Tài liệu Chuẩn hoá phương pháp xác định hàm lượng vitamin d (d2 và d3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

ViÖn Dinh D−ìng Trung t©m kiÓm nghiÖm vsATTP ***************** B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ChuÈn hãa ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D (D2 vµ D3) trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) Chñ nhiÖm ®Ò tµi : Ks. §oµn ThÞ H−êng 6544 20/9/2007 Hµ néi, 2007 ViÖn Dinh D−ìng Trung t©m kiÓm nghiÖm vsATTP ***************** B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ChuÈn hãa ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D (D2 vµ D3) trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) Chñ nhiÖm ®Ò tµi: Ks. §oµn ThÞ H−êng C¸c c¸n bé tham gia: C n. NguyÔn Thu H»ng C¬ quan chñ tr×: Trung t©m kiÓm nghiÖm VSATTP C¬ quan chñ qu¶n: ViÖn dinh d−ìng Kinh phÝ: 20 triÖu ®ång (Nguån NNS) Hµ n«i, 2007 Môc lôc TT Néi dung Trang 1 Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t 2 Danh môc c¸c b¶ng 3 Danh môc c¸c h×nh 4 PhÇn 1: Më ®Çu 1 5 PhÇn 2: Tæng quan 3 6 PhÇn 3: Môc tiªu, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 8 1. Môc tiªu 8 2. §èi t−îng 8 3. Néi dung vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 8 4. Kü thuËt ph©n tÝch s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ¸p 9 5. C¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng b»ng HPLC 11 6. Quy tr×nh ph©n tÝch thö nghiÖm 13 PhÇn 4: KÕt qu¶ nghiªn cøu 17 1. Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ch¹y s¾c ký 17 2. X¸c ®Þnh LOD 28 3. X¸c ®Þnh LOQ 28 4. X¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh 29 5. X¸c ®Þnh ®é lÖch chuÈn vµ hÖ sè biÕn thiªn 32 6. X¸c ®Þnh ®é thu håi 35 7. Mét sè s¾c ®å ch¹y s¾c ký cña mÉu ph©n tÝch 37 8 PhÇn 5: NhËn xÐt vµ bµn luËn kÕt qu¶ 39 9 PhÇn 6: Quy tr×nh ph©n tÝch x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p HPLC PhÇn 7: Tµi liÖu tham kh¶o 41 7 10 11 PhÇn phô lôc: C¸c s¾c ®å cña dung dÞch chuÈn vitamin D2 vµ D3 x©y dùng kho¶ng tuyÕn tÝnh 45 c¸c ch÷ viÕt t¾t TT C¸c ch÷ viÕt t¾t NghÜa tiÕng ViÖt 1 HPLC S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao 2 DAD Detector m¶ng di«t 3 UV-VIS Quang phæ tö ngo¹i - kh¶ kiÕn 4 RDA Nhu cÇu ¨n khuyÕn c¸o 5 TCVN Tiªu chuÈn ViÖt nam 6 AOAC HiÖp héi ph©n tÝch ho¸ häc 7 LOD Giíi h¹n ph¸t hiÖn 8 LOQ Giíi h¹n ®Þnh l−îng 9 SD §é lÖch chuÈn 10 Cv HÖ sè biÕn thiªn 11 MeOH Methanol 12 THF Tetra hydrofuran 13 ACN Acetonitril 14 SPE Cét chiÕt pha r¾n 15 TBHQ Tert butyl hydroquinol Danh môc c¸c b¶ng TT B¶ng 1 Néi dung b¶ng Thêi gian l−u cña vitamin D2 vµ D3 ®èi víi ®iÒu kiÖn ch¹y cét Waters RP- 18, detector DAD, b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98: 2, tèc ®é dßng 1ml/phót B¶ng 2 Thêi gian l−u cña vitamin D2 ch¹y cét Inertsil ODS 3 vµ cét Waters RP18, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN : MeOH =75:25, tèc ®é dßng 1ml/phót. B¶ng 3 NhËn xÐt c¸c s¾c ®å cña hai chÊt chuÈn ®èi víi cét Inertsil ODS 3 detector DAD b−íc sãng 265nm, Pha ®éng ACN : H2O =75:25, tèc ®é dßng 1ml/phót B¶ng 4 NhËn xÐt kÕt qu¶ ch¹y s¾c ký hai chuÈn trªn cét Inertsil ODS 3 pha ®éng ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD b−íc sãng 265nm, tèc ®é dßng 1ml/phót. B¶ng 5 Thêi gian l−u cña hai chÊt chuÈn t−¬ng øng víi pha ®éng kh¸c nhau tèc ®é 1ml/ phót, cét Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm B¶ng 6 Thêi gian l−u cña hai chÊt øng víi tèc ®é dßng kh¸c nhau trªn hÖ pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm, cét Inertsil ODS 3 B¶ng 7 Tæng kÕt ®iÒu kiÖn ch¹y HPLC ph©n tÝch vitamin D B¶ng 8 T−¬ng quan gi÷a diÖn tÝch pic vµ nång ®é chuÈn cña vitamin D2 B¶ng 9 T−¬ng quan gi÷a diÖn tÝch vµ nång ®é chuÈn vitamin D3 B¶ng 10 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D2 mÉu s÷a bét XO B¶ng 11 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D3 trong s÷a Sunny grow baby B¶ng 12 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong s÷a chua nestlÐ cã ®−êng B¶ng 13 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D3 trong s÷a Kappi hép 100ml B¶ng 14 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D3 trong s÷a bét giÇu n¨ng l−îng B¶ng 15 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong s÷a ®Æc cã ®−êng B¶ng 16 KÕt qu¶ hµm l−îng vitamin D trong mét sè mÉu kh¸c B¶ng 17 §é thu håi cña vitamin D3 B¶ng 18 §é thu håi cña vitamin D2 B¶ng 19 KÕt qu¶ ph©n tÝch mÉu s÷a bét mÉu DDP4 vËt liÖu chuÈn B¶ng 20 Tæng hîp c¸c th«ng sè thÈm ®Þnh Danh môc c¸c h×nh TT Néi dung c¸c h×nh PhÇn tæng quan H×nh 1 C«ng thøc ho¸ häc, c«ng thøc cÊu t¹o cña vitamin D2 vµ D3 H×nh 2 S¬ ®å chuyÓn ho¸ cña vitamin D trong c¬ thÓ PhÇn môc tiªu, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p H×nh 3 M« t¶ qu¸ tr×nh ch¹y s¾c ký H×nh 4 S¬ ®å m« t¶ hÖ thèng HPLC H×nh 5 §å thÞ phô thuéc diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic víi nång ®é PhÇn kÕt qu¶ nghiªn cøu * Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ch¹y H×nh 6 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,04ppm, cét Waters, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98:2, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 7 D¹ng phæ hÊp thô cña vitamin D2 H×nh 8 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,08ppm, cét Waters, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98:2, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 9 D¹ng phæ hÊp thô cña vitamin D3 H×nh 10 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,04ppm, cét Waters, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é dßng 1ml/ phót H×nh 11 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,04ppm, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 12 S¾c ®å chuÈn vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 13 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 14 S¾c ®å chuÈn vitamin D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 15 S¾c ®å chuÈn vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 16 S¾c ®å hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50:50, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 17 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10, tèc ®é 1ml/ phót H×nh 18 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tèc ®é dßng 1,2 ml/ phót H×nh 19 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tèc ®é dßng 1,5 ml/ phót H×nh 20 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tèc ®é dßng 1 ml/ phót H×nh 21 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tèc ®é dßng 1,2 ml/ phót H×nh 22 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tèc ®é dßng 1,5 ml/ phót. H×nh 23 S¾c ®å vitamin D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tèc ®é dßng 1,5 ml/ phót H×nh 24 S¾c ®å vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tèc ®é dßng 1,5 ml/ phót * X¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh H×nh 25 §−êng chuÈn vitamin D2 H×nh 26 §−êng chuÈn vitamin D3 * S¾c ®å ch¹y mÉu H×nh 27 S¾c ®å x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong s÷a tu¬i Kapi H×nh 28 S¾c ®å ch¹y mÉu s÷a t−¬i x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D2 H×nh 29 S¾c ®å ch¹y mÉu s÷a bét x¸c ®Þnh vitamin D3 H×nh 30 S¾c ®å ch¹y mÉu s÷a bét x¸c ®Þnh vitamin D3 PhÇn phô lôc: C¸c s¾c ®å dung dÞch chuÈn x©y dùng kho¶ng tuyÕn tÝnh H×nh 31 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,0022ppm H×nh 32 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,02ppm H×nh 33 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,041ppm H×nh 34 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,082ppm H×nh 35 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,165ppm H×nh 36 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,33ppm H×nh 37 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,0068ppm H×nh 38 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,068ppm H×nh 39 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,137ppm H×nh 40 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,274ppm H×nh 41 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,392ppm H×nh 42 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,5ppm B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 PhÇn 1: Më ®Çu §Ó tån t¹i, ph¸t triÓn vµ c¶i thiÖn nßi gièng, c¬ thÓ chóng ta lu«n cÇn ®−îc cung cÊp ®ñ c¸c chÊt dinh d−ìng, nguån cung cÊp c¸c chÊt nµy cã nhiÒu trong thùc phÈm ¨n vµo hµng ngµy. C¸c chÊt dinh d−ìng chÝnh lµ c¸c nhãm cung cÊp n¨ng l−îng cho c¬ thÓ nh− glucid, lipid, protein, nhãm cung cÊp muèi kho¸ng, nhãm cung cÊp c¸c lo¹i vitamin vµ n−íc. Theo quan ®iÓm cña c¸c chuyªn gia dinh d−ìng hiÖn nay trªn thÕ giíi mµ chóng ta ®ang sèng tån t¹i hai th¸i cùc kh¸c nhau, mét bªn lµ vùc th¼m cña sù thiÕu ¨n vµ mét bªn lµ vùc th¼m cña sù thõa ¨n. Sù thiÕu ¨n ®· dÉn ®Õn t×nh tr¹ng suy dinh d−ìng do thiÕu n¨ng l−îng protein, tuy nhiªn víi sù ph¸t triÓn cña nÒn khoa häc tiÕn tiÕn trªn thÕ giíi ®êi sèng cña ng−êi d©n ë hÇu hÕt c¸c n−íc ®· ®−îc c¶i thiÖn, kh«ng ngõng n©ng cao. ë ViÖt nam víi sù hç trî cña c¸c ch−¬ng tr×nh phßng chèng suy dinh d−ìng, ch−¬ng tr×nh VAC vµ cuéc c¸ch m¹ng xanh trong ngµnh n«ng nghiÖp ®· gãp phÇn to lín trong viÖc t¨ng c−êng an ninh thùc phÈm quèc gia, vÊn ®Ò ®ãi ¨n kh«ng cßn lµ ®iÒu bøc xóc. Hµng n¨m tû lÖ suy dinh d−ìng ®· gi¶m ®i mét c¸ch ®¸ng kÓ..... Tuy nhiªn vÊn ®Ò dinh d−ìng míi n¶y sinh ®ã lµ c¸c bÖnh m·n tÝnh liªn quan ®Õn dinh d−ìng ®ang lµ mèi quan t©m cña nhiÒu ng−êi. Kh¸i niÖm thùc phÈm chøc n¨ng (thùc phÈm ch÷a bÖnh) ®· trë nªn quen thuéc dÇn víi mäi ng−êi d©n. HiÖn nay ®Ó gi¶i quyÕt vÊn ®Ò nµy trªn thÕ giíi còng nh− trong n−íc ®· xuÊt hiÖn nhiÒu lo¹i thùc phÈm ch÷a bÖnh, thùc phÈm bæ sung vi chÊt dinh d−ìng phôc vô cho bÖnh nh©n liªn quan. Cã thÓ coi thùc phÈm chøc n¨ng, vai trß cña thùc phÈm ®èi víi bÖnh m·n tÝnh lµ h−íng tiÕp cËn rÊt míi trong ngµnh dinh d−ìng, thøc ¨n lµ thuèc, thuèc lµ thøc ¨n [16]. ë NhËt b¶n cho ®Õn nay ®· cã kho¶ng h¬n 192 s¶n phÈm ®−îc gäi lµ thùc phÈm chøc n¨ng nh»m gãp phÇn vµo duy tr×, c¶i thiÖn chÕ ®é ¨n vµ søc Trang 1/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 khoÎ [16]. Mét trong sè c¸c vi chÊt rÊt quan träng ®· ®−îc bæ sung vµo thùc phÈm ®ã lµ c¸c lo¹i vitamin. Vitamin lµ nh÷ng chÊt kh«ng sinh n¨ng l−îng nh−ng kh«ng thÓ thiÕu ®−îc ®èi víi sù tån t¹i, ph¸t triÓn cña mçi c¬ thÓ sèng. Vitamin cã vai trß t¹o ra c¸c coenzim cÇn thiÕt trong c¸c ph¶n øng chuyÓn ho¸ kh¸c nhau. TÊt c¶ c¸c qu¸ tr×nh sèng g¾n liÒn víi sù trao ®æi chÊt trong c¬ thÓ ®Òu cã sù tham gia trùc tiÕp cña vitamin [14]. Nguån cung cÊp vitamin chñ yÕu lµ tõ thøc ¨n. Khi thiÕu vitamin c¬ thÓ sÏ m¾c ph¶i mét sè bÖnh lý, nh− thiÕu vitamin A dÔ dÉn tíi bÖnh mï loµ, thiÕu vitamin B1 dÔ bÞ bÖnh tª phï, thiÕu vitamin PP bÞ bÖnh pellagra, thiÕu vitamin D bÞ bÖnh vÒ x−¬ng [17]. HiÖn nay mét thùc tÕ kh¾c nghiÖt ®· x¶y ra ë c¸c n−íc ®ang ph¸t triÓn lµ ph¶i ®−¬ng ®Çu víi g¸nh nÆng kÐp gi−· bÖnh nhiÔm trïng, tö vong trÎ em vµ thiÕu dinh d−ìng víi c¸c bÖnh m·n tÝnh kh«ng l©y liªn quan ®Õn dinh d−ìng [16]. Thùc tÕ ®· cho thÊy thiÕu vi chÊt dinh d−ìng ®· gãp phÇn kh«ng Ýt trong g¸nh nÆng kÐp nµy. V× vËy vai trß thùc phÈm ®−îc ®¸nh gi¸ v« cïng quan träng, viÖc nghiªn cøu øng dông thùc phÈm chøc n¨ng ®· ®ang trë thµnh trµo l−u mang tÝnh toµn cÇu. Nãi ®Õn thùc phÈm chøc n¨ng chóng ta kh«ng thÓ nãi ®Õn thùc phÈm bæ sung vitamin D, mét lo¹i vitamin kh¸ quan träng ®Ó phßng chèng bÖnh cßi x−¬ng ë trÎ em, lo·ng x−¬ng ë ng−êi lín, h¹ calci m¸u vµ mét sè bÖnh ngoµi da... HiÖn nay trªn thÞ tr−êng cã rÊt nhiÒu lo¹i s÷a, bét dinh d−ìng, b¸nh quy... cã bæ sung viatmin D. Víi lý do trªn, ®Ò tµi nµy chóng t«i hy väng chuÈn ho¸ ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) trong mét sè lo¹i thùc phÈm nh− s÷a chua, s÷a bét, s÷a n−íc, b¸nh quy, bét dinh d−ìng ®Ó ®−a ra quy tr×nh ph©n tÝch phï hîp, nh»m ®¸nh gi¸ ®óng chÊt l−îng, gi¸ trÞ dinh d−ìng thùc cña c¸c s¶n phÈm thùc phÈm. Trang 2/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 PhÇn 2: Tæng quan 1. Nguån gèc vµ tÝnh chÊt cña vitamin D VitaminD lµ chÊt tinh thÓ h×nh kim kh«ng mµu, kh«ng mïi, kh«ng tan trong n−íc, hoµ tan trong dÇu mì, tan trong dung m«i h÷u c¬ nh− ethanol, chlorofoc, methanol. Tªn gäi kh¸c cña vitamin D lµ calciferol. Vitamin D lµ mét nhãm gåm tõ D2 ®Õn D7 song cã hai ho¹t tÝnh m¹nh nhÊt lµ vitamin D2 cßn gäi Ergocalciferol vµ vitamin D3 cßn gäi Cholecalciferol. Cholecalciferol - C27H44O Ergocalciferol - C28H44O Vitamin D3 Vitamin D2 H×nh 1: C«ng thøc ho¸ häc, c«ng thøc cÊu t¹o cña vitamin D2 vµ D3 Vitamin D cã chñ yÕu trong thøc ¨n nguån gèc ®éng vËt nh− trøng, c¸, ®Æc biÖt dÞch chiÕt tõ gan c¸, b¬, s÷a, thÞt... Trong c¬ thÓ ng−êi vitamin D3 (Cholecalciferol) ®−îc tæng hîp tõ 7 dehydrocholesterol ë d−íi da nhê ¸nh s¸ng tö ngo¹i. Vitamin D2(Ergocalciferol) ®−îc tæng hîp tõ ergosterol cã trong nÊm vµ men bia. Nãi chung, ho¹t tÝnh sinh häc cña hai lo¹i vitamin D2 vµ vitamin D3 kh«ng cã sù kh¸c nhau nhiÒu. Trong c¬ thÓ vitamin D chuyÓn ho¸ ë gan vµ Trang 3/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 thËn t¹o ra chÊt chuyÓn ho¸ cã ho¹t tÝnh lµ 1,25- dihydroxycholecalciferol nhê enzim hydroxylase [14]. Trong da Trong gan Trong thËn D¹ng ho¹t ®éng H×nh 2: S¬ ®å chuyÓn ho¸ cña vitamin D trong c¬ thÓ ng−êi Trang 4/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 2. T¸c dông cña vitamin D - Vitamin D tham gia vµo qu¸ tr×nh t¹o x−¬ng nhê t¸c dông chuyÓn ho¸ c¸c chÊt v« c¬ chñ yÕu lµ calci vµ phosphat, lµm t¨ng hÊp thu calci vµ phosphat ë ruét, tham gia vµo qu¸ tr×nh calci ho¸ sôn nªn nã rÊt cÇn cho sù ph¸t triÓn x−¬ng ë trÎ em. - Lµm ®iÒu hoµ calci trong m¸u, øc chÕ tÕ bµo sinh ung th−. - Khi thiÕu vitamin D ruét kh«ng hÊp thu ®ñ calci vµ phospho lµm calci m¸u gi¶m g©y hËu qu¶ trÎ em chËm lín, cßi x−¬ng ch©n vßng kiÒng, chËm biÕt ®i, chËm kÝn thãp, nguêi lín bÞ lo·ng x−¬ng, xèp x−¬ng, x−¬ng th−a dÔ gÉy, phô n÷ cã thai thiÕu vitamin D dÔ sinh ra trÎ khuyÕt tËt ë x−¬ng [14]. - Nguyªn nh©n cña sù thiÕu vitamin D lµ do c¬ thÓ hÊp thu thøc ¨n kÐm, do Ýt tiÕp xóc víi ¸nh n¾ng mÆt trêi, do rèi lo¹n chuyÓn ho¸, do nhu cÇu cao ë phô n÷ cã thai vµ cho con bó... -Tuy nhiªn dïng vitamin D qu¸ liÒu còng g©y ra chøng t¨ng calci m¸u, t¨ng calci niÖu, ®au nhøc x−¬ng khíp, t¹o sái thËn, t¨ng huyÕt ¸p, cã thÓ g©y suy nh−îc, mÖt mái, ®au ®Çu, buån n«n, tiªu ch¶y, gißn x−¬ng... [14]. Theo c«ng tr×nh nghiªn cøu kh¶o s¸t t¸c dông cña vitamin D ®èi víi bÖnh ung th− ë bang Chicago trong 19 n¨m c¸c t¸c gi¶ nhËn thÊy tû lÖ ung th− kÕt trµng ë nam gi¶m 55% nÕu hµng ngµy ®−îc bæ sung vitamin D lµ 3,75mcg [18]. Theo nghiªn cøu cña Danson - Hughes vµ c¸c céng sù tiÕn hµnh trªn ®èi t−îng phô n÷ ®−îc bæ sung vitamin D 400 IU/ ngµy vµ nhãm phô n÷ kh¸c kh«ng ®−îc bæ sung, c¶ hai nhãm ®Òu cã l−îng vitamin D ¨n vµo hµng ngµy lµ 100 IU. NhËn thÊy nhãm ®èi chøng bÞ gi¶m ®¸ng kÓ mËt ®é kho¸ng trong x−¬ng so víi nhãm ®−îc bæ sung [18]. N¨m 1989 theo khuyÕn c¸o cña uû ban dinh d−ìng Hoa kú (RDA) vitamin D cÇn bæ sung lµ 10mcg/ ngµy ë tuæi tõ 51- 70 vµ 15mcg / ngµy ë tuæi cao h¬n [18]. Theo Trang 5/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 nghiªn cøu cña tr−êng Y Harvard ®−îc ®¨ng trªn t¹p chÝ cña hiÖp héi y häc Mü cho thÊy vitamin D cã thÓ gióp gi¶m nguy c¬ m¾c bÖnh ®a x¬ cøng. C¸c nhµ nghiªn cøu ®· so s¸nh l−îng vitamin D ë 257 mÉu huyÕt t−¬ng trong sè h¬n 7 triÖu mÉu cña nh©n viªn qu©n ®éi Mü, hä ph¸t hiÖn r»ng ng−êi da tr¾ng nhãm cã hµm l−îng vitamin D cao nhÊt cã nguy c¬ m¾c bÖnh ®a x¬ cøng thÊp nhÊt. BÖnh ®a x¬ cøng lµ bÖnh m·n tÝnh cña hÖ thÇn kinh, b¾t ®Çu víi c¸c triÖu chøng nh− mÊt trÝ nhí, suy nh−îc, mÖt mái, ®au ®ín hoÆc liÖt, chãng mÆt...vµ sau ®ã ¶nh h−ëng tíi tim m¹ch. 3. T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc vµ trªn thÕ giíi Cïng víi sù ph¸t triÓn cña nÒn khoa häc kü thuËt tiªn tiÕn, víi sù bïng næ cña ngµnh c«ng nghÖ th«ng tin, hiÖn nay hµng lo¹t c¸c hÖ thèng m¸y ph©n tÝch ho¸ häc ®· ®−îc c¶i tiÕn n©ng cÊp, nh»m x¸c ®Þnh nhiÒu lo¹i chÊt ho¸ häc vµ ®ång thêi n©ng cao ®é nh¹y cña phÐp ph©n tÝch còng nh− ®é lÆp l¹i cña kÕt qu¶ kiÓm nghiÖm. Trªn thÕ giíi nhiÒu nhµ ph©n tÝch ho¸ häc ®· cã nhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong thùc phÈm nh− thÞt, c¸, s÷a, trong m¸u... §ã lµ nghiªn cøu hµm l−îng vitamin hoµ tan trong chÊt bÐo cña mÉu s÷a chua b»ng ph−¬ng ph¸p HPLC víi detector PDA cña M.M Delgado Zamarreno, A. Sanchez Perez cña tr−êng ®¹i häc Salamanca T©y ban nha ®· ®−a ra c¸c yÕu tè ¶nh h−ëng ®Õn qu¸ tr×nh ph©n tÝch vitamin A, E, D nh− ®iÒu kiÖn thuû ph©n, t¸ch c¸c chÊt trong khi xö lý mÉu, kÕt qu¶ cña nghiªn cøu nµy ®−a ra ®é thu håi vitamin D3 lµ 91 ± 5% víi hµm l−îng vitamin D3 trong mÉu lµ 0,09 mcg/100g ± 5% [11]. Theo nghiªn cøu c«ng bè trªn Food Chemistry Vol.57, No.1. 9599, 1996 ë Anh c¸c nhµ nghiªn cøu ®−a ra c¸ch xö lý mÉu, ®iÒu ph©n tÝch x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong thùc phÈm, kÕt qu¶ nghiªn cøu nµy cho thÊy hÖ sè biÕn thiªn sau khi lµm lÆp l¹i ba lÇn ®èi víi vitamin D3 vµ D2 lµ <10%, ®é thu håi cña ph−¬ng ph¸p lµ 90 -110% víi D2 vµ D3, giíi h¹n Trang 6/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 ph¸t hiÖn lµ 1,5-2 ng [12]. Trong c«ng tr×nh nghiªn cøu ®¨ng trªn t¹p chÝ Chromatography A cña bé m«n thùc phÈm, dinh d−ìng §¹i häc Georgia Athens Mü, bé m«n Dinh d−ìng trªn ng−êi vµ khoa häc thùc phÈm tr−êng B¸ch khoa Virginia ngµy 26 th¸ng 1 n¨m 1998 ®· ®−a ra ®iÒu kiÖn vµ yÕu tè ¶nh h−ëng qu¸ tr×nh ph©n tÝch hµm l−îng vitamin A, E, D trong thøc ¨n ®éng vËt b»ng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao. Nghiªn cøu nµy cho thÊy ®é thu håi cña ph−¬ng ph¸p lµ 93-107% [19]. Trong bµi b¸o cña t¹p chÝ Food composition and analysis 16 (2003) cã c«ng tr×nh nghiªn cøu hµm l−îng vitamin D3 vµ 25 hydroxyvitamin D3 trong thÞt lîn t−¬i vµ thÞt lîn chÝn, ®· ®−a ra kÕt qu¶ nång ®é vitamin D3 ®èi víi thÞt t−¬i lµ tõ 0,05 ®Õn 0,21 mcg/100g víi thÞt chÝn lµ 0,07-0,14 mcg/100g. Sau khi lµm 49 thÝ nghiÖm lÆp l¹i hä ®· ®−a ra hÖ sè biÕn thiªn lµ 7,0%, lµm 51 thÝ nghiÖm kh¸c hÖ sè biÕn thiªn lµ 7,3% [7]. Ngoµi ra cßn nhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong m¸u vµ huyÕt thanh, trong thùc vËt ... Mét sè nghiªn cøu ®· ®−a ra hµm l−îng vitamin D trong c¸ thu lµ 15mcg/100g, trong gan bß 1mcg/100g, trong trøng gµ 2mcg/100g, trong nÊm r¬m lµ 2mcg/100g [8]. HiÖn nay ë ViÖt nam chóng t«i nhËn thÊy viÖc nghiªn cøu vitamin D trong thùc phÈm ch−a ®−îc lµm nhiÒu, trong b¶ng thµnh phÇn thøc ¨n ViÖt nam ch−a ®Ò cËp ®Õn hµm l−îng vitamin D. Trong danh môc tiªu chuÈn ViÖt nam (TCVN) chóng t«i còng ch−a thÊy mét quy tr×nh chuÈn nµo ®Ó x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D b»ng HPLC, v× vËy sau khi tham kh¶o c¸c tµi liÖu cïng víi ®iÒu kiÖn hiÖn cã cña phßng thÝ nghiÖm chóng t«i ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu chuÈn ho¸ ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong mét sè lo¹i thùc phÈm b»ng HPLC. Trang 7/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 PhÇn 3 Môc tiªu, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. 1. Môc tiªu Nh− ®· ®Ò cËp trong phÇn tæng quan môc tiªu ®Ò tµi chóng t«i chän lµ “ chuÈn ho¸ ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D (D2vµ D3) trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p HPLC’’ 2. §èi t−îng Trong khu«n khæ tæng kinh phÝ cña ®Ò tµi lµ 20 triÖu ®ång, chóng t«i chØ cã kh¶ n¨ng tiÕn hµnh trªn ®èi t−îng thùc phÈm lµ mÉu s÷a bét, s÷a chua, s÷a ®Æc, b¸nh quy vµ siro 3. Néi dung vµ ph−¬ng ph¸p §Ó ®¸p øng víi môc tiªu nãi trªn chóng t«i thùc hiÖn c¸c néi dung sau ®©y: - Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ch¹y dung dÞch chuÈn vitamin D2 vµ vitamin D3 - X¸c ®Þnh giíi h¹n ph¸t hiÖn (LOD) - X¸c ®Þnh giíi h¹n ®Þnh l−îng (LOQ) - X¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh - X¸c ®Þnh ®é lÖch chuÈn (SD) vµ hÖ sè biÕn thiªn (Cv %) - X¸c ®Þnh ®é thu håi (R %) Sau khi tham kh¶o c¸c tµi liÖu [1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 13] chóng t«i nhËn thÊy ®Ó ph©n tÝch hµm l−îng vitamin D trong thùc phÈm cã nhiÒu ph−¬ng ph¸p kh¸c nhau. Tr−íc ®©y th−êng sö dông ph−¬ng ph¸p sinh häc, ph−¬ng ph¸p ho¸ häc t¹o ph¶n øng lªn mµu råi tiÕn hµnh ®o quang, song ngµy nay víi sù ph¸t triÓn cña hÖ thèng s¾c ký th× hÇu nh− c¸c n−íc trªn thÕ giíi ®· chän ph−¬ng ph¸p HPLC ®Ó x¸c ®Þnh. HiÖn nay phßng thÝ nghiÖm chóng t«i cã hai hÖ thèng HPLC víi c¸c detector huúnh quang, detector UV, Trang 8/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 detector PDA vµ c¸c thiÕt bÞ phô trî kh¸c nh− m¸y cÊt quay, m¸y läc hót ch©n kh«ng... ®¸p øng tèt cho viÖc ph©n tÝch nªn chóng t«i ®· chän ph−¬ng ph¸p nµy ®Ó nghiªn cøu. §©y lµ ph−¬ng ph¸p cã nhiÒu −u ®iÓm vµ hiÖn nay ®−îc nhiÒu nhµ ph©n tÝch lùa chän. 4. Kü thuËt ph©n tÝch s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao 4.1 Nguyªn lý: S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao hay cßn gäi lµ s¾c ký láng cao ¸p, kü thuËt ph©n tÝch dùa trªn c¬ së sù t¸ch c¸c chÊt trªn pha tÜnh chøa trong cét nhê dßng chuyÓn ®éng cña chÊt láng (pha ®éng) d−íi ¸p suÊt cao. Pha tÜnh cã thÓ lµ chÊt r¾n hoÆc chÊt láng ®−îc phñ trªn chÊt mang. ChÊt ph©n tÝch ®−îc ghi nhËn bëi bé phËn ph¸t hiÖn d−íi d¹ng c¸c pic trªn s¾c ®å. Qu¸ tr×nh s¾c ký Pha ®éng Pha tÜnh Röa gi¶i qua cét S¾c ®å H×nh 3: M« t¶ qu¸ tr×nh ch¹y s¾c ký 4.2 HÖ thèng HPLC: HÖ thèng HPLC bao gåm c¸c bé phËn chÝnh ®−îc m« t¶ d−íi ®©y. Trang 9/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 4 7 3 1 5 2 6 H×nh 4: S¬ ®å m« t¶ hÖ thèng HPLC Trong ®ã: 1: B×nh chøa pha ®éng. 2: B¬m cao ¸p 3: Van b¬m mÉu. 4: Cét s¾c ký 5: Bé phËn ph¸t hiÖn Detector 6: B×nh chøa dung m«i th¶i 7: HÖ thèng m¸y tÝnh ghi d÷ liÖu ph©n tÝch. Trong ®Ò tµi nµy chóng t«i sö dông detector m¶ng diod (DAD) vµ ch¹y s¾c ký pha ng−îc (pha ®éng ph©n cùc, pha tÜnh Ýt ph©n cùc) ®Ó x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D. Trang 10/46 B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007 5. C¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng b»ng HPLC C¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng b»ng s¾c ký ®Òu dùa trªn nguyªn t¾c nång ®é cña chÊt tû lÖ víi diÖn tÝch hay chiÒu cao pic. * Cã 4 ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng th−êng ®−îc lùa chän ®ã lµ - Ph−¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i - Ph−¬ng ph¸p chuÈn néi - Ph−¬ng ph¸p thªm chuÈn - Ph−¬ng ph¸p chuÈn ho¸ diÖn tÝch Trong ®Ò tµi nµy chóng t«i sö dông ph−¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i ®Ó ph©n tÝch. Ph−¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i lµ ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng c¬ b¶n trong ®ã dung dÞch chÊt chuÈn vµ mÉu thö ®−îc tiÕn hµnh s¾c ký trong cïng ®iÒu kiÖn. Sau ®ã so s¸nh diÖn tÝch pic hoÆc chiÒu cao cña mÉu thö víi diÖn tÝch pic hoÆc chiÒu cao dung dÞch chÊt chuÈn ®Ó tÝnh nång ®é chÊt cã trong mÉu. Cã thÓ dïng ph−¬ng ph¸p chuÈn ho¸ mét ®iÓm hoÆc nhiÒu ®iÓm. * ChuÈn ho¸ mét ®iÓm (ph−¬ng ph¸p so s¸nh): Chän nång ®é dung dÞch chÊt chuÈn gÇn b»ng nång ®é mÉu thö, tÝnh theo c«ng thøc sau. C x = S x C S s s Trong ®ã: Cx nång ®é mÉu thö. Cs nång ®é dung dÞch chÊt chuÈn Sx diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic mÉu thö Ss diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic dung dÞch mÉu chuÈn Trang 11/46