – 15 mm 8 Kích thước hạ thanh môn: Sơ sinh 5 -6 mm 1 tuổi 10 mm 10 tuổi 12 mm Người lớn 13 – 18 mm Hình 1.2: Hình ảnh thanh quản [13]. 1.2.1.5. Mạch và thần kinh thanh quản * Động mạch: có 3 ĐM cho mỗi nửa TQ - Động mạch thanh quản trên - Động mạch thanh quản giữa - Động mạch thanh quản dưới * Tĩnh mạch: đi theo đường đi của động mạch, quy về tĩnh mạch giáp trạng trên và dưới. * Bạch mạch: các ống bạch huyết của TQ đổ về dãy hạch cảnh ngang tầm thõn giỏp lưỡi mặt và hạch trước TQ. 9 * Thần kinh: TQ được chi phối bởi dây TK X và dây giao cảm - Dây X: tách ra dây TQ trên (phần lớn để cảm giác) và dây TQ dưới (vận động) + Dây TQ trờn: tỏch ở cực dưới của hạch gối, khi tới ngang mức xương móng chia làm hai nhỏnh: nhỏnh trên cùng ĐM thanh quản trên xuyên qua màng giỏp múng vào TQ; nhánh dưới vận động cho cơ nhẫn giáp và cảm giác ở tầng dưới TQ. + Dây thần kinh quặt ngược: vận động tất cả các cơ TQ trừ cơ nhẫn giáp. - Thần kinh giao cảm: tách ở hạch giao cảm cổ giữa, hạch này là trung tâm vận mạch của TQ. Hình 1.3: Mạch và thần kinh thanh quản [13]. 1.2.2 Sinh lý thanh quản[11], [15] Thanh quản có 4 chức năng: thở, bảo vệ đường thở dưới, phỏt âm và nuốt. 1.2.2.1 Thở - Khi thở hai dây thanh được kéo xa khỏi đường giữa làm thanh môn được mở rộng để không khí đi qua, động tác này được thực hiện bởi cơ mở 10 (cơ nhẫn phễu sau). Do đó, mỗi khi liệt cơ mở hoặc co thắt cơ khép, hoặc phù nề TQ, u nhú TQ thỡ lũng TQ sẽ hẹp lại và bệnh nhân khó thở. - Hai dây thanh mở ra và khép lại theo nhịp thở được điều chỉnh bởi hành tủy. 1.2.2.2 Bảo vệ đường thở dưới: được thực hiện nhờ hai phản xạ: - Phản xạ đóng thanh môn - Phản xạ ho 1.2.2.3 Phát âm Thanh quản là một trong những cơ quan giữ phần cơ bản của chức năng nói hay phát âm, gồm 3 phần: - Thổi: nhờ cử động lồng ngực, tạo nên một luồng không khí đi từ phổi, khí, phế quản lên, tạo ra luồng khớ cú một áp lực và trong một thời gian nhất định. - Rung (khép và rung động dây thanh): + Hai dây thanh được khép lại. + Niêm mạc dây thanh được rung động nhờ luồng khí thổi tạo áp lực dưới thanh mụn đó gây nên độ căng dây thanh. + Độ căng dây thanh do các cơ căng dây thanh, chủ yếu là cơ nhẫn giáp. + Âm thanh trầm hay bổng phụ thuộc độ căng nhiều hay ít của dây thanh. Vì vậy, khi có bất kỳ nguyên nhân nào (phù nề niêm mạc, u . . .) làm cho dây thanh khộp khụng kớn sẽ gây nên khàn tiếng. - Cộng hưởng: nhờ các hốc trên thanh môn (TQ, họng, miệng, mũi). 1.2.2.4 Nuốt Thanh quản bảo vệ không cho thức ăn rơi vào đường hô hấp dưới khi chúng ta ăn uống. Sự bảo vệ này được thực hiện nhờ các cơ siết họng kéo sụn nhẫn về phía sau trên làm thanh quản nhô lên và nghiêng về phía trước, húc vào thanh thiệt. Thanh thiệt vừa bị sụn giáp đẩy lên, vừa bị xương móng giữ 11 lại sẽ bẻ gập ở đoạn giữa và cúi xuống che đậy lỗ thanh quản. Phản xạ này là một trong 4 thì của phản xạ nuốt. 1.3 Mễ BỆNH HỌC CỦA U NHÚ THANH QUẢN 1.3.1 Đại thể [2],[60] Theo phân loại mô học các u thanh quản, hạ họng và khí quản của Tổ chức y tế thế giới năm 2005 [60], UNTQ được định nghĩa như sau: UNTQ là một u lành tính thường gặp của biểu mô vảy. Hình ảnh giống ngón tay hoặc hỡnh lỏ, cú dạng mảng, cục sùi, đơn độc hoặc từng chùm nhô ra ngoài hoặc lấn vào trong lòng thanh quản. Vị trí thường ở những vùng cơ thể phủ thượng bì hoặc phủ biểu mô trụ. U nhú cũng có thể là hình ảnh giống quả dâu tây, thường to, choán một phần thanh quản. Bề mặt màu đỏ xỏm, lựi sựi mọc từng chùm hoặc là những đỏm sựi giống súp lơ mầu hồng có thể có cuống hoặc không có cuống. Trên mặt cắt, mô u nhú có hình ảnh nhiều múi. Trong mỗi mỳi cú một vùng màu đỏ ở trung tâm (trục mạch) được bao quanh bởi một vùng tương đối sáng hơn (mô liên kết). Mô u nhú thường có mật độ mềm, liên kết tế bào không chặt chẽ, dễ chảy máu. Do đó khi mô u nhú phát triển có thể làm cho bệnh nhân hít phải dịch mỏu, mụ u rơi xuống đường hô hấp dưới gây khó thở đột ngột. Hỡnh1.4 .Đại thể của u nhú [60]. Hỡnh1.5. Đại thể của u nhú đảo ngược [60]. 12 1.3.2. Vi thể u nhú [2], [60] Hình ảnh vi thể của u nhú nói chung, UNTQ nói riêng dễ nhận biết. Có 2 loại chính: - U nhú thông thường (Không liên quan tới HPV): Những u nhú này hình thành cỏc nhỳ nhụ cao lên bề mặt biểu mô. Kích thước cỏc nhỳ có thể không đều. Cấu trúc vi thể chung bao gồm nhiều hàng tế bào vảy quá sản lành tính vây quanh cỏc lừi trục liên kết xơ mạch. Các tế bào này hình tròn hay đa diện, đứng sát nhau, có liên kết chặt chẽ, không xâm nhập và không phá vỡ màng đỏy. Nhõn tế bào hình tròn, nhỏ, đều nhau, nằm giữa bào tương. Chất nhiễm sắc mịn, màng nhân đều, không có nhân bất thường. Trong mô đệm, ngoài mô liên kết xơ, các mạch máu còn có thể thấy xâm nhập một số tế bào viêm một nhân. - U nhú do HPV: Các u nhỳ cú nguyên nhân do HPV còn được gọi dưới một tờn khỏc là Condyloma. Các condyloma có 3 hình thái: Condyloma phẳng (Flat condyloma), condyloma nhọn đỉnh (Acuminatum codyloma) và coondyloma đảo ngược (Inverting condyloma). + Condyloma phẳng: Các tế bào bóng rất rõ ở vùng trung gian hay ngoại vi, màng bào tương dày, rõ khi nhuộm PAS và có kết hợp nhõn khụng điển hình nhẹ ở 1/3 dưới bề dày của biểu mô vảy, tương ứng loạn sản nhẹ. Các tế bào bóng (Koilocyte, balloon cell) là các tế bào vảy có kích thước lớn, dạng phồng, rỗng, nhân tế bào tăng sắc, không có hạt nhân, quanh nhõn cú một quầng sáng, bào tương sáng, màng bào tương và màng nhân rất dầy. Rải rác có tế bào cận sừng và loạn sừng. Mô đệm tăng sinh mạnh hơn so với mô đệm của u nhỳ, cú xâm nhập nhiều tế bào viêm một nhân. + Condyloma nhọn đỉnh: Mô liên kết xơ – mạch và tế bào vảy phát triển mạnh làm thành những nhú cao nhô lên bề mặt biểu mô vảy như u nhú, thấy rõ tế bào bóng ở 2/3 trên bề dày biểu mụ kốm quỏ sừng, loạn sừng ngoại vi hoặc tế bào vảy làm thành nhú chui sâu vào mô đệm với ít tế bào bóng nhưng nhiều nhõn khụng điển hình. + Condyloma đảo ngược: là một dạng của condyloma, u khụng phỏt triển lồi lên trên mà phát triển lấn sâu vào trong mô đệm. Cấu trúc của u gồm 13 cỏc nhỳ xâm nhập mô đệm với sự quá sản mạnh của các tế bào vảy, nhiều tế bào búng, kốm nhiều ổ tế bào viêm mạn tính. - Như vậy, sự xuất hiện những tế bào không điển hình ở người lớn cần phải được xem xét một cách cẩn trọng, bởi vì hình ảnh này xuất hiện có nguy cơ biến đổi thành ác tính. Đôi khi thấy có loạn sản ở các mức độ khác nhau; loạn sản toàn bộ lớp niêm mạc cũng làm ta nghĩ đến ung thư biểu mô dạng vảy. Loạn sản chia làm 3 mức độ: + Loạn sản nhẹ: tế bào không điển hình chiếm 1/3 dưới của thanh quản. + Loạn sản vừa: tế bào không điển hình chiếm 2/3 dưới của thanh quản. + Loạn sản nặng: tế bào không điển hình chiếm toàn bộ thanh quản. Có nhân quỏi, nhõn chia điển hình. Loạn sản là một yếu tố tiên lượng quan trọng. Mối nguy cơ chuyển thành ác tính sẽ tăng nếu có loạn sản ở người hút thuốc lá [20], [60]. Hình 1.6. Condyloma phẳng. Lớp tế bào vảy quá sản nhưng không tạo nhú, trong lớp biểu mô vảy có nhiều tế bào bóng (mũi tên) [60]. Hình 1.7. Condyloma đảo ngược. Lớp tế bào vảy quá sản nhưng tạo nhú chui sâu xuống mô đệm (mũi tên) với các tế bào vảy quá sản [60]. 14 Hình 1.8. U nhú tế bào vảy. Các tế bào vảy quá sản thành nhú nhô lên bề mặt biểu mô [60] 1.4. HUMAN PAPILLOMA VIRUT VÀ U NHÚ THANH QUẢN 1.4.1. Cấu trúc của HPV [4],[8],[17] HPV thuộc họ Papovaviridae, họ này gồm 2 tộc: Polyomavirus và Papillomavirus. Papillomavirus là những virus hiện nay rất được quan tâm, nó được coi là đóng vai trò quan trọng gây ung thư cổ tử cung, sinh u nhú ở thanh quản, đường hô hấp, thực quản... Cấu trúc là một khối cầu, đường kính 55nm, tạo nên bởi hai chuỗi DNA xoắn đôi với 7900 cặp nền bao quanh bởi một vỏ 20 bề mặt gồm 72 phần tử capsomer (60 dạng lục giác và 12 dạng ngũ giác) được bố trí theo dạng lưới. Có hai loại vỏ capsid protein, loại lớn mã hóa là L1 và loại nhỏ là L2. - Bộ di truyền của chúng gồm các gen phiờn mó chủ yếu cho sự nhân đôi của DNA trong giai đoạn sớm (E1-E7) và gen phiờn mó cho vỏ capsid trong giai đoạn muộn hơn (L1-L2). Những gen này quyết định sự phiờn mó trong quá trình nhân lên của virus. Các gen này đều nằm trên sợi DNA bổ sung. Gen của HPV có thể tồn tại ở dạng plasmid tự do hoặc tích hợp vào DNA tế bào lớp đáy và tái hoạt động khi có điều kiện. Sự nhân lên của HPV phụ thuộc vào cơ chế phiờn mó của tế bào biểu mô da hay niêm mạc. 15 Ngoài ra hệ gen này cũn cú vựng kiểm soát lâu dài (LCR) hay vùng điều chỉnh nguồn (URR) chứa nguồn gốc của sự sao chép DNA và các yếu tố kiểm soát sự phiờn mó và sao chép. Kết quả của quá trình sao chép là sự thay đổi của tế bào biểu mô và tạo nên thương tổn dạng nhú. HPV nằm trong nhân của các tế bào biểu mụ trờn bề mặt. Càng nhiều HPV thì thương tổn càng sùi, dầy và phát triển nhanh. Hình 1.9. Cấu trúc của Human Papilloma Virus ( Hình trích dẫn từ www.ecplanet.com) 1.4.2. Cơ chế sinh bệnh - Khi bị lây nhiễm, HPV bám vào bề mặt của các tế bào biểu mô vảy ở bề mặt ngoài và tế bào biểu mô trụ của lớp đáy. Vỡ cỏc tế bào vảy ngoại vi ít nhiều sừng hoá và các tế bào này lại liên kết với nhau bởi các thể chằng (desmosomes) khá chắc nên khả năng tiếp xúc và tích hợp gen của HPV với các gen điều chỉnh sự phân chia, phát triển tế bào cũng như chết tế bào của biểu mô vảy là vô cùng hạn chế. Chính vì thế, khi bị nhiễm HPV ở lớp biểu mô của thanh quản để gây bệnh, vùng biểu mô này thường cú loột từ trước và các gen của HPV có nguy cơ cao dễ bám vào các tế bào trụ (đáy) của lớp biểu mô và dễ dàng nhân lên. HPV sẽ xem các tế bào như ký chủ cho chu kỳ sinh sản của chúng. Trước hết DNA của virut sẽ được nhân đôi bởi các gen E1 và E2 trong nhân tế bào. E2 trong giai đoạn này là gen điều hòa chủ yếu. Sự phiờn mó của các gen khác như E6, E7 thì bị ức vỡ cú kết nối với vùng điều 16 hòa URR. Ngược lại các gen chậm L1, L2 chỉ phiờn mó tại chỗ. Biểu hiện hoạt động của L1, L2 là lớp tế bào sừng hóa ở lớp nông của da. HPV thường chỉ phát triển ở tế bào biểu mụ lỏt tầng, nơi tiếp giáp với tế bào lông chuyển hoặc ở vùng tế bào loạn sản do chấn thương. Những nghiên cứu về cơ chế sinh u của virus, người ta nhận thấy rằng: nhiều virus sinh u gây hiện tượng nhiễm virus dai dẳng ở người và để làm được điều đó, các virus phải lẩn tránh được sự phát hiện của hệ thống miễn dịch của cơ thể nhằm loại bỏ virus. Để lẩn tránh hệ miễn dịch, HPV đó gõy nhiễm ở vị trí mà đáp ứng miễn dịch không thể tiếp cận được. - Khi virut đã nhiễm vào tế bào thì thời gian tiềm tàng là từ 1-8 tháng. Thời gian để thương tổn đầu tiên phát triển là từ 3-6 tháng. Đây là giai đoạn tốt nhất để bắt đầu điều trị. Phương pháp nhằm tiêu diệt tế bào để phóng thích HPV cho hệ thống miễn dịch nhận diện và phương pháp nâng cao sức đề kháng miễn dịch của cơ thể, đều có tác dụng làm gia tăng sự nhận biết của hệ thống miễn dịch của cơ thể đối với virut. - Một khi hệ thống miễn dịch của cơ thể đó cú đáp ứng, cơ thể bước vào giai đoạn kiềm chế từ 3-6 tháng, lúc này hệ thống đáp ứng miễn dịch đã kiểm soát được virut. Trong giai đoạn này điều trị thường có kết quả bởi vì các thương tổn một khi đã bị lấy hết thỡ ớt tái phát. Đến giai đoạn toàn phát, nếu các thương tổn tiếp tục phát triển ồ ạt trong lúc đang điều trị, thì tốt nhất là sử dụng các phương pháp điều trị ít tốn kém và ớt gõy thương tổn nhất và sử dụng phương pháp kích thích sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể để giúp khống chế các thương tổn nhanh hơn. Giai đoạn cuối là giai đoạn mà 10%20% các bệnh nhân bước vào thời kỳ thương tổn kéo dài hoặc tái phát nhiều lần và giai đoạn này rất khó điều trị [25]. 1.4.3. Đường lây truyền Trong nhiều thập niên, y học đã mô tả rõ những tổn thương mụn cơm, mụn cóc, đặc biệt các tổn thương sùi mào gà ở da, thường gặp và biểu hiện rõ, điển hình ở dương vật, âm hộ, hậu môn và vì thế từ lâu người ta đã biết HPV lây truyền 17 qua đường da và phổ biến nhất qua đường tình dục và dĩ nhiên, bệnh xuất hiện không chỉ ở cơ quan sinh dục ngoài mà ở tất cả những nơi có liên quan trực tiếp hay gián tiếp (âm đạo, cổ tử cung, hậu môn, đường niệu, bàng quang); sờ mó, hôn, đồng tính luyến ái, quan hệ miệng – sinh dục gây lây nhiễm qua niêm mạc miệng và từ đó, có thể lan tới vùng mũi, họng, thanh quản, hạ họng, đường hô hấp trên và thực quản…và có thể còn ở các định vị khác chưa xác định được. Con đường lây truyền HPV được thể hiện ở sơ đồ dưới đây. ÂM ÂM CỔ HỘ ĐẠO TỬ CUNG SINH DỤC NỮ Đường Lây DA DƯƠNG VẬT NIỆU ĐẠO HẬU MÔN MẮT TAI MŨI HỌNG MIỆNG HÔ HẤP TRÊN THỰC QUẢN Hình 1.10: Các đường lây truyền của HPV [8] 1.4.3.1.Đối với u nhú thanh quản trẻ em - Lây truyền từ mẹ: Có BN mắc ở lứa tuổi rất nhỏ, có gải thuyết cho rằng có sự lây truyền ở đường hô hấp là do trẻ hớt cỏc thương tổn mồng gà của mẹ lúc sinh. Cả hai bệnh tích u nhú và mồng gà đều do virut HPV gây ra, nhất là nó lại cùng loại virut HPV-6 và HPV-11 [40]. - Lây truyền từ mục cóc ngoài da: theo Brocker và Wiatrak, bệnh u nhỳ cú sự liên quan đến mụn cóc ngoài da, trong 45 ca u nhú nghiên cứu có đến 32 ca bị mụn cóc ngoài da [59]. 18 1.4.3.2.Đối với u nhú thanh quản người lớn Sự lây truyền có thể qua sinh hoạt tình dục qua đường miệng. Có đến 10% nam và nữ đã sinh hoạt tình dục xét nghiệm có HPV dương tính ở dương vật và cổ tử cung, chứng tỏ rằng virut ở dạng tiềm tàng và có thể phát bệnh do lây truyền [7], [17]. 1.4.4.Cơ chế ác tính hóa - Sự ung thư hóa xảy ra khi viêm nhiễm tức thời chuyển thành viêm nhiễm dai dẳng. Điều này được nghiên cứu kỹ trong ung thư cổ tử cung. Lúc này, các gen E1 và E2 thường xâm nhập vào hệ gen của các tế bào chủ. Hoạt động của các gen sớm (E) tăng lên trong khi các gen muộn (L) gần như không hiện diện. E6 và E7 không còn bị ức chế sẽ phối hợp hành động với 2 gen ngăn chặn của tế bào chủ là p53 và pRB. P53, kết hợp với E6 sẽ mã hóa một protein ngăn chặc sự sao chép của tế bào bằng cách làm thay đổi các DNA của chúng. Vì sự rối loạn chức năng của p53, sự điều hòa bị mất và các tế bào với DNA thay đổi có thể nhân lên không có sự ngăn chặn và tạo nên những nhóm tế bào u chồng lên những tế bào lành. Như vậy, hiện tượng ung thư hóa xảy ra khi có sự liờn kết chặt chẽ của E6 và p53 [25]. - Hiện nay các điều tra dịch tễ học về HPV càng ngày càng cho thấy HPV có vai trò chính trong sự phát triển của ưng thư cổ tử cung. Ngoài ra nó cũng là nguyên nhân sinh bệnh của các bệnh lý ác tính khác ở vùng thanh, khí, phế quản và phổi [17]. Đối với trẻ em, sự ác tính hóa thường xảy ra khi u nhỳ đó xâm lấn vào nhu mô phổi hoặc đối với những trường hợp xạ trị trên thanh quản thì u có khả năng ung thư 18-20 năm sau. Đối với người lớn, khả năng ác tính hóa của u nhú cao hơn gấp nhiều lần [6]. 1.4.5. Xác định HPV bằng phương pháp PCR Kary Mullis là người tìm ra kỹ thuật PCR vào năm 1985. Polymerase Chain Reaction (PCR), là phản ứng khuyếch đại sự tổng hợp acid nucleic 19 bằng enzym polymerase, đang được sử dụng rộng rãi tại các phòng nghiên cứu về sinh học phân tử trên thế giới. 1.4.5.1.Nguyên lý phản ứng PCR [12],[16], [36] Phản ứng PCR được xây dựng dựa trên nguyên lý phân chia tế bào nghĩa là khi tế bào phân chia để tạo ra hai tế bào con thì DNA trong nhân tế bào được nhân đôi lên để phân phối cho hai tế bào con. Để tổng hợp được hai sợi bổ sung cho hai sợi DNA mẹ thì phân tử DNA mẹ cần phải được tháo xoắn thành hai sợi đơn, cần đoạn oligonucleotid mồi (primers) và sự tổng hợp những sợi DNA Polymerase. Phản ứng này sẽ làm tăng số lượng một đoạn DNA đặc hiệu có những nucleotid mang thứ tự đã biết trước. Phản ứng xảy ra qua ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: Phân tử DNA sợi đôi được tách rời thành hai sợi đơn dưới tác dụng của nhiệt độ cao 92-960C, các sợi đơn duỗi ra bộc lộ đoạn DNA đặc hiệu, gọi là chuỗi đích, và đoạn này sẽ được nhân lên trong quá trình xảy ra phản ứng. - Giai đoạn bắt cặp: Là giai đoạn liên kết giữa những đoạn mồi với chuỗi đích ở nhiệt độ 45-550C, sự liên kết này xảy ra theo nguyên lý bổ sung đôi base. - Giai đoạn kéo dài: Là sự tổng hợp sợi DNA bổ sung ở nhiệt độ 70-720C: Các đoạn mới sẽ được kéo dài dưới tác dụng của enzym DNA Polymerase để tạo ra những sợi bổ sung với sợi đích. Sau ba giai đoạn biến tính, bắt cặp và kéo dài (được gọi là một chu kỳ), về mặt lý thuyết thì lượng DNA được tăng lên gấp đôi. Chu kỳ này sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, sản phẩm của chu kỳ này sẽ được dùng làm mẫu cho chu kỳ kế tiếp, do đó mỗi chu kỳ kế tiếp sẽ nhân đôi lượng sản phẩm DNA của chu kỳ trước lên. Kết quả là sản phẩm sẽ tăng lên một cách lũy tiến. Như vậy sau n chu kỳ thì lượng DNA sẽ là 2n. 20 1.4.5.2. Nguyên liệu dùng trong phản ứng PCR - Mồi (primers): Các đoạn mồi xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20-30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản. - Dung dịch đệm: Dung dịch đệm chuẩn dùng cho phản ứng PCR gồm: KCL 50mM; Tris 10mM (pH 8.3); MgCL2 1.5mM. - Taq DNA Polymerase: Phương pháp PCR ngày nay đã được thực hiện dễ dàng nhờ sự phát hiện một loại DNA Polymerase chịu nhiệt được chiết tách từ vi khuẩn Trermus aquaticus sống ở suối nước nóng. Enzym này được gọi là Taq Polymerase, không bị hủy ở nhiệt độ biến tình và có tác dụng xúc tác sự tổng hợp DNA từ đầu đến cuối phản ứng. Enzym được dùng ngày nay thường là loại enzym được tổng hợp theo phương pháp tái tổ hợp từ enzym ở E.coli. - Deoxyribo nucleosid triphosphat (dNTPS): Gồm có dATP, dGTP, dTTP và dCTP, được dùng ở nồng độ 20-200àM cho mỗi loại dNTP. - DNA mẫu: DNA mẫu có chuỗi đích thường ngắn (vài trăm đôi base). Ưu điểm lớn của phương pháp PCR là có thể khuyếch đại được cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần trong các vết máu lâu ngày, tinh dịch đó khụ, hóa thạch, tóc, móng tay của người chết. 1.4.5.3. Vai trò của mồi (primers) Mồi là những đoạn oligonucleotides dài khoảng 20-30 bases có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA mà nhà nghiên cứu muốn nhân bản. Mồi giữ vai trò quyết định để polymerase tổng hợp được sợi bổ sung để có thể trượt được trên sợi khuôn tổng hợp bổ sung, polymerase phải nhận diện được nucloeotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp với một nucleotide ở sợi khuôn. Nếu không có mồi hay nucleotide ở đầu 3’ của mồi không bắt cặp được với một nucleotide trên sợi khuụn thỡ polymerase không nhận diện được đầu 3’ của