Tài liệu Công nghệ sản xuất enzyme papain

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TIỂU LUẬN KĨ THUẬT THỰC PHẨM III ĐỀ TÀI: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PAPAIN NHÓM SV THỰC HIỆN: MÃ SV: 1.NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG 3005100260 2.NGUYỄN THỊ KIM TUYẾN 3005100886 3.NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN 3005100905 4.ĐỖ THỊ HIỆP 3005100224 5.LÊ THỊ NGHĨ 3005100468 GVHD: TRẦN THỊ MINH HÀ TP.Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm ….. MỤC LỤC CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................. .3 CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN ...................................................... 4 2.1Giới thiệu về cây đu đủ.................................................................................. 4 2.1.1. Phân bố sinh thái của cây đu đủ ........................................................... 4 2.1.2.Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ ..... 5 2.2 Giới thiệu về enzyme papain......................................................................... 6 2.2.1 Nguồn gốc ............................................................................................ 6 2.2.2 Tính chất của papain ............................................................................. 6 2.2.2.1 Tính chất vật lý ........................................................................... 6 2.2.2.2 Tính chất hóa học ....................................................................... 7 a) Cấu tạo hóa học: ............................................................................................ 7 b) Cấu trúc không gian ....................................................................................... 8 c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain ................................................................ 8 d) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain ................................ 11 CHƯƠNG III: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PAPAIN ................... 13 3.1 Nguyên liệu ................................................................................................ 13 3.2 Thiết bị ………………………………………………………………………………………………………. 13 3.3 Quy trình công nghệ……………………………………………………………………………………. 13 3.3.1 Thu nhận papain………………………………………………………………................. 15 3.3.2 Sơ đồ quy trình công nghệ……………………………………………………………….. 16 3.4 Ứng dụng của enzyme papain……………………………………………………………………… 18 3.4.1 Trong y học………………………………………………………………………………………. 18 3.4.2 Trong công nghệ thực phẩm…………………………………………………………….. 18 3.4.3 Trong công nghệp khác ……………………………………………………………………. 18 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………… 19 CHƯƠNG V: TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………. 20 Nhóm 4 Trang 2 CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase. Papain là một enzym đƣợc lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh. Ngoài ra, papain còn là một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn. Nó có thể giúp phân giải và loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể. Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi trƣờng hơi kiềm hay trung tính. Ở nhiệt độ thƣờng khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt. Trung bình một trái đu đủ cho đƣợc 12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tƣơi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất ngày càng nhiều và đƣợc sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực nhƣ: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân đƣợc sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Với những lợi ích và giá trị mà enzyme papain đem lại , nó đƣợc ứng dụng rộng rãi và thƣờng đƣợc dùng trong lĩnh vực chế biến mỹ phẩm. Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dƣợc phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm...Và đó chính là nguyên nhân đã đƣa nhóm em đến với đề tài trình bày về công nghệ sản xuất enzyme papain. Nhóm 4 Trang 3 CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ Cây đu đủ còn đƣợc gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thƣờng là cây đồng chu, nhƣng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phƣơng diện giới tính: cây đực, cây lƣỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lƣỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hƣớng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ nhƣ khô hạn và thay đổi nhiệt độ. Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac. Hoa lưỡng tính hoa cái hoa đực 2.1.1 Phân bố sinh thái của cây đu đủ. Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, ngƣời Tây Ban Nha đã đƣa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nƣớc Đông Nam Nhóm 4 Trang 4 Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục đƣợc trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dƣơng và châu Phi. Vườn cây đu đủ 2.1.2 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da. 2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, ngƣời ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lyamip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan. 3. Ở Samoa, ngƣời dân dùng phần dƣới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng. 4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Ngƣời dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lƣợng lớn thịt cá nhƣng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó. 5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm nhƣ kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu. Nhóm 4 Trang 5 6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dƣơng (gram-positive bacteria). Nó còn đƣợc dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain đƣợc dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trƣớc khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, ngƣời ta tiêm papain vào gan trƣớc khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho đƣợc khoảng 650g papain. 2.2 Giới thiệu về enzyme papain 2.2.1 Nguồn gốc Enzyme papain đƣợc tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, thuộc nhóm enzyme thủy phân có nguồn gốc thực vật đƣợc nghiên cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động. Papain là một sulfhydryl protease, lần đầu tiên đƣợc tách ra bởi Bals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel va Smith từ nhựa khô. Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác nhƣ chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brocklehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lƣợng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm. 2.2.2 Tính chất của papain 2.2.2.1 Tính chất vật lý Bảng 1: Tính chất vật lý của papain Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13 Phân tử lƣợng 20,700 Nhóm 4 Trang 6 Độ triền quang [α]D -66.70 Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16 Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phƣơng pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhƣng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt. 2.2.2.2. Tính chất hóa học a) Cấu tạo hóa học: Papain là một endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là một protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lƣợng phân tử là 20.900 Dalton. Bảng 2: Thành phần hóa học: Amino acid Alanine Arginine Aspartic acid Half – Cysteine Glutamid acid Glycine Histidine Isoleucine Leucine Số lƣợng Amino acid 13 Lyeine 10 Proline 17 Serine 6 Threonie 17 Tryptophan 23 Tyrosine 2 Valine 10 Methionine 10 Tổng cộng: 185 Số lƣợng 9 4 9 11 7 5 17 15 0 Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain đƣợc cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lƣợng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 Nhóm 4 Trang 7 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25. b) Cấu trúc không gian Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thƣớc 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. Cấu trúc không gian của enzyme papain Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ƣu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 570C. c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain Nhóm 4 Trang 8 - Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. - Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys. - Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống nhƣ của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau. Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys. Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser. Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng: Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa nhƣ endopeptidase vừa nhƣ exopeptidase. Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid: Nhóm 4 Trang 9 (-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH  (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)-CO-)k i+k=n Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid (H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH  (H2N-CH(R)COOH)n` + (H2N-CH(R)-CO-)k n`+k = n So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxy tự do. Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chất peptide của mình và sẽ ƣu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine nhƣ sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhƣng nếu peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trƣớc đầu tận cùng) thì không đƣợc thủy phân bởi papain. Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase. Hoạt hóa papain: Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đƣa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử nhƣ cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. hki có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain đƣợc phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu đƣợc hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ. Bất hoạt: Nhóm 4 Trang 10 Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa nhƣ: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain hầu nhƣ không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m). d) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu đƣợc nhiệt độ tƣơng đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 1000C. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.50C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>1000C) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lƣợng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn. Điều đáng lƣu ý là sau khi đã đƣợc tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng. Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng là 370C. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 1150C trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì đƣợc 90%. Nhóm 4 Trang 11 pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tƣơng đối rộng từ 4.5-8.5 nhƣng lại dễ biến tính trong môi trƣờng acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trƣờng kiềm mạnh có pH > 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ƣu sẽ khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ƣu là 7-7.5. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme đƣợc ổn định, có thể chịu đƣợc các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút. Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng nhƣ thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh nhƣ TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain. Nhóm 4 Trang 12 CHƯƠNG III: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PAPAIN 3.1 nguyên liệu - Nguyên liệu chính thức và cần hàm lƣợng lón nhất là nhựa trái đu đủ thu nhận từ các vƣờn đu đủ. - Celite. - NaOH - Cát sạch - (NH4)2SO4 - Muối NaCl (rắn và lỏng) vườn đu đủ trồng lấy nhựa 3.2 thiết bị - Cối - Thiết bị lọc - Thiết bị lắng - Thiết bị sấy 3.3 Quy trình công nghệ Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A( gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B(gốc amino aicd là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới 95%. Nhóm 4 Trang 13 Điều kiện lấy nhựa : - Cây đang sinh trƣởng tốt, không bị sâu bệnh,thân cây mập mạp cho nhựa nhiều. - Quả : lấy ở những quả còn xanh,vỏ mịn,từ 0.3 – 1kg,độ 10 tuần tuổi là tốt nhất. - Thời gian lấy nhựa : sáng sớm Cách tiến hành : - Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây,dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đƣờng dọc theo quả ở chỗ đƣờng kính cao nhất,các lác khía cách nhau 3 -5cm(không rạch sâu quá 2cm để dịch nƣớc và tinh bột từ quả không bị trộn lẫn vào nhựa làm giảm chất lƣợng nhựa). - Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng 4-6 phút, lấy nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ các công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào. Lƣu ý : - Không nên trộn nhựa khô và nhựa tƣơi vì sẽ làm giảm chất lƣợng nhựa - Quả có thể đƣợc ƣớp nhựa trong suốt 4 – 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần một rạch là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 – 3 đƣờng giữa những đƣờng rạch trƣớc đó. - Cần tránh không cho nhựa tƣơi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng.không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng nhƣ sắt, đồng,…vì sẽ làm biến màu và giảm hoạt tính Nhóm 4 Trang 14 enzyme. Lọ, dao, muỗng,…phải đƣợc làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ. - Nhựa tƣơi không bền vì thế nên sấy khô 5 % ẩm. 3.3.1 Thu nhận papain  Chuẩn bị: Do trong nhựa đu đủ ngoài papain, chymopapain còn có 1 số enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác để có đƣợc quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ tạp chất. cách làm nhƣ sau: Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0.054M, kiềm đƣợc sử dụng để đƣ pH dịch chiết tới 5.7) Khi nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích đƣợc lặp lại với 300mL dung dịch cysteine. Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích chiết lên 11. Dịch huyền phù sau cùng đƣợc lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nƣớc lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7. Các bƣớc còn lại của quá trình tinh sạch enzyme đƣợc tiến hành trong điều kiện lạnh.  Loại bỏ các chất không tan pH9: Thêm từ từ và khuấy đều 1 lƣợng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dịch chiết thu đƣợc ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong.  Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4: Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/ phút. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại lấy Nhóm 4 Trang 15 chymopapain. Tủa đƣợc rửa lại 1 lần nữa với 400-500ml dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hòa.  Quá trình phân đoạn bằng NaCl: Hòa tan trong 600mL dung dịch cysteine 0.02M, dung dịch thu đƣợc có pH 7- 7.5 sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau 1 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dich lỏng.  Kết tinh Hòa tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0.002M ở nhiệt độ phòng đƣợc 1 dung dịch huyền phù có pH = 6.5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể.  Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu đƣợc ở bƣớc trên trong nƣớc cất nhiệt độ phòng tạo dung dịch có nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ ( đồng thời khuấy đều) dung dich NaCl bão hào ( 10mL/ 300mL dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch huyền phù đƣợc giữ ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ thu nhận tinh thể. Hoạt động riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm 1 lần nữa nhƣ trên. Để tăng hoạt tính enzyme, trƣớc khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0 và đem kết tinh dịch lỏng thu đƣợc sau siêu lọc.  Sấy chân không Sấy chân không ở nhiệt độ 400C thu nhận papain tinh chế. 3.3.2 Sơ đồ quy trình công nghệ Nhóm 4 Trang 16 Nguyên liệu 180g nhựa đu đủ Celite(100g) 200-300m dd cysteine Nghiền 0.04M pH: 5.7 Cát sạch(150g ) 110mlNaOH 1M Trích ly Bã Lọc Bã Chỉnh pH Lọc (NH4 )2 SO4 Kết tủa phân đoạn 1 Ly tâm 1 60g NaCl rắn Kết tủa phân đoạn 2 Tủa xám Thời gian: 1-2 giờ 400-500ml (NH4)2SO4 Dịch lỏng pH : 7-7.5 thời gian: 1 giờ Ly tâm 2 Kết tinh Dịch lỏng pH: 6.5 Thời gian: 30phút dd NaCl bão hòa Tái kết tinh Sấy chân không t: 37 0C t: 40 0 C Papain. sơ đồ quy trình công nghệ Nhóm 4 Trang 17 3.4 ứng dụng của enzyme papain. 3.4.1 Trong y học: Chữa bệnh giun kim, gium đũa. Dùng tiêu diệt các dị vật thừa, các protein chết trong cơ thể. Hỗn hợp papain-bromelin-celluloza đƣợc sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận. Làm thành phần chính của các loại thuốc trị bệnh biếng ăn, ăn không tiêu. Làm 1 sổ vi trùng gram (+) và gram (-) ngƣng phát triển, vi trùng thƣơng hàn, Staphylococus rất nhạy cảm với papain. Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: Dung dịch papain cysteine salicilate có công dụng chữa bỏng. Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng… 3.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm: - Protease, trong đó có papain đƣợc sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thịt, cá và đã mang lại hiệu quả kinh tế cao. Với phƣơng pháp này, ngƣời ta có thể biến đổi những loại thịt cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn. - Papain còn đƣợc dùng để thủy phân protein và ngăn ngừa vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ tối ƣu của nó là 700C. - Papain đƣợc dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc bổ. Papain còn đƣợc dùng trong sản xuất bia vì nó giúp tiêu hóa các protein còn hòa tan trong bia. 3.4.3 Trong các ngành công nghiệp khác: - Papain đƣợc dùng làm mềm da trong ngành công nghiệp thuộc da, dùng tẩy các vết máu trên quần áo. - Trong công nghiệp mỹ phẩm, papain đƣợc dùng để tẩy các vết nám, tàn nhang trên da làm cho da mềm mại hơn. Nhóm 4 Trang 18 Loại mặt nạ dưỡng da chế phẩm enzyme có chứa enzyme papain và những dưỡng chất của đu đủ CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN Việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triễn mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Hiện tại đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trƣờng thế giới, Các chế phẩm enzyme phổ biến nhƣ amylase, protease, catalase,cellulase,lipase,glucoseoxydase… Chế phẩm enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… “ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lƣợng nguyên tử”. Đã có những nghiên cứu ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân đậu nành, trong chế biến thịt, trong sản xuất mỹ phẩm… Nhóm 4 Trang 19 CHƯƠNG V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. http://www.docsachonline.vn/thu-nhan-enzyme-papain-tu-du-du 2. http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/bao-cao-ung-dung-enzyme-papain-trongthuy-phan-banh-dau-dau-phong-nham-tao-san-pham-co-gia-tridin.659842.html 3. http://tailieu.vn/tinh-chat-hoa-hoc-cua-enzyme-papain 4. http://vho.vn/cac-duoc-pham-co-papain 5. Bài giảng Kĩ thuật thực phẩm III-trƣờng Đại Học Nông Lâm tp.HCMTS.Bùi Anh Việt. Nhóm 4 Trang 20