Tài liệu Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (reverse hybridization)

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý đào tạo sau Đại học, các Thầy giáo, Cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo, các bạn đồng nghiệp Trung tâm Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện phụ sản Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và quá trình thu thập số liệu. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Hoàng Thị Ngọc Lan và TS. Lương Thị Lan Anh, những người thầy đã tận tình, trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa học. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn Lê Phương Thảo LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử (Reverse hybridization)” là đề tài do tôi thực hiện, tất cả các số liệu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Nếu sai, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn Lê Phương Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN............................................................................4 1.1. Bệnh Thalassemia.........................................................................................4 1.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia.............................21 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........36 2.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................36 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................................37 2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................37 2.4. Cách thức tiến hành nghiên cứu...................................................................39 2.5. Hạn chế sai số trong nghiên cứu...................................................................47 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu............................................................................47 2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu........................................................47 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.....................................................48 3.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu...................................................48 3.2. Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng phương pháp Reverse hybridization.............................................................................................49 3.3. Đánh giá giá trị của phương pháp.................................................................56 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN..............................................................................65 4.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia.....65 4.2. Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse hybridization và tỷ lệ các loại đột biến........................................................70 4.3. Đánh giá giá trị kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia......................................................................................76 KẾT LUẬN....................................................................................................82 KIẾN NGHỊ...................................................................................................83 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT NST Nhiễm sắc thể DNA Deoxyribo Nucleotid Acid PCR Polymerase Chain Reaction SEA (Phản ứng khuếch đại chuỗi) South East Asia THAI FIL MED Hb Thailand Filipino Mediterranean Hemoglobin Α (Huyết sắc tố) alpha Β beta HBA Hemoglobin alpha HBB Hemoglobin beta ARMS-PCR MLPA Amplification Refractory Mutation System Polymera Chain Reaction Multiplex Ligation-dependent Probe NOR Amplification Normal (Bình thường) HET Heterozygous (Dị hợp tử) HOM ĐCTN Homozygous (Đồng hợp tử) Đình chỉ thai nghén MCV Thể tích trung bình hồng cầu MCH Lượng hemoglobin trung bình hồng cầu DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ Bảng 1.1. Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình thường...........................................................................................5 Bảng 1.2. Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường............11 Bảng 1.3. Kiểu gen và các thể bệnh -thalassemia.....................................13 Bảng 1.4. Các đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở người Việt Nam .....................................................................................................18 Bảng 1.5. Các đột biến mất đoạn thalassemia được chẩn đoán bằng gapPCR.............................................................................................23 Bảng 1.6. Các đột biến gen β globin và mồi đặc hiệu.................................26 Bảng 1.7. Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng β-Globin StripAssaySEA............................................................................30 Bảng 1.8. Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng α-Globin StripAssay .....................................................................................................31 Bảng 2.1. Các chỉ số nghiên cứu.................................................................38 Bảng 2.2. Chỉ dẫn cách đánh giá đột biến trên Teststrip.............................44 Bảng 2.3. Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen α globin....................46 Bảng 2.4. Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen β globin....................46 Bảng 3.1. Đặc điểm về dân tộc của thai phụ...............................................48 Bảng 3.2. Tuổi thai ở thời điểm chọc hút dịch ối của đối tượng nghiên cứu .....................................................................................................48 Bảng 3.3. Tiền sử đẻ con Thalassemia........................................................48 Bảng 3.4. Tiền sử phù thai..........................................................................49 Bảng 3.5. Tỷ lệ phát hiện đột biến...............................................................49 Bảng 3.6. Phân bố loại đột biến...................................................................50 Bảng 3.7. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh α -thalassemia.....................51 Bảng 3.8. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia......................52 Bảng 3.9. Kiểu gen các thai được chẩn đoán trước sinh bệnh αthalassemia..................................................................................53 Bảng 3.10. Kiểu gen các trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh βthalassemia..................................................................................53 Bảng 3.11. Kết quả chẩn đoán trước sinh cho 11 gia đình có con đầu mắc HbH hoặc β-thalassemia thể nặng...............................................54 Bảng 3.12. Đối chiếu kết quả về phân bố kiểu gen của thai từ 2 phương pháp ARMS-PCR/gap-PCR và Reverse hybridization..............56 Bảng 3.13. Đối chiếu về kết quả xác định các dạng đột biến cụ thể.............56 Bảng 3.14. So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc αthalassemia).................................................................................58 Bảng 3.15. So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc βthalassemia).................................................................................59 Bảng 4.1. So sánh đặc diểm của 2 phương pháp ARMS-PCR/gap-PCR và Reverse hybridization trong chẩn đoán Thalassemia.............79 Biểu đồ 3.1. Các loại đột biến gây bệnh α-thalassemia..................................50 Biểu đồ 3.2. Các loại đột biến gây bệnh β-thalassemia..................................51 DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ 1 Hình 1.1. Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb.....5 Hình 1.2. Vị trí gen α globin trên NST 16....................................................6 Hình 1.3. Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen α..............................7 Hình 1.4. Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen α................9 Hình 1.5. Một số đột biến mất đoạn trên gen α globin...............................10 Hình 1.6. Vị trí gen β globin trên NST 11..................................................14 Hình 1.7. Năm đột biến xẩy ra (đóng khung) ở vị trí đầu của intron thứ nhất của gen  globin..................................................................17 Hình 1.8. Chẩn đoán đột biến mất đoạn α+-thalassemia bằng multiplex gap-PCR......................................................................................24 Hình 1.9. Chẩn đoán đột biến mất đoạn α0-thalassemia bằng multiplex gap-PCR......................................................................................24 Hình 1.10. Chẩn đoán β-thalassemia bằng ARMS-PCR...............................25 Hình 1.11. Các vị trí đột biến trên Teststrip của β-Globin StripAssay SEA .....................................................................................................32 Hình 1.12. Các vị trí đột biến trên Teststrip của α-Globin StripAssay.........33 Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu..................................................................39 Hình 2.2. Cách xác định đột biến trên Teststrip..........................................45 Hình 3.1. Đồng hợp tử đột biến --SEA..........................................................60 Hình 3.2. Dị hợp tử đột biến --SEA...............................................................61 Hình 3.3. Không phát hiện đột biến gen.....................................................62 Hình 3.4. Dị hợp tử đột biến CD17.............................................................63 Hình 3.5. Dị hợp tử đột biến kép CD41/42 / HbE......................................64 Hình 4.1. Sơ đồ sàng lọc trước sinh bệnh Thalassemia..............................68 Hình 4.2. Sơ đồ xác định loại Thalassemia bằng xét nghiệm huyết học và sinh hóa.......................................................................................69 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia là một dạng bệnh của huyết sắc tố - hemoglobin (HST Hb) phổ biến trên thế giới. Bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân là do đột biến gen gây giảm hoặc không tổng hợp protein globin tham gia cấu tạo Hb, dẫn đến thiếu hụt Hb trong hồng cầu. Trên thế giới, ước tính 7% dân số mang gen bệnh và mỗi năm có khoảng 300.000 ÷ 500.000 trẻ được sinh ra với thể đồng hợp tử nặng của bệnh này . Tại Việt Nam, có khoảng hơn 5 triệu người mang gen và bị bệnh Thalassemia, hàng năm có thêm 100.000 trẻ mang gen bệnh và 1.700 trẻ mắc bệnh nặng do đột biến cả 2 gen được sinh ra . Bệnh được chia làm 2 loại chính là alpha thalassemia (α-thalassemia) và beta thalassemia (β-thalassemia) tùy thuộc vào loại đột biến xảy ra ở gen α (quy định tổng hợp chuỗi alpha globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 16) hay gen β (quy định tổng hợp chuỗi beta globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 11). Theo thống kê, có trên 300 đột biến gen α và trên 200 đột biến gen β có liên quan đến bệnh Thalasemia , . Cá thể đồng hợp tử mang 2 alen đột biến αthalassemia loại --SEA/--SEA gây bệnh Hb Bart’s, đây là thể nặng nhất của bệnh α-thalassemia. Thai nhi mắc Hb Bart’s thường bị phù rau thai, thai chết lưu trong tử cung hoặc chết sớm sau sinh. Thể này đặc biệt phổ biến ở các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Philippines . Bệnh nhân β-thalassemia thể nặng hay còn gọi là thể Cooley, đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép 2 đột biến khác nhau, thường có biểu hiện thiếu máu nặng dần sau 3 ÷ 6 tháng tuổi, phụ thuộc vào truyền máu và thải sắt suốt đời . Người bệnh Thalassemia thể ẩn là người có kiểu gen dị hợp tử mang 1 alen đột biến, có thiếu máu nhược sắc trên huyết đồ nhưng lại không có biểu hiện trên lâm sàng. Phương pháp điều trị chủ yếu hiện nay đối với bệnh Thalassemia vẫn là truyền máu, thải sắt, cắt 2 lách và điều trị các biến chứng khi cần , , . Quá trình này rất tốn kém mà hiệu quả không cao. Vì thế, bệnh trở thành gánh nặng không chỉ cho bệnh nhân và gia đình mà cho toàn xã hội [9]. Đối với các trường hợp gia đình có bố mẹ là người mang gen bệnh hoặc tiền sử sinh con Thalassemia thì biện pháp sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia có ý nghĩa quan trọng và là phương pháp phòng ngừa hiệu quả nhất . Ở Việt Nam, để chẩn đoán bệnh Thalassemia chúng ta đang sử dụng phương pháp multiplex PCR (PCR đa mồi) để sàng lọc các đột biến: 5 đột biến mất đoạn lớn của gen α globin như: -- SEA (South East Asia), --THAI (Thailand), --FIL (Philippin), -α4.2, -α3.7 và các đột biến điểm HbQs, HbCs và 8 đột biến phổ biến của gen β globin gây ra 95% các trường hợp β-thalassemia bao gồm: CD17 (AAG>TAG), CD41/42 (-TCTT), -28 (A>G), CD71/72 (+A), IVS 1.1 (G>T), IVS 1.5 (G>C), IVS 2.654 (C>T) và CD26 (GAG>AAG) , xác định kiểu gen bằng kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction) và giải trình tự vùng gen globin. Các phương pháp này dễ dàng áp dụng cho việc phát hiện các đột biến đơn lẻ đã biết, nhưng lại không có khả năng xác định cùng lúc nhiều đột biến. Hiện nay, kỹ thuật lai phân tử là một trong những kỹ thuật được dùng để chẩn đoán thay thế các phương pháp trên. Kỹ thuật Reverse hybridization (lai phân tử ngược) được cải tiến trên cơ sở của kỹ thuật lai phân tử có thể phát hiện cùng lúc được nhiều đột biến khác nhau trên cùng một gen. Kỹ thuật Reverse hybridization đã được ứng dụng hiệu quả trong xác định đồng nhiễm genotype virus sinh u nhú ở người (HPV). Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật này chưa được áp dụng trong chẩn đoán bệnh Thalassemia. Đây là một quy trình mới, có nhiều ưu điểm so với các phương pháp hiện đang được áp dụng, vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Chẩn đoán trước sinh bệnh 3 Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization)”, với mục tiêu: 1. Phát hiện các đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh. 2. Đánh giá giá trị của kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia. 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Bệnh Thalassemia 1.1.1. Cấu tạo của Hemoglobin (Hb) và các gen tổng hợp chuỗi globin Phân tử Hb cấu tạo bởi 4 chuỗi globin và 4 phân tử Hem, mỗi chuỗi globin gắn với một phân tử Hem. Tùy theo các giai đoạn phát triển cá thể mà globin gồm các chuỗi polypeptid khác nhau. Các chuỗi polypeptid đều có cấu trúc từ các acid amin và được sắp xếp theo một thứ tự chặt chẽ. Ngoài ra cấu trúc không gian của các chuỗi polypeptid này cũng rất quan trọng trong vai trò đảm bảo chức năng vận chuyển khí của phân tử Hb [12]. Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptid ra các loại: Zeta (ζ), epsilon (), gamma (), alpha (), beta (), delta () [13]. Các gen chi phối sự hình thành chuỗi , , ,  nằm trên nhiễm sắc thể (NST) số 11; các gen chi phối sự hình thành chuỗi ζ,  nằm trên NST số 16. Trong giai đoạn phôi, Hb chủ yếu là Hb Gower I (ζ2ε2), Hb Gower II (22) và Hb Portland (ζ22). Trong giai đoạn thai, loại Hb chủ yếu là HbF (22). Trong giai đoạn trưởng thành, loại Hb chủ yếu là HbA 1 (22) và một ít HbA2 (22). Người trưởng thành có 97,5% HbA1, khoảng 2% HbA2 và khoảng 0,5% HbF. 5 Bảng 1.1. Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình thường Loại Hb Hb A1 Hb A2 Hb F Hb Gower 1 Hb Gower 2 Hb Portland Thành phần globin α2 β2 α 2 δ2 α 2 γ2 ζ2 ε 2 α2 ε2 ζ2 γ 2 Thời kỳ xuất hiện Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi Phôi thai 2 ÷ 3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1 Phôi thai 2 ÷ 3 tuần đầu Số lượng acid amin trong chuỗi polypeptid đặc trưng cho từng loại chuỗi, ví dụ: chuỗi α có 141 acid amin, chuỗi β gồm 146 acid amin. Trình tự các acid amin trong chuỗi rất nghiêm ngặt, sự thay thế của acid amin này bằng acid amin khác trong nhiều trường hợp thể hiện thành những bệnh của Hb . Hình 1.1. Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb Ở người bình thường, số lượng chuỗi  globin và chuỗi  globin được sản xuất cân bằng để tham gia cấu tạo phức hợp 22, tế bào máu của người bình thường có thể tích tế bào khoảng 100 m3. 6 Thalassemia là một dạng bệnh của Hb, trong đó chuỗi  globin giảm hoặc không được tạo thành gọi là bệnh α-thalassemia, chuỗi  globin giảm hoặc không được tạo thành gọi là bệnh β-thalassemia . 1.1.2. Bệnh α-thalassemia α-thalassemia là bệnh di truyền alen lặn NST thường do đột biến gen α globin nằm trên nhánh ngắn NST số 16 (16p13.3), gây giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin. Hình 1.2. Vị trí gen α globin trên NST 16 (Nguồn: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBA1 [15] ) Cụm gen α globin ở người dài khoảng 70kb, chứa 2 gen α globin: α1 (chiều dài 840bp, chứa 3 exon và 2 intron), và α2 (chiều dài 830bp, chứa 3 exon và 2 intron). Ngoài ra nó còn chứa một gen ζ2 phôi thai; 3 gen giả gồm pseudo zeta1 (ψζ1), pseudo α1 (ψα1), pseudo α2 (ψα2) và một gen theta1 (θ). Gen ζ2 hoạt động tổng hợp chuỗi ζ trong suốt giai đoạn phôi thai, gen α1 và α2 chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi α globin, các gen còn lại không có chức năng. Các gen chức năng sắp xếp theo trật tự 5’- ζ2 - α2 - α1 - 3’, được bao quanh bởi các gen có biểu hiện mạnh như MPG, NPRL3 và Luc7L, được điều 7 tiết chủ yếu bởi vùng không mã hóa có tính bảo thủ cao (multispecies conserved sequences, MSCR2) hay còn gọi là vùng HS-40 [16]. Hình 1.3. Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen α (Nguồn: Douglas R. Higg, 2013 [16] ) Gen α1 và α2 đều mã hóa các chuỗi α globin gồm 141 acid amin nhưng do trình tự khởi động (promoter) của 2 gen khác nhau nên khả năng biểu hiện của gen α2 mạnh hơn gen α1 từ 2 đến 3 lần. Vì vậy các đột biến xảy ra ở gen α2 thường có hậu quả nặng nề hơn những đột biến ở gen α1 [16], [17]. α-thalassemia là một trong những bệnh Hb phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới . Đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu, chiếm tới 60 ÷ 90% các nguyên nhân gây phù thai ở các nước Đông Nam Á . Trong đó, tỷ lệ người mang gen đột biến mất đoạn dạng SEA ở Đông Nam Á là cao nhất, ở Bắc Thái Lan là 14%, Nam Trung Quốc là 5,0 ÷ 8,8%, Hồng Kông là 4,5%, Trung tâm Thái Lan là 3,7%, Bắc Đài Loan là 3,5% . 8 1.1.2.1. Cơ chế sinh bệnh Bệnh α-thalassemia là bệnh Hb do thiếu hụt hoặc thiếu hoàn toàn chuỗi  trong phân tử Hb . Đột biến gây bệnh α-thalassemia chủ yếu là các đột biến mất đoạn, đột biến không mất đoạn ít gặp hơn. Cơ chế sinh bệnh cũng khác nhau với từng loại đột biến. Đến nay, hơn 300 loại đột biến trên vùng gen α globin đã được phát hiện, bao gồm các đột biến mất đoạn lớn - mất đoạn cả 2 gen (mất 1 phần hoặc toàn bộ cả 2 gen α), đột biến mất đoạn nhỏ - mất đoạn 1 gen (mất 1 phần hoặc toàn bộ gen α1 hoặc gen α2) và đột biến điểm [4]. - Đột biến mất đoạn gen α-thalassemia: là nguyên nhân chủ yếu gây αthalassemia (~ 90%), bao gồm mất đoạn từ 1 đến 2 gen α globin. + Đột biến dẫn đến α+-thalassemia Là đột biến mất đoạn ở 1 gen α gây giảm tổng hợp chuỗi α globin. Phổ biến là các mất đoạn 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2) trong gen α. Cơ chế tạo ra các mất đoạn này là do sự tái tổ hợp giữa các vùng tương đồng trên gen α. Các gen mã hóa chuỗi α nằm trong 2 vùng tương đồng cao, các vùng đó được chia thành các vùng: X, Y và Z, tách biệt nhau bởi các đoạn chèn nhỏ. Trong quá trình phân bào của dòng tế bào mầm, sự trao đổi chéo không cân bằng sẽ làm cho 1 NST bị mất 1 gen α và 1 NST có 3 gen α. Trao đổi chéo xảy ra ở vùng Z, tạo ra 1 NST mất 1 đoạn gen dài 3.7kb và 1 NST có 3 gen α (αααanti3.7). Tương tự, nếu trao đổi chéo xảy ra ở vùng X sẽ tạo nên 1 NST mất 1 đoạn gen dài 4.2kb và 1 NST có 3 gen α (ααα anti4.2). Tần suất xuất hiện NST có 1 gen α và 3 gen α trong tinh trùng là từ 1 ÷ 5 x 10 -5. Các mất đoạn và lặp đoạn cũng có thể xảy ra trong các tế bào sinh dưỡng bởi các cơ chế liên quan [16]. 9 Hình 1.4. Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen α (Nguồn: Douglas R. Higgs, 2013 [16]) Bên cạnh các mất đoạn 1 gen phổ biến là 3.7kb (-α 3.7) và 4.2kb (-α4.2) thì các mất đoạn toàn bộ 1 gen α (α1 hoặc α2) cũng đã được quan sát. Các mất đoạn này được hình thành do sự tái tổ hợp giữa các vùng không tương đồng trong cụm gen α. Mặc dù bị mất hẳn 1 gen α nhưng ảnh hưởng của loại đột biến này đến hoạt động biểu hiện của gen α còn lại cũng tương tự như -α 3.7 và -α4.2, điều này đã được khẳng định trong một số nghiên cứu theo dõi các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các cá thể mất 1 phần gen α và các cá thể mất toàn bộ 1 gen α [20]. + Đột biến mất đoạn dẫn đến α0-thalassemia Hiện nay đã xác định được khoảng 50 loại mất đoạn 2 gen bao gồm mất 1 phần gen trên cả 2 gen α, mất hoàn toàn 2 gen α làm vắng mặt hoàn toàn quá trình tổng hợp gen α. Cơ chế hình thành các mất đoạn này được cho là do các tổ hợp sai lệch, các chuyển đoạn tương hỗ và quá trình cắt ngắn NST số 16. Phổ biến là các đột biến vùng Địa Trung Hải (Mediterranean, 10 --MED), đột biến vùng Đông Nam Á (Southeast Asia, --SEA), đột biến người Philippin (--FIL). Các đột biến mất đoạn khác như: -α5.2, -(α)20.5, mất đoạn 100 ÷ 200 kb lấy đi toàn bộ cụm gen α globin cùng các gen khác (gen quy định 1 enzym sửa chữa DNA và ức chế sự phân tách GDP từ Rho - Rho GDP, gen mã hóa protein disulfide isomerase - PDI-R, và vùng điều hòa gen promotor), mất gen α1, gen θ, vùng trình tự xuôi chiều tính từ tâm động từ cụm gen α, mất vùng điều tiết gen MCS-R nhưng còn lại 2 gen α, dù hiếm gặp hơn nhưng đều dẫn đến α0-thalassemia. Đồng hợp tử các nhiễm sắc thể có đột biến α0-thalassemia sẽ gây hội chứng phù thai do Hb Bart’s. Dị hợp tử đột biến α0-thalassemia và α+-thalassemia sẽ gây bệnh HbH [16], [17]. Hình 1.5. Một số đột biến mất đoạn trên gen α globin (Nguồn: David H. K. Chui, 1998 ) - Đột biến không mất đoạn trong α-thalassemia Bao gồm chủ yếu là các đột biến điểm trong vùng HS-40 và trong gen α1 hoặc gen α2. Hiện nay người ta đã xác định được 69 đột biến điểm liên quan đến biểu hiện của gen α, ký hiệu αNDα hoặc ααND (ND: nondeletion, αND: đột biến điểm trên gen α). 11 Điển hình trong nhóm đột biến điểm là đột biến T thành C ở bộ ba kết thúc dịch mã. Đây là đột biến điểm phổ biến nhất ở Đông Nam Á (~ 4%). Đột biến làm bộ 3 kết thúc dịch mã từ TAA chuyển thành codon CAA mã hóa cho acid amin Glutamine vì vậy ribosom tiếp tục dịch mã đến khi nó chạm vào mã kết thúc tiếp theo trong khung dọc mới dừng lại, kết quả là 1 chuỗi α globin bị kéo dài thêm 31 acid amin so với phân tử protein 141 acid amin ban đầu, tạo nên Hb Constant Spring (HbCs). Đột biến này phá vỡ các vùng không mã hóa làm phân tử ARN thông tin tạo thành không ổn định nên mức độ biểu hiện yếu, chỉ khoảng 3% so với chuỗi α2 bình thường, vì vậy trong một số trường hợp không thể phát hiện được bằng điện di phân tích các thành phần Hb [16], [20]. Ngoài ra còn có các mất đoạn trong khung dọc (in-frame deletions), đột biến dịch khung dọc (frame-shift mutations), đột biến vô nghĩa (nonsenses mutations) dẫn tới sản xuất ra các protein bất thường (như mô tả ở bảng 1.2) Bảng 1.2. Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường [16], [20] Vị trí đột biến T > G (codon 32) T > C (codon 125) G > A (codon 32) G > C (codon 59) Biến đổi protein Methionin > Arginin Leucin > Prolin Methionin > Isoleucin Glycin > Arginin Huyết sắc tố Hb Rotterdam Hb Quong Sze Hb Amsterdam Hb Aadana 1.1.2.2. Quy luật di truyền và cơ chế di truyền Quy luật di truyền: theo quy luật alen lặn trên NST thường. Cơ chế di truyền: bệnh có thể do gen bệnh truyền từ bố, mẹ cho con hoặc do đột biến mới phát sinh qua quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ đi vào thế hệ con, sự biểu hiện bệnh ở thế hệ con còn tuỳ thuộc vào kiểu gen. Tùy mức độ đột biến của gen mà có các thể bệnh khác nhau.