Tài liệu Cảm biến sinh học trên cơ sở polyme dẫn trong phát hiện vi rút gây bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ *************** Trần Quang Huy CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ POLYME DẪN TRONG PHÁT HIỆN VI RÚT GÂY BỆNH Chuyên ngành : Vật liệu và linh kiện nanô LUẬN VĂN THẠC SỸ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Mai Anh Tuấn Hà Nội - 2007 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Trang 1.1 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học …………………………... 3 1.2 Cảm biến sinh học……………………………………………… 5 1.2.1 Khái niệm cảm biến sinh học…………………………….. 5 1.2.2 Nguyên lý cảm biến sinh học…………………………….. 9 1.2.3 Phân loại cảm biến sinh học……………………………… 10 1.3 Polyme dẫn……………………………………………………… 15 1.3.1 Khái niệm polyme dẫn ………...…………………………. 15 1.3.2 Cơ chế dẫn của polyme dẫn………………………………. 16 1.3.3 Ứng dụng polyme dẫn trong cảm biến sinh học………….. 18 1.4. Một số khái niệm về sinh học phân tử, vi rút học, vi rút Herpes 21 1.4.1 Một số khái niệm về sinh học phân tử……………………. 21 1.4.2 Một số khái niệm về vi rút học…………………………… 24 1.4.3 Vi rút Herpes……………………………………………… 27 CHƯƠNG 2. CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC 2.1 Thiết bị, hóa chất……………………………………………….. 31 2.1.1 Thiết bị……………………………………………………. 31 2.1.2 Hóa chất…………………………………………………... 31 2.2 Thiết kế và chế tạo cảm biến vi điện cực………………………. 32 2.2.1 Thiết kế cảm biến vi điện cực…………………………….. 32 2.2.2 Qui trình chế tạo vi cảm biến…………………… 33 2.3 Lựa chọn DNA đầu dò…………………………………………. 37 2.4 Lựa chọn polyme dẫn…………………………………………… 38 2.5 Cố định DNA đầu dò lên bề mặt vi cảm biến…………….. 39 2.6 Đo đạc các thông số……………………………………………. 41 2.6.1 Kính hiển vi điện tử quét (KHVĐTQ)……………………. 41 2.6.2 Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR)…………… 42 2.6.3 Kỹ thuật phản ứng chuỗi tổng hợp polymerase (PCR)…... 42 2.6.4 Xây dựng hệ đo tín hiệu cảm biến sinh học………………. 43 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Cảm biến vi điện cực…………………………………………… 49 3.2 Tạo màng polyme dẫn APTS ….………………………………. 52 3.3 Phổ hồng ngoại FTIR…………………………………………… 52 3.4 Dò tìm axit nucleic từ mẫu phân tích…………………………… 53 3.4.1 Dò tìm DNA bổ sung……………………………………... 53 3.4.2 Dò tìm DNA đặc hiệu của HSV………………………….. 60 KẾT LUẬN DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Thank you for evaluating AnyBizSoft PDF Splitter. A watermark is added at the end of each output PDF file. To remove the watermark, you need to purchase the software from http://www.anypdftools.com/buy/buy-pdf-splitter.html DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT APTS 3-aminopropyl–triethoxy-silance (Tên một loại polyme dẫn) DNA Deoxyribonucleic acid (Axít đêoxyribônuclêic – AND) EDC 1–ethyl-3-(dimethyl-aminopropyl)carbodiimide (Tên chất để hoạt hóa gốc phốt phát của ADN) ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn men) IF ImmunoFlourescence (Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang) FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier) HSV Herpes Simplex Viruses type 1 & 2 (Vi rút Herpes týp 1 và 2) ITIMS International Training Institute for Material Science (Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa học Vật liệu) KHVĐTQ Kính hiển vi điện tử quét MIA 1-methylimidazole (Tên chất để làm ổn định hóa DNA hoạt hóa trong nước) NCBI National Center of Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học) PCR Polymerase Chain Reaction (Kỹ thuật phản ứng chuỗi tổng hợp polymeraza) RNA Ribonucleic acid (Axít ribônuclêic - ARN) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các loại thụ thể sử dụng trong cảm biến sinh học và kỹ thuật đo 6 điện hoá Bảng 1.2 Kiểu đo tương ứng với các bộ chuyển đổi điện hoá và đối tượng 8 phân tích Bảng 1.3 Một số tạp chất tiêu biểu dùng để pha tạp trong polyme dẫn 18 Bảng 1.4 Cố định các phân tử sinh học lên lớp polyme dẫn trong các thiết bị 20 cảm biến Bảng 1.5 So sánh hai týp vi rút Herpes 29 Bảng 2.1 Thông số quá trình oxy hoá bề mặt phiến silic 34 Bảng 2.2 Thông số quá trình phún xạ tạo màng kim loại trên phiến silic 36 Bảng 2.3 Các thông số hàn dây siêu âm 37 Bảng 2.4 Bảng mẫu thực hiện các phép đo theo nồng độ, nhiệt độ, thời gian 48 Bảng 3.1 So sánh ưu, nhược điểm của hai loại cảm biến vi điện cực 51 Bảng 3.2 Tín hiệu lai hóa khi nồng độ mẫu thấp tại nhiệt độ phòng 54 Bảng 3.3 Tín hiệu lai hóa của DNA đầu dò và DNA bổ sung trong mẫu phân 55 tích Bảng 3.4 Tín hiệu lai hóa theo sự thay đổi của nhiệt độ, nồng độ và thời gian 57 Bảng 3.5 Tín hiệu lai hóa khi đo với sản phẩm PCR của HSV 61 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang 7 Hình 1.1 Hình thái bề mặt của cảm biến trước và sau khi lai hoá Hình 1.2 Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học 9 Hình 1.3 Mô hình một loại cảm biến enzyme…. 11 Hình 1.4 Nguyên lý của cảm biến sinh học DNA 12 Hình 1.5 Mô hình cảm biến miễn dịch sợi nano phát hiện vi rút 14 Hình 1.6 Vị trí của cảm biến sinh học so với các kỹ thuật truyền thống 15 khác để chẩn đoán bệnh Hình 1.7 Tốc độ phát triển cảm biến sinh học trong 20 năm trở lại đây 15 và dự báo xu hướng phát triển Hình 1.8 Mô hình ứng dụng của màng polyme dẫn 19 Hình 1.9 Cấu trúc và sự lai hóa của phân tử DNA 21 Hình 1.10a Ảnh hiển vi điện tử truyền qua của vi rút Herpes - nhuộm âm 27 bản Hình 1.10b Cấu trúc vi rút Herpes 27 Hình 1.11 Bệnh nhân bị nhiễm vi rút HSV-1 28 Hình 2.1a Thiết kế cảm biến 70µm x 30µm 32 Hình 2.1b Mô hình cấu trúc vi điện cực của cảm biến 70µm x 30µm 32 Hình 2.2a Thiết kế cảm biến 20µm x 20µm 32 Hình 2.2b Mô hình cấu trúc vi điện cực của cảm biến 20µm x 20µm 32 Hình 2.3 Xử lý bề mặt phiến Si 33 Hình 2.4 Tạo lớp màng SiO2 33 Hình 2.5 Mô phỏng quá trình quang khắc trên phiến silic 35 Hình 2.6 Mô phỏng quá trình phún xạ cao tần tạo màng Pt…. 35 Hình 2.7 Quá trình loại bỏ lớp cảm quang và lớp màng kim loại Pt/Cr 36 không cần thiết Hình 2.8 Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường lạnh S-4800-Hitachi 41 Hình 2.9 Máy phân tích phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier 43 Hình 2.10 Dạng sóng từ bộ khuếch đại Lock-in 43 Hình 2.11 Hệ đo vi sai sử dụng máy khuyếch đại Lock-in SR830 45 Hình 2.12 Mạch tương đương của hệ đo vi sai 45 Hình 3.1A Vi cảm biến 30µm x 70µm 49 Hình 3.1B Vùng điện cực hoạt động của vi cảm biến 30µm x 70µm 49 Hình 3.2A Vi cảm biến loại 20µm x 20µm 50 Hình 3.2B Vùng điện cực hoạt động của vi cảm biến 20µm x 20µm 50 Hình 3.3 Hình ảnh HVĐTQ của màng polyme dẫn APTS trên bề mặt vi 52 cảm biến Hình 3.4 Phổ FTIR xác nhận các liên kết hóa học giữa DNA đầu dò – 53 màng APTS Hình 3.5 Tín hiệu lai hóa theo thời gian tương ứng với nồng độ mẫu 55 phân tích bằng 0,5nM Hình 3.6 Tín hiệu lai hóa theo sự thay đổi nồng độ mẫu phân tích ở 56 nhiệt độ phòng Hình 3.7 Tín hiệu lai hóa theo thời gian tương ứng với các nồng độ 58 mẫu phân tích khác nhau Hình 3.8 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng phát hiện DNA bổ 59 sung của vi cảm biến theo nồng độ mẫu phân tích Hình 3.9 Tín hiệu lai hóa theo nhiệt độ của vi cảm biến với nồng độ 60 mẫu 1nM Hình 3.10 Hình ảnh PCR dương tính với HSV của bệnh nhân ký hiệu 61 VN055 Hình 3.11 Khả năng phát hiện DNA đặc hiệu của HSV trong sản phẩm 62 PCR Hình 4 Đo đạc thử nghiệm vi cảm biến trên hệ đo mới 72 Thank you for evaluating AnyBizSoft PDF Splitter. A watermark is added at the end of each output PDF file. To remove the watermark, you need to purchase the software from http://www.anypdftools.com/buy/buy-pdf-splitter.html 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, rất nhiều các nhà khoa học trong nước và Quốc tế đã tập trung nghiên cứu chế tạo ra loại cảm biến sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, thiết bị nhỏ gọn, sử dụng tiện ích và cho kết quả tin cậy. Thiết bị này được đánh giá với nhiều tính năng vượt trội và có khả năng khắc phục được hầu hết nhược điểm của các thiết bị phân tích truyền thống khác như ELISA, PCR... Trong tương lai gần, các nhà khoa học dự đoán rằng các thiết bị truyền thống sẽ dần bị thay thế bởi các thế hệ cảm biến sinh học do chính những tiện ích của nó mang lại. Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, ba loại cảm biến sinh học chủ yếu thường được tập trung nghiên cứu chế tạo là : i) cảm biến enzyme trên cơ sở phản ứng đặc hiệu enzyme – cơ chất; ii) cảm biến miễn dịch trên cơ sở phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể; iii) cảm biến DNA trên cơ sở lai hóa đặc hiệu giữa hai sợi đơn DNA có trình tự bổ sung nhau. Trong phát hiện vi rút gây bệnh, hai loại cảm biến sinh học thường được tập trung nghiên cứu hơn cả là: cảm biến miễn dịch và cảm biến DNA. Với mục tiêu phát triển và chế tạo ra loại vi cảm biến sinh học để có thể ứng dụng trong phát hiện vi rút gây bệnh tại Việt Nam, đồng thời phục vụ cho luận văn cao học, tác giả đã đề xuất đề cương đề tài ‘‘Cảm biến sinh học trên cơ sở polyme dẫn trong phát hiện vi rút gây bệnh’’ với các nhiệm vụ: - Chế tạo bộ vi cảm biến thích hợp cho việc phân tích, dò tìm những mẫu sinh học có nồng độ thấp. - Lựa chọn loại polyme dẫn thích hợp, tương thích với mẫu sinh học và có khả năng tạo màng trên bề mặt vi cảm biến, không tham gia vào các phản ứng sinh hóa giữa phần tử sinh học đầu dò và phần tử đích. - Lựa chọn phần tử sinh học đầu dò, cố định lên bề mặt vi cảm biến - Đo đạc thử nghiệm với mẫu phân tích để xác định độ nhạy và các thông số khác của vi cảm biến trong phát hiện vi rút gây bệnh. Đề cương này đã được Trường Đại học công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội chấp thuận. Dưới sự hướng dẫn khoa học của Tiến sỹ Mai Anh Tuấn, sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu cảm biến sinh học - Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, tác giả đã triển khai nghiên cứu phát triển loại cảm biến 2 sinh học DNA trên cơ sở polyme dẫn 3-aminopropyl–triethoxy-silance (APTS) để phát hiện axit nucleic của vi rút Herpes týp 1 và 2 (HSV) thông qua việc dò tìm đoạn DNA đặc hiệu của loại vi rút này. So với mục tiêu và nhiệm vụ đề ra, tác giả đã hoàn thành đề tài với những kết quả khả quan. Một số kết quả đã được tác giả công bố trên các tạp chí, hội nghị chuyên ngành trong nước và Quốc tế. Tác giả nhận thấy rằng, loại cảm biến này có độ nhạy rất cao, tín hiệu lai hóa giữa DNA đầu dò trên bề mặt vi cảm biến và DNA bổ sung xuất hiện rất nhanh khoảng 1 phút tại nồng độ 0,5nM ở nhiệt độ phòng và kết quả cũng đạt được tương tự đối với DNA đặc hiệu của HSV ở nhiệt độ 50°C – 55°C. Tuy nhiên, tín hiệu đầu ra thu được từ sự lai hóa thường xuất hiện rất nhỏ, do đó để đưa vào ứng dụng thực tế cần phải có nghiên cứu sâu hơn, đồng bộ hơn để khuyếch đại, tăng tín hiệu đầu ra. Quá trình thực nghiệm, các kết quả cũng như những bàn luận được tác giả trình bày chi tiết trong luận văn. Bố cục của luận văn được trình bày như sau : Chương 1 . Tổng quan Trong chương này, tác giả trình bày tổng quan về lịch sử, khái niệm cũng như nguyên lý, phân loại của cảm biến sinh học. Bên cạnh đó, những kiến thức về polyme dẫn, cách lựa chọn, cố định polyme dẫn lên bề mặt cảm biến và một số khái niệm cơ bản về vi rút học, sinh học phân tử cũng được tác giả nêu ra. Chương 2. Chế tạo cảm biến sinh học Chương này mô tả toàn bộ quá trình thực nghiệm để thực hiện đề tài. Bắt đầu từ việc lựa chọn vật liệu, hóa chất, tiếp theo là mô tả việc thiết kế, chế tạo loại cảm biến vi điện cực thế hệ mới loại 70µm x 30µm và 20µm x 20µm, quá trình lựa chọn, pha tạp và tổng hợp polyme dẫn lên bề mặt vi cảm biến. Cuối cùng, mô tả cách cố định phần tử sinh học đầu dò lên vi cảm biến, đo đạc các thông số và thiết lập hệ đo, phương thức đo đối với mẫu phân tích. Chương 3. Kết quả và bàn luận Trong chương này, toàn bộ kết quả của quá trình thực nghiệm được trình bày và những bàn luận của tác giả đối với những kết quả đạt được, từ đó đưa ra kết luận và những ý kiến đề xuất. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học Giáo sư Lenan C Clark là người đầu tiên phát minh ra điện cực oxy năm 1956, khởi nguồn của Công nghệ cảm biến sinh học [16]. Năm 1962, tại Hội thảo khoa học của Viện Hàn lâm Khoa học New York, ông đã đề xuất một hướng nghiên cứu mới : ‘‘Làm thế nào để tạo ra cảm biến điện hóa thông minh hơn (pH, phân thế, độ dẫn,…) ?’’ khi đưa thêm vào ‘‘lớp chuyển tiếp enzyme giống như màng kẹp giữa, theo kiểu xếp chồng’’. Khái niệm này sau đó được làm sáng tỏ bằng thực nghiệm khi người ta sử dụng điện cực oxy Clark để bẫy men đường (glucose oxidase) thông qua màng thẩm tách. Độ giảm của nồng độ oxy đo được tỷ lệ với nồng độ glucose. Trong một công trình công bố năm 1962, Clark và Lyon lần đầu tiên đưa ra khái niệm điện cực enzyme [15]. Updike và Hick đã triển khai chi tiết thực nghiệm để chứng minh sự cần thiết để tạo ra điện cực enzyme chức năng đo nồng độ glucose mặc dù nhận được rất nhiều phê bình từ các nhà chuyên môn [59]. Năm 1969, Guilbault và Montalvo công bố chi tiết về điện cực enzyme bằng phương pháp đo thế [28]. Hai ông mô tả cảm biến urea trên cơ sở cố định chất urease tại điện cực màng chất lỏng lọc lựa amoniac. Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực khi công ty thiết bị Yellow Springs (Ohio, Mỹ) giới thiệu lần thứ hai (lần đầu năm 1973) về thiết bị phân tích glucose sử dụng phương pháp đo thế. Năm 1974, Cooney và đồng nghiệp đề xuất sử dụng bộ chuyển đổi nhiệt cho cảm biến sinh học. Những thiết bị mới loại này được đặt tên tương ứng với đầu dò enzyme nhiệt [18] và men cặp nhiệt [40]. Sự phát triển cảm biến sinh học đã tạo bước đột phá mới vào năm 1975, khi Divis cho rằng có thể sử dụng vi khuẩn làm yếu tố nhận biết sinh học trong các điện cực vi sinh vật để đo nồng độ cồn [25]. Công trình của ông đã khởi đầu cho hướng nghiên cứu chính ở Nhật Bản nhằm tạo ra các loại cảm biến sinh học có khả năng ứng dụng trong kiểm soát môi trường và Công nghệ sinh học. Cũng trong năm 1975, Lubbers và Optitz đưa ra thuật ngữ optode để mô tả cảm biến sợi quang học có gắn chất chỉ thị để đo oxit cácbon II (CO2) hoặc oxy. Trên cơ sở đó, hai ông và đồng nghiệp đã tạo ra cảm biến sinh học tín hiệu quang để đo nồng độ cồn [60]. Năm 1976, Clemens và đồng nghiệp đã tích hợp thành công cảm biến sinh học glucose điện hoá trong tuyến tụy nhân tạo [17], sau đó được Miles (Elkhart) tung ra thị 4 trường với thương hiệu: Biostator. Cùng thời gian này, La Roche (Thuỵ Sỹ) đã giới thiệu bộ phân tích Lactat LA 640 sử dụng chất trung gian dehydrogenase để truyền tải điện tích từ lactat đến điện cực. Mặc dù không thành công về mặt thương mại nhưng thiết bị này lại là một dự báo quan trọng cho một thế hệ cảm biến sinh học mới ra đời. Một tiến bộ lớn của cảm biến sinh học đo glucose ứng dụng trong cơ thể sống được công bố bởi Shichiri và đồng nghiệp năm 1982, khi lần đầu tiên họ mô tả điện cực enzyme kiểu hình kim cấy dưới da [54]. Nhiều công ty vẫn đang theo đuổi triển vọng để phát triển loại thiết bị này, nhưng hiện nay sản phẩm vẫn chưa xuất hiện trên thị trường. Trong khi đó, ý tưởng tạo ra bộ cảm biến miễn dịch trực tiếp bằng cách cố định kháng thể lên bộ phận chuyển đổi điện thế hay áp điện đã được khảo sát ngay từ những năm 1970 [38], các nhà khoa học đã mô tả khả năng sử dụng cộng hưởng plasmon bề mặt để kiểm soát ngay trong thời gian các phản ứng ái lực xảy ra. Năm 1990, BIAcore (Pharmacia, Thuỵ Điển) đã cho ra mắt loại cảm biến dựa vào công nghệ này. Năm 1984, rất nhiều công trình công bố sử dụng ferrocene và dẫn xuất của nó làm môi trường trung gian để cố định phần tử đầu dò trong cấu trúc điện cực enzyme với giá thành rẻ [13]. Loại cảm biến này được chế tạo trên cơ sở điện cực enzyme bằng kỹ thuật in lưới do MediSense (Cambridge, Mỹ) đề xuất năm 1987 nhằm tạo ra thiết bị kiểm tra nồng độ glucose trong máu có kích cỡ nhỏ như chiếc bút viết. Doanh thu bán hàng của công ty Medisense tăng theo hàm mũ, đạt tới 175 triệu USD năm 1996. Các tạp chí chuyên ngành hiện nay đăng tải một số lượng lớn các công trình nghiên cứu về các thiết bị khai thác các tính năng của enzyme, axit nucleic, thụ thể tế bào, kháng thể,… kết hợp với các bộ chuyển đổi nhiệt, quang, áp điện, điện hoá [58]. Mỗi phương pháp có thể được sử dụng cho rất nhiều các yếu tố phân tích khác nhau như trong chăm sóc sức khỏe, thực phẩm, kiểm soát môi trường, an ninh quốc phòng, chống khủng bố sinh học,… [8,24,35,60]. Theo Fuji-Keizai Group (Mỹ) dự đoán rằng doanh thu của thị trường cảm biến trên toàn thế giới năm 2007 sẽ đạt khoảng 10,8 tỷ đô la với tốc độ tăng trưởng 10,4% [64]. Với những ưu điểm vượt trội như độ nhạy, độ đặc hiệu, tính chọn lọc cao, thiết bị đơn giản, gọn nhẹ, khả năng phát hiện nhanh, tại chỗ, giá thành rẻ, nên cảm biến sinh học có triển vọng vượt qua hầu hết nhược điểm của các thiết bị thông thường khác. Vì vậy, loại cảm biến này ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm tối ưu hóa các tính năng và khả năng ứng dụng trong phân tích chất lượng thực phẩm 5 [7], kiểm soát môi trường [52], công nghiệp dược [19], chống khủng bố sinh học [31] và đặc biệt là trong chẩn đoán bệnh nhằm phát hiện ra các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn [42], vi rút [9,46,47,48,50]. Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, cảm biến sinh học đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học như ở Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,... Một số kết quả về cảm biến sinh học được nghiên cứu chế tạo trong nước đã được công bố như: cảm biến enzyme để phát hiện nồng độ thuốc trừ sâu, cảm biến DNA, ... [4,5,29,39]. Với tiềm năng phát triển và ứng dụng của cảm biến sinh học trong khoa học sự sống, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện gen của một số loại vi rút gây bệnh trên người như vi rút Herpes týp 1&2 – tác nhân gây bệnh lở loét vùng mặt và vùng sinh dục phổ biến nhất trên toàn cầu, vi rút cúm A - loại vi rút đang được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) quan tâm hàng đầu,... Việt Nam là một trong những nước nằm trong vùng nóng về dịch và nguy cơ xảy ra đại dịch của cả hai loại vi rút này. Một số kết quả ban đầu về nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học ứng dụng trong y sinh học đã được tác giả công bố trên các tạp chí, hội nghị trong nước và Quốc tế [4,5,29,39]. 1.2 Cảm biến sinh học 1.2.1 Khái niệm cảm biến sinh học Hiệp hội quốc tế về hoá học ứng dụng - IUPAC năm 1999 đã định nghĩa: cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả năng cung cấp những thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, sử dụng một yếu tố nhận biết sinh học (thụ thể sinh hóa) duy trì sự tiếp xúc không gian trực tiếp với một phần tử chuyển đổi [22]. Theo Daniel R. Thévenot và đồng nghiệp, hệ thống nhận biết sinh học chuyển thông tin từ vùng sinh hoá, thường là nồng độ chất phân tích thành tín hiệu vật lý hoặc hóa học ở đầu ra với độ nhạy xác định. Mục đích chính của hệ thống nhận biết này nhằm tạo cho cảm biến có độ chọn lọc cao đối với chất cần phân tích. Phần tử nhận biết sinh học có thể là enzyme, DNA/RNA, kháng nguyên/kháng thể, tế bào,…như mô tả trong bảng 1.1. Để phát hiện vi rút gây bệnh có thể dựa trên việc phát hiện kháng thể/kháng nguyên thông qua cảm biến miễn dịch hoặc phát hiện DNA/RNA đặc hiệu của từng loại vi rút thông qua cảm biến DNA. Trong khuổn khổ 6 của luận văn, tác giả chỉ tập trung giới thiệu về cảm biến DNA với phần tử nhận biết sinh học là DNA để phát hiện axit nucleic đặc hiệu của vi rút gây bệnh. Bảng 1.1. Các loại thụ thể sử dụng trong cảm biến sinh học và kỹ thuật đo điện hoá [22] Chất phân tích 1. Ion Hệ thống ghi nhận thụ thể/hóa học Thể mang ion sinh học, tinh thể vô cơ dẫn ion, enzyme, thủy tinh trao đổi ion,… Màng kỵ nước hoặc lớp lipid kép; 2. Khử mùi, khí, Điện cực kim loại trơ; gas Enzyme; Kháng thể, thụ thể 3. Chất nền Enzyme; tế bào; thụ thể; Mô động hoặc thực vật Kỹ thuật đo lường/ phương thức chuyển đổi Điện thế; Thế-dòng Điện thế; Thế-dòng Dòng điện; Dòng điện hoặc điện thế Dòng điện, điện thế hoặc trở kháng, áp điện hoặc quang học Dòng điện hoặc điện thế, độ dẫn, áp điện, calo Kháng nguyên/ Kháng thể; 4. Kháng thể / Oligonucleotid; Kháng nguyên Gắn enzyme; gắn chất phát huỳnh quang hoặc quang hoá Điện thế, dòng điện, trở kháng, áp điện, quang học hay cộng hưởng plasmon bề mặt 5. Protein hoặc các loại ion, chất nền có khối lượng phân tử thấp Điện thế, dòng điện, trở kháng, áp điện, quang học hay cộng hưởng plasmon bề mặt Các kênh , thụ thể protein phối tử đặc biệt; gắn enzyme hoặc các chất phát huỳnh quang Chìa khoá của cảm biến sinh học chính là bộ chuyển đổi, đây là bộ phận chuyển tín hiệu không điện từ hệ thống nhận biết sang tín hiệu điện. Phần tử chuyển đổi có thể là vi điện cực, ISFET, linh kiện quang, nhiệt,…Một số phương thức chuyển đổi thông dụng như: điện hoá, quang học, áp điện hay nhiệt,…[30,43,44]. - Chuyển đổi điện hoá: gồm các phép đo dòng, thế, hiệu ứng trường hay độ dẫn. + Phép đo dòng: cơ bản dựa trên sự thay đổi dòng điện từ quá trình oxy hóa khử điện hóa của đối tượng phân tích làm hoạt hoá các điện tích. Phương pháp này thường được thực hiện bởi sự duy trì một điện thế không đổi tại điện cực hoạt động 7 như các bon (C), platin (Pt) hay vàng (Au) hoặc trên một dãy điện cực so với một điện cực chuẩn so sánh. Dòng thu được liên quan trực tiếp đến nồng độ khối đối tượng phân tích hoạt hóa điện tích hoặc mức tiêu hao sinh ra trong lớp chất xúc tác sinh học. Tốc độ phản ứng của chất xúc tác sinh học được chọn phụ thuộc trước tiên vào nồng độ khối chất phân tích, cũng giống như dòng ổn định thường tương ứng với nồng độ khối chất phân tích [30,44]. + Phép đo thế: liên quan đến việc xác định sự chênh lệch thế giữa một điện cực chỉ thị và một điện cực chuẩn so sánh hoặc hai điện cực chuẩn so sánh cách nhau bởi một lớp màng mỏng nào đó không có dòng đi qua. Bộ chuyển đổi này có thể là điện cực lựa chọn ion (ISE). Hầu như các thiết bị đo thế phổ biến nhất hiện nay là các điện cực pH; và một vài loại điện cực lựa chọn khí như (CO2, NH3) hay ion (F-, I-, CN-, Na+, K+, Ca2+, NH4+). Điện thế khác nhau giữa điện cực chỉ thị và điện cực chuẩn so sánh tỷ lệ với hàm lôgarit độ hoạt động của ion, sự giảm nồng độ khí [53]. + Đo độ dẫn: Độ dẫn điện là đại lượng đặc trưng cho khả năng dẫn điện của vật liệu. Phản ứng giữa đầu dò và các phần tử đích làm thay đổi thành phần của chất dẫn điện khiến độ dẫn điện của chất đó thay đổi. Các phản ứng enzyme, như urease và nhiều thụ thể màng sinh học có thể được kiểm soát bởi các thiết bị đo trở kháng hay độ dẫn ion sử dụng các vi điện cực xen kẽ nhau [45]. (a) Không có liên kết ái lực điện. (b) Có liên kết ái lực điện Hình 1.1. Hình thái bề mặt của cảm biến trước (a) và sau khi lai hoá (b) [45] Nguyên lý hoạt động của phép đo độ dẫn của cảm biến DNA dựa trên sự lai hoá giữa các chuỗi đơn DNA trên bề mặt cảm biến. Khi có sự lai hoá, liên kết hydro được hình thành giữa các bazơ tạo nên chuỗi xoắn kép (mạch đôi), làm thay đổi mật độ các ion tích điện ở lân cận bề mặt cảm biến (hình 1.1), kết quả là làm thay đổi trở kháng hay độ dẫn của môi trường giữa hai điện cực của cảm biến. 8 + Tranzito hiệu ứng trường (FETs): sự thay đổi quan trọng của các hệ thống thường xác định nồng độ ion là tranzito hiệu ứng trường (ISFET). ISFETs được tạo bởi một loại màng lựa chọn ion gắn trực tiếp với cực cửa cách điện của FET [34]. Khi ISFETs gắn với lớp phức hợp sinh học hay xúc tác sinh học, chúng trở thành cảm biến sinh học và thường được gọi là tranzito hiệu ứng trường miễn dịch (IMFETs) hay enzyme (ENFETs). Các thuộc tính hoạt động của các thiết bị dựa trên ENFETs hay IMFETs liên quan rất lớn đến cảm biến sinh học trên cơ sở ISE. Bảng 1.2 mô tả một số kiểu đo tương ứng với các bộ chuyển đổi của những đối tượng phân tích khác nhau. Bảng 1.2. Kiểu đo tương ứng với các bộ chuyển đổi điện hoá và đối tượng phân tích [22] Kiểu đo 1. Điện thế 2. Dòng điện Bộ chuyển đổi Điện cực lựa chọn ion (ISE); Điện cực thuỷ tinh; Điện cực khí Điện cực kim loại Điện cực kim loại hoặc các bon; Các điện cực tạo bởi phương pháp hoá học Đối tượng phân tích K+, Cl-, Ca+, F-; H+, Na+,…; CO2, NH3; Các loại oxy hoá khử O2, đường, cồn,… Đường, cồn, phenol, oligonucleotid,… 3. Độ dẫn, trở kháng Các điện cực đan xen; điện cực kim loại Urea, loại mẫu tích điện, oligonucleotid,… 4. Hiệu ứng trường hoặc mang ion Tranzito hiệu ứng trường lựa chọn ion (ISFET); enzym FET (ENFET) H+, K+,… - Chuyển đổi quang học: Khi có sự tương tác giữa các phần tử sinh học đầu dò và phần tử đích tạo ra một số đặc tính quang học như khả năng kích thích phát huỳnh quang, sự hấp thụ, khúc xạ hay nhiễu xạ ánh sáng,...[33]. Từ đó, người ta có thể gắn vào các phần tử đích một chất đặc biệt như chất có khả năng phát quang khi xảy ra tương tác, đồng thời tạo ra bộ chuyển đổi thích hợp để chuyến đổi các tín hiệu quang thu được thành tín hiệu điện đầu ra [19,51]. - Chuyển đổi áp điện: Phần tử sinh học đầu dò và phần tử đích khi tương tác với nhau sẽ tạo ra sự thay đổi khối lượng. Thay đổi này có khả năng làm cho tần số dao động của tinh thể áp điện thay đổi tới 2% và được đo bởi một mạch điện đơn giản. Lợi dụng các đặc tính này, người ta chế tạo ra bộ chuyển đổi áp điện cho cảm biến sinh 9 học. Tuy nhiên, cản trở lớn nhất của cảm biến sinh học kiểu này là ảnh hưởng của độ ẩm không khí và khó khăn khi phân tích mẫu trong dung dịch [49]. - Chuyển đổi nhiệt: Hầu hết các phản ứng có enzyme hay vi sinh vật xúc tác đều giải phóng nhiệt, nên người ta thiết kế thiết bị đặc biệt theo dõi sự thay đổi của nhiệt có thể được ứng dụng làm phần tử chuyển đổi trong cảm biến sinh học. Tuy nhiên, chuyển đổi nhiệt đòi hỏi thiết lập hệ thống rất phức tạp (hệ đo điện dung,…), hệ thống phải được cách nhiệt tốt, không xảy ra sự trao đổi nhiệt [26]. 1.2.2 Nguyên lý cảm biến sinh học Cảm biến sinh học hoạt động trên cơ sở thu nhận các tín hiệu từ sự tương tác giữa các phần tử dò trong hệ thống nhận biết sinh học với các phần tử đích trong mẫu cần phân tích thông qua bộ chuyển đổi [36]. Nguyên lý của cảm biến sinh học được mô tả ở hình 1.2. Hình 1.2. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học. Thông thường, mỗi phần tử nhận biết sinh học chỉ nhận biết được một hay một nhóm đối tượng phân tích. Khi cho cảm biến sinh học tiếp xúc với mẫu phân tích, nếu phần tử đầu dò tương thích với phần tử đích phản ứng sinh hóa sẽ xảy ra, đồng thời tạo ra một tín hiệu: thay đổi nồng độ ion, kích thích huỳnh quang, hấp thụ ánh sáng, nhiệt, thay đổi khối lượng,…Tuỳ theo từng loại tín hiệu mà người ta thiết kế bộ chuyển đổi 10 phù hợp để chuyển thành tín hiệu điện. Nếu phần tử đầu dò không tương thích với phần tử đích thì tín hiệu thay đổi sẽ không xảy ra hoặc xảy ra rất yếu. 1.2.3 Phân loại cảm biến sinh học Với các hệ thống nhận biết sinh học và bộ chuyển đổi khác nhau, ta có thể phân loại cảm biến sinh học theo nhiều cách nhưng chủ yếu là dựa vào hai yếu tố trên. Hiện nay, trong chẩn đoán bệnh, người ta chủ yếu quan tâm đến ba loại cảm biến sinh học: i) cảm biến enzyme, ii) cảm biến miễn dịch, iii) cảm biến DNA [42]. 1.2.3.1 Cảm biến enzyme (Enzyme biosensors) Hầu hết các phản ứng sinh hoá trong hệ thống sống được xúc tác bởi các enzyme đặc biệt. Chức năng của enzyme gồm có: phần đầu là tên loại phần tử làm cơ chất cho enzyme, phần sau thêm đuôi ase ; như nuclease để cắt axit nucleic. Hai đặc trưng cơ bản của enzyme là khả năng xúc tác lớn và tính đặc hiệu cao. Các đặc tính này không những phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1 mà còn được qui định bởi sự sắp xếp trong không gian của phần tử enzyme để hình thành các vị trí hoạt động [2]. Cơ chất tương tác với enzyme theo hai cơ chế : - Cơ chế 1 : Điện tích hay/và hình dạng bổ sung của hai phần tử này phù hợp hoàn toàn với nhau hình thành nên một cơ chất bền vững. - Cơ chế 2 : Sự gắn cơ chất vào enzyme làm thay đổi cấu hình của enzyme và đưa toàn bộ phức hợp vào một trạng thái thuận lợi cho phản ứng xúc tác. Trong các phản ứng xúc tác, các enzyme không gắn lên mọi phần tử, mà chúng chỉ có ái lực đặc biệt với chính cơ chất của chúng bằng một loại liên kết yếu có năng lượng khoảng 5-10 kcal mol-1. Do đó, liên kết này dễ bị phá huỷ bởi chuyển động nhiệt. Tốc độ của các phản ứng sinh hoá khi có enzyme xúc tác thường có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không xúc tác. Enzyme sử dụng rộng rãi trong cảm biến sinh học có vai trò như một chất xúc tác. Tuy nhiên, nhóm quan trọng nhất là những enzyme oxy hóa khử, thủy phân oxy hóa hay sự khử sử dụng hoặc oxy hoặc những đồng tác nhân (cofactors). Enzyme có thể được sử dụng riêng lẻ như trong những cảm biến sinh học xúc tác hoặc có thể được sử dụng kết hợp hợp với các thành phần khác, giống như kháng thể đóng vai trò như phần tử nhận biết để tạo thành bộ khuyếch đại tín hiệu. Nhiều enzyme không thích hợp để sử dụng trong các thiết bị do sự không ổn định và 11 biến đổi của enzyme. Vì vậy, phải cải thiện tính ổn định theo mong muốn bằng một số cách, bao gồm: sự ổn định hóa học, quá trình cố định nhằm tạo ra sự ổn định và đòi hỏi enzyme từ các nguồn khác như những sinh vật ưa nhiệt. Cảm biến sinh học enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là cảm biến đo nồng độ glucose trong máu [32]. Hình 1.3. Mô hình một loại cảm biến enzyme đo nồng độ glucose. Trong đó, lớp enzyme được cố định cộng hóa trị lên bề mặt điện cực kim cương. Tầng phản ứng điện hóa bắt đầu bởi sự xuất hiện của glucose sẽ được chuyển đổi thành dòng điện đo được tại điện cực. Nguồn: http://images.iop.org/.../news/thumb/3/9/13/garrido.jpg 1.2.3.2 Cảm biến DNA (DNA biosensors) Nguyên lý của cảm biến DNA cơ bản dựa trên sự lai hoá của DNA. Khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của “nhiệt độ biến tính” (Tm), sẽ không xảy ra sự tái bắt cặp trở lại nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột dưới nhiệt độ biến tính, lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian mất trật tự. Ngược lại, nếu sau khi hai mạch đơn tách rời, nhiệt độ giảm từ từ, cộng với những điều kiện thí nghiệm thích hợp thì hai mạch sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là lai hoá phân tử [2]. Sự lai hóa có hai đặc điểm sau: