Tài liệu Cải tiến quy trình ly trích dna từ niêm mạc miệng ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -------------------- TĂNG NGỌC KIỀU VY CẢI TIẾN QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ NIÊM MẠC MIỆNG ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM QUAN HỆ HUYẾT THỐNG Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ Tp. HCM, tháng 05 năm 2018 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp-HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS Nguyễn Thúy Hương Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Hoàng Anh Hoàng Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 26 tháng 05 năm 2018 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1. Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 2. Thư ký: TS. Huỳnh Ngọc Oanh 3. Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng 4. Phản biện 2: TS.Hoàng Anh Hoàng 5. Ủy viên: Võ Đình Lệ Tâm Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TĂNG NGỌC KIỀU VY MSHV: 7140301 Ngày, tháng, năm sinh: 29/06/1989 Nơi sinh: TP.HCM Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 I. TÊN ĐỀ TÀI: “Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng Ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống” II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Đề xuất được quy trình ly trích phù hợp cho niêm mạc miệng ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống. Nội dung đề tài bao gồm: - Khảo sát hiệu quả ly trích của một số quy trình ly trích DNA, lựa chọn quy trình ly trích phù hợp. - Cải tiến quy trình được chọn. - Ly trích so sánh với bộ ly trích thương mại trên 10 mẫu và ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu, từ đó đánh giá tính khả thi của quy trình đề xuất. III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/09/2017 IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2018 V. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 2018 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO PGS.TS. Nguyễn Thúy Hƣơng PGS.TS. Nguyễn Thúy Hƣơng TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ii LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của Quý Thầy Cô, cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ. Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến cô Nguyễn Thúy Hương - PGS.TS trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM, người đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu, hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn này. Cảm ơn sự kiên nhẫn và sự động viên của cô dành cho em trong suốt thời gian dài thực hiện đề tài. Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến ThS. Huỳnh Viết Lộc và các anh chị nhân viên Viện Sinh Học Phân Tử LOCI đã cung cấp, hỗ trợ trang thiết bị vật tư cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn. Để có được nguồn kiến thức cho phép em thực hiện được nghiên cứu này, em xin cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Bách Khoa – nơi em gắn bó trong suốt những năm học vừa qua. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh TP.HCM, tháng 4 năm 2018 Học viên thực hiện Tăng Ngọc Kiều Vy iii TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Quy trình ly trích thô DNA trong một đến hai bước thao tác cho thấy nhiều tiền năng ứng dụng trong thực tiễn. Thêm vào đó sự ra đời của các thế hệ Taq polymerase kháng ức chế cho phép thực hiện phản ứng PCR trên đối tượng mẫu DNA chứa nhiều tạp chất là điều kiện cho phép chúng tôi xây dựng quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng trên cơ sở cải tiến quy trình ly trích thô DNA bằng NaOH-SDS (có nồng độ SDS 0.025%) mà kết quả thử nghiệm cho thấy rằng phù hợp nhất cho phản ứng PCR -STR. Tiếp tục khảo sát hiệu quả ly trích ở các nồng độ SDS khác nhau, đề tài tìm được nồng độ SDS phù hợp cho ly trích niêm mạc miệng là 0.01%. Để đánh giá hiệu quả của quy trình ly trích cải tiến đã đưa ra, đề tài thực hiện ly trích so sánh quy trình này với bộ kit ly trích thương mại trên 10 mẫu và ứng dụng ly trích trên 200 mẫu. So sánh trên 10 mẫu, quy trình ly trích cải tiến tuy cho cường độ huỳnh quang trung bình thấp hơn bộ kit thương mại nhưng kết quả phân tích vẫn chính xác và trùng khớp. Trên 200 mẫu, kết quả cho thấy không có mẫu nào bị ức chế, hơn 90% mẫu cho sản phẩm PCR có cường độ huỳnh quang trên 100 RFU và 100% cho tín hiệu cao trên 50 RFU. Đối các cặp mẫu đã biết mối quan hệ huyết thống, kết quả trả về trùng khớp. Ngoài ra, quy trình còn cho thấy nhiều ưu thế là thao tác chỉ gồm hai bước đơn giản, giảm rủi ro, rút ngắn thời gian ly trích chỉ còn 15 phút, giảm giá thành 1/10 so với các bộ kit ly trích đang thương mai hóa trên thị trường hiện nay. Đề tài sau khi thực hiện đã đề xuất được quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng, ứng dụng được trong xét nghiệm quan hệ huyết thống trên bộ kit PowerPlex ®Fusion System. iv SUMMARY The crude DNA extraction process in one or two steps demonstrates many of the potential applications in practice. In addition, Taq polymerase’s inhibitors resistance enables PCR amplification without any prior DNA purification, that is a reason for us to construct DNA extraction procedures from buccal swabs on the basis of improved crude DNA extraction procedure by NaOH-SDS. Screening of SDS concentrations, we found that 0.01% is appropriate concentration for crude DNA extraction procedure. To evaluate the effectiveness of the improved extracting procedure, we compared the PCR performance of the improved procedure with a commercially available kit (E.Z.N.A Forensic DNA kit) on 10 samples and applicated to extract DNA on 200 samples. Compared to the 10 samples, the improved extraction procedure had a lower average fluorescence than the commercial kit, but the results were accurate and consistent. On 200 samples, the results showed no samples were inhibited, more than 90% of samples for PCR product had fluorescence intensity above 100 RFU and 100% for signal above 50 RFU. For pairs of samples that know the parentage relationship, the result is match. It also shows that the ability to apply with many advantages (two simple steps, reduce the risk, shorten time - only 15 minutes, reduce the price to 10 time when compared to the commercial kit). These results suggest that, the DNA extraction procedure had built is suitable for DNA testing on Power Plex ®Fusion System kit. v LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Tăng Ngọc Kiều Vy vi MỤC LỤC Trang NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ........................................................................................... ii LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................................. iii TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ............................................................................................. iv LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ LUẬN VĂN ....................................................................... vi MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU .........................................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................................3 1.1. Xét nghiệm quan hệ huyết thống ..................................................................................3 1.1.1. Xét nghiệm dựa trên nhóm máu .........................................................................3 1.1.2. Xét nghiệm dựa trên hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA) ..................................3 1.1.3. Xét nghiệm dựa trên đoạn lặp đa hình ...............................................................4 1.1.3.1. Khái niệm đoạn lặp đa hình ...................................................................4 1.1.3.2. Các kỹ thuật xét nghiệm quan hệ HT bằng đoạn lặp đa hình ................6 1.2. Kỹ thuật PCR-STR ........................................................................................................7 1.2.1. Giới thiệu...........................................................................................................7 1.2.2. Phương pháp thực hiện .....................................................................................7 1.3. Các cải tiến trong DNA polymerase ...........................................................................12 1.4. Các phương pháp ly trích DNA ..................................................................................13 1.4.1. Phương pháp Phenol .......................................................................................13 1.4.2. Phương pháp Boom .........................................................................................14 1.4.3. Ly trích bằng cột lọc .......................................................................................15 1.4.4. Phương pháp ly giải kiềm (alkaline) ...............................................................15 1.5. Ly trích thô DNA bằng các chất biến tính protein ......................................................16 1.5.1. Ưu thế của quy trình ly trích thô .....................................................................16 1.5.2. Một số chất biến tính protein ..........................................................................16 1.5.2.1. Chất chaotropic ..................................................................................16 1.5.2.2. Chất tẩy rửa ........................................................................................17 1.6.Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ưu thế trong xét nghiệm huyết thống ......19 1.6.1. Đặc điểm tế bào niêm mạc miệng .....................................................................19 1.6.2. Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ưu thế cho xét nghiệm .................19 1.6.3. Các nghiên cứu ly trích thô DNA ....................................................................20 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................23 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu .........................................................................................23 2.2. Vật liệu ........................................................................................................................24 2.2.1. Máy móc- Thiết bị ............................................................................................24 2.2.2. Vật tư- hóa chất ................................................................................................24 2.3. Thu nhận mẫu ..............................................................................................................24 2.4. Ly trích khảo sát - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp .............................................25 2.4.1. Ly trích mẫu ......................................................................................................26 2.4.2. Chạy PCR – Phân tích kết quả ..........................................................................28 2.4.3. Phân tích kết quả - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp ..................................28 2.5. Cải tiến quy trình ly trích phù hợp ..............................................................................29 2.6. Đánh giá hiệu quả của quy trình ly trích đã cải tiến ..................................................29 2.6.1.So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình ly trích thương mại .......................29 2.6.2. Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu ...................................................................30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................32 3.1. Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp cho xét nghiệm DNA ........................................32 3.2. Kết quả cải tiến quy trình ly trích NaOH- SDS ..........................................................40 3.3. Đáng giá hiệu quả của quy trình ly trích đã cải tiến ...................................................43 3.3.1. So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình thương mại ....................................43 3.3.2. Ứng dụng ly trích thử nghiệm ...........................................................................46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Kết quả hiển thị Liz scan -WEN Internal Lane Standard ...................................8 Hình 1.2: Kết quả hiển thị cho Allelic ladder với 4 màu huỳnh quang ............................10 Hình 1.3: Kết quả điện di STR bằng bộ kit PowerPlex ®Fusion System..........................11 Hình 1.4: Ly trích bằng silica ............................................................................................14 Hình 1.5: Cấu tạo hóa học chất tẩy rửa ..............................................................................17 Hình 1.6: Cấu trúc hóa học SDS ........................................................................................18 Hình 1.7: Cấu trúc hóa học triton X100 ...........................................................................18 Hình 1.8: Tế bào niêm mạc miệng dưới kính hiển vi ........................................................19 Hình 2.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu ................................................................................23 Hình 2.2: Mẫu niêm mạc miệng trong TE1X ....................................................................25 Hình 3.1: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit ......33 Hình 3.2: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng triton X100 ...................................34 Hình 3.3: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng NaOH ...........................................35 Hình 3.4: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng NaOH + SDS ...............................36 Hình 3.5: Biểu đồ so sánh hiệu quả ly trích của các phương pháp ....................................38 Hình 3.6: So sánh hiệu quả ly trích ở các nồng độ SDS ....................................................41 Hình 3.7: So sánh chiều cao peak trung bình ở hai phương pháp ly trích .........................45 Hình 3.8: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng NaOH+ SDS đã cải tiến ...............47 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các locus STR được phân tích trong bộ kit PowerPlex ®Fusion System .........9 Bảng 2.1: Danh sách đối tượng thu mẫu ............................................................................25 Bảng 2.2: Quy trình ly trích bằng Triton X100..................................................................26 Bảng 2.3: Quy trình ly trích bằng NaOH ...........................................................................26 Bảng 2.4 : Quy trình ly trích bằng NaOH - SDS ...............................................................27 Bảng 2.5: Quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng bộ ly trích cột E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit ...........................................................................................27 Bảng 2.6: Công phức pha mix PCR-STR ..........................................................................28 Bảng 2.7: Công thức pha đệm ly giải ở các nồng độ SDS khác nhau ...............................30 Bảng 3.1: Kết quả so sánh hiệu quả ly trích.......................................................................37 Bảng 3.2: Kết quả điều chỉnh nồng độ SDS ......................................................................42 Bảng 3.3: So sánh hiệu quả ly trích quy trình đã cải tiến và quy trình đối chứng .............45 Bảng 3.4: Kết quả đánh giá hiệu quả ly trích trên 200 mẫu...............................................48 Bảng 3.5: Quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng đã cải tiến ....................................49 Bảng 3.6: So sánh giữa quy trình ly trích thương mại và quy trình ly trích cải tiến .........49 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid STR Short Tandem Repeat HLA Human Leucocyte Antigen RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism CODIS Combined DNA Index system RFU Relative fluorescence units PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator RPM Revolutions per minute WEN ILS WEN Internal Lane Standard 500 MỞ ĐẦU Xét nghiệm quan hệ huyết thống hay còn gọi đơn giản là xét nghiệm DNA không còn quá xa lạ trong xã hội hiện nay. Xét nghiệm này phục vụ một lượng lớn nhu cầu dân sự là kiểm tra quan hệ huyết thống giữa hai hay nhiều cá thể, tìm thân nhân, giải quyết các thủ tục pháp lý, điều tra pháp y. Công nghệ xét nghiệm DNA liên tục được cải tiến, từ những cơ sở ban đầu là dựa trên nhóm máu, hệ kháng nguyên bạch cầu, hiện nay xét nghiệm này được thực hiện trên cơ sở chạy phản ứng PCR multiplex khuếch đại và tiến hành so sánh từ 16 đến 24 vị trí đoạn lặp đa hình STR cho độ chính xác của xét nghiệm gần như là tuyệt đối [1]. Nguồn DNA đầu vào là yếu tố quyết định đến kết quả của phản ứng PCR. DNA không tinh sạch làm giảm hiệu suất hoạt động của taq polymerase hoặc ức chế phản ứng PCR. Các quy trình ly trích DNA truyền thống như quy trình ly trích bằng phenol, Boom và cả các bộ ly trích đã được thương mại hiện nay phục vụ riêng cho xét nghiệm DNA của Qiagen (QIAamp DNA investigator kit), Promega (DNA IQ system), Omega (E.Z.N.A Forensic DNA kit) đều có nhiều bước thực hiện phức tạp nhằm giúp sản phẩm DNA thu được cuối cùng có độ tinh sạch đủ để tham gia phản ứng PCR. Tuy nhiên các quy trình trên đều có nhược điểm lớn là quá trình ly trích càng nhiều bước thực hiện càng làm người kỹ thuật viên dễ gây sai sót, nhầm lẫn, kéo dài thời gian xét nghiệm. Trong khi đó với xét nghiệm DNA chúng tôi yêu cầu một quy trình ly trích mẫu đơn giản (một đến hai bước thao tác) giúp kết quả xét nghiệm cuối cùng là chính xác nhất [2]. Đã có các quy trình ly trích thô DNA trong một đến hai bước thao tác được báo cáo trước đây. Tuy nhiên sản phẩm DNA thu được từ các quy trình này chỉ tham gia được một số phản ứng PCR đơn giản [3]. Vì vậy, vào thời điểm đó, các báo cáo này không được ứng dụng trong thực tiễn. Hiện nay công nghệ sinh học đã có những bước tiến đáng kể trong kỹ thuật enzyme tái tổ hợp, các nhà sản xuất như Qiagen, Promega lần lượt cho ra các sản phẩm taq polymerase kháng ức chế. Nghĩa là phản ứng PCR phức tạp nhất vẫn có thể được thực hiện trên đối tượng DNA không đạt yêu cầu về độ tinh sạch [3]. 1 PowerPlex ®Fusion System là bộ kit được sử dụng trong hầu hết các phòng xét nghiệm huyết thống hiện nay cho phép kiểm tra 24 vị trí STR trong một phản ứng multiplex PCR. Bộ kit được nhà sản xuất khuyến cáo hoạt tính kháng ức chế của taq polymerase tốt hơn so với các thế hệ taq polymerase cũ. Tận dụng ưu điểm này, ta hoàn toàn có thể thay thế quy trình ly trích nhiều bước phức tạp bằng quy trình ly trích thô DNA trong một đến hai bước thao tác đơn giản giúp tiết kiệm thời gian, chủ động về mặt kỹ thuật, giảm chi phí và giảm thiểu tối đa rủi ro, nhầm lẫn có thể xảy ra trong quá trình xử lý mẫu [4]. Đối tượng mẫu mà chúng tôi cân nhắc cho quy trình ly trích thô DNA là niêm mạc miệng vì đây là dạng mẫu được ưu tiên thu nhận tại cái phòng xét nghiệm do đặc tính dễ thu nhận, dễ bảo quản, không xâm lấn, lượng DNA dồi dào. Thêm vào đó, cũng đã có một số ly trình ly trích thô DNA từ niêm mạc miệng được công bố trước đây bởi Daniel (1995), Brenda (1992) [5]. Dựa trên các quy trình ly trích đã có, tính năng kháng ức chế của bộ kit đang sử dụng, đề tài: “Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng - Ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống” được thực hiện nhằm đạt được mục tiêu và các nội dung sau: Mục tiêu đề tài: - Đề xuất được quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng phù hợp cho xét nghiệm quan hệ huyết thống, rút ngắn thời gian ly trích, giảm rủi ro, giảm giá thành xét nghiệm. Nội dung đề tài: - Khảo sát hiệu quả của một số quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng đã được công bố, lựa chọn quy trình ly trích phù hợp cho xét nghiệm quan hệ huyết thống. - Cải tiến quy trình được chọn. - Ly trích so sánh với bộ kit ly trích thương mại. - Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu đại diện, từ đó đánh giá tính khả thi của quy trình đề xuất. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Xét nghiệm quan hệ huyết thống Trong xã hội ngày nay, nhu cầu tìm hiểu, xác nhận mối quan hệ huyết thống giữa các cá thể người ngày càng tăng cao. Không chỉ phục vụ cho giải đáp nghi vấn của cá nhân, xét nghiệm này còn phục vụ cho các mục tiêu pháp lý như làm giấy khai sinh, nhập quốc tịch, bảo lãnh, định cư. Ngoài ra, trong điều tra hình sự, xét nghiệm này là công cụ hỗ trợ đắc lực giúp nhận diện cá thể truy lùng dấu vết. Để giải quyết cho các nhu cầu trên, phương pháp xác định quan hệ huyết thống đã sớm ra đời từ đầu những năm 1920 dựa trên các hiểu biết về di truyền. Một số chỉ thị sinh học được sử dụng trong nhận dạng và xác định mối quan hệ huyết thống bao gồm: Nhóm máu; Kháng nguyên bạch cầu- HLA; Các đoạn lặp đa hình. 1.1.1. Xét nghiệm dựa trên nhóm máu Đầu những năm 1900 các nhà khoa học đã xác định được 4 nhóm máu cơ bản của con người là A, B, AB và O dựa trên một số chất cacbohydrat và protein đặc thù trên hồng cầu. Đến những năm 1920, các nghiên cứu cho thấy nhóm máu được quyết định do gen. Gen này quy định bởi 2 alen trội là IA, IB và 1 alen lặn iO, di truyền theo quy luật của Mendel [6]. Do đó các nhà khoa học có thể dự đoán được nhóm máu của đứa trẻ dựa trên nhóm máu của cha mẹ. Tuy nhiên việc sử dụng nhóm máu có những hạn chế nhất định do nó chỉ chính xác 30% và nó không phải là một công cụ hữu hiệu cho việc xác định mối quan hệ huyết thống. Dựa trên nhóm máu này ta chỉ có thể khẳng định được một số trường hợp chắc chắn không phải là cha con. Ví dụ: Cha giả định có nhóm máu O (có cấu trúc gen iO iO), mẹ ruột nhóm máu O (có cấu trúc gen iO iO) nếu con có nhóm máu A, B thì chắc chắn không phải là con của người cha giả định. Tuy nhiên nếu con có nhóm máu O thì vẫn chưa đủ cơ sở để kết luận cha con vì vẫn có rất nhiều người đàn ông máu O. 1.1.2. Xét nghiệm dựa trên hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA) Năm 1970, các nhà khoa học khám phá ra các kháng nguyên bạch cầu (Human Leucocyte Antigen - HLA) của con người là các protein hiện diện trên tất cả các tế bào của cơ thể trừ hồng cầu, đặc biệt HLA tập trung trên tế bào bạch cầu. Kháng 3 nguyên bạch cầu là các protein kháng nguyên hiện diện trên bề mặt tế bào, đóng vai trò quan trọng trong tổ chức miễn dịch của cơ thể cũng như những cơ chế giao tiếp giữa các tế bào. HLA được xác định bằng cách sử dụng các test huyết thanh và kháng thể đơn dòng (anticorps monoclonaux) có mặt trên các tế bào bạch cầu lympho [7]. Có nhiều dạng HLA khác nhau và có sự hiện diện khác nhau ở từng người, tuy các gen quy định cho HLA cũng di truyền theo quy luật Menden. Đứa trẻ khi được sinh ra sẽ có một nửa kháng nguyên bạch cầu di truyền từ bố và một nửa từ mẹ. Do đó xét nghiệm HLA trở thành một công cụ cho phép xác định mối quan hệ huyết thống cha con. Nếu chỉ sử dụng riêng xét nghiệm HLA có thể xác định được mối quan hệ cha con với độ chính xác là 80%, nếu kết hơp với xét nghiệm nhóm máu và xét nghiệm huyết thanh thì kết quả có độ chính xác lên tới 90% [8]. Tuy nhiên xét nghiệm HLA cũng không phải là một công cụ lý tưởng để xác định mối quan hệ huyết thống do xét nghiệm đòi hỏi lượng máu thu ban đầu khá lớn, quá trình lấy máu gây khó chịu và nguy hiểm cho các trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi. Một số yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm như: mẫu máu bị vỡ hồng cầu, người làm xét nghiệm được truyền máu trước đó... Do đó, hiện nay xét nghiệm HLA chủ yếu sử dụng để xác định tính tương hợp mô trước khi ghép tạng, tìm kiếm các HLA liên quan đến một số bệnh lý. 1.1.3. Xét nghiệm dựa trên đoạn lặp đa hình 1.1.3.1. Khái niệm đoạn lặp đa hình DNA được tạo thành từ 4 loại nucleotide, chính sự sắp xếp đa dạng của các nucleotide này làm cho DNA mỗi người trở nên độc nhất vô nhị. Cơ thể mỗi người có tới 3.2 tỉ cặp base, việc xác định, tìm thấy sự khác biệt về trình tự base giữa các cá nhân là không hề đơn giản. Năm 1984, Alec Jeffeya và các cộng sự trong khi nghiên cứu DNA mã hóa cho hemoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các base được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp lại 10-15 base, các đoạn lặp lại này được gọi là các Tandem Repeat Sequence – đoạn lặp lại đa hình [9]. Các Tandem Repeat Sequence có tính đa hình về số lượng rất lớn, chúng khác nhau về 4 số base trong một đơn vị, số lượng đơn vị lặp. Chính sự đa hình này giúp cho sự phân biệt giữa các cá thể trong loài cũng như phân biệt giữa các loài với nhau [10]. Dựa vào số lượng base trong một đơn vị lặp, Tandem Repeat Sequence được chia làm 3 nhóm: - DNA vệ tinh (DNA satellite): đơn vị lặp lại từ một đến vài trăm base. Độ dài vùng lặp lại có thể lên tới vài Mb. DNA satellite thường được tìm thấy ở xung quanh vùng tâm động nhiễm sắc thể. Sự phân bố của chúng đóng vai trò nhất định trong sự phân chia tế bào, được biết chúng liên quan đến sự liên kết các protein điều khiển, kiểm soát quá trình di chuyển của nhiễm sắc thể về cực của tế bào. DNA satellite ít khi được sử dụng làm chỉ thị phân tử nhận dạng cá thể, mà thường dùng làm chỉ thị cho lập bản đồ gen vùng gần tâm động. - DNA tiểu vệ tinh (DNA minisatellite): còn gọi là DNA lặp lại ngẫu nhiên, đa hình (variable number tandem repeat-VNTR). Số lượng base trong một đơn vị dao động từ 10-100 base, lặp lại từ 1-30 lần, chiếm đoạn DNA từ 1- 5kb, thậm chí có thể lên tới 20 kb [11][12]. VNTR phân bố tập trung hoặc rải rác trên nhiễm sắc thể. Dựa vào sự phân bố đó người ta chia DNA minisatellite thành 2 loại:  DNA tiểu vệ tinh đa vị trí (multi–locus mini satellite): Hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen. Các tiểu vệ tinh đa vị trí được phát hiện vào năm 1985.  DNA tiểu vệ tinh đơn vị trí (single –locus mini satellite): chỉ có tại một vị trí trên bộ gen. Nhiều tiểu vệ tinh đơn vị trí có giá trị dấu ấn DNA. - DNA vi vệ tinh (DNA microsatellite): còn gọi là single sequence repeat (SSRs) hay Short Tandem Repeat (STRs) có số lượng base rất ít, từ 1-6 base, được lặp lại nhiều lần thành đoạn khoản 200 base. DNA microsatellite phân bố tập trung hay rải rác trên nhiễm sắc thể, genome, và chúng có tính đa hình về số lượng rất cao giữa các cá thể. Chính vì thế chúng được dùng làm các chỉ thị phân tử rất thông dụng. Một lý do khác là so với các DNA tiểu vệ tinh , ta có thể thiết kế được phản ứng PCR khuếch đại vùng gen chứa trình DNA vi vệ tinh [13]. 5 Giống như các protein trên tế bào máu hay HLA, con cái có bộ nhiễm sắc thể một nửa nhận từ cha và một nửa nhận từ mẹ nghĩa là các đoạn lặp đa hình cũng được di truyền theo. Các đoạn lặp đa hình này đa dạng hơn HLA hay protein trong máu, nó hiện diện trong tất cả các tế bào của cơ thể. Với những đặc tính như vậy nên chúng trở thành chỉ thị phân tử lý tưởng cho xét nghiệm quan hệ huyết thống. 1.1.3.2. Các kỹ thuật xét nghiệm quan hệ huyết thống bằng đoạn lặp đa hình - Xét nghiệm quan hệ huyết thống sử dụng kỹ thuật RFLP Các DNA lặp lại đa hình được dùng như là các chỉ thị phân tử phục vụ các nghiên cứu quan trọng về gen và di truyền. Công nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên được phát triển bởi Jeffereys vào năm 1985, được gọi là RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Kỹ thuật cho phép phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí dựa trên sự đa hình về chiều dài các đoạn DNA. Trong phân tích RFLP, DNA mẫu được cắt thành các đoạn nhỏ bằng các enzyme cắt giới hạn, và sau đó các đoạn DNA nhỏ tạo thành được phân tách dựa theo kích thước bằng kỹ thuật lai Southern Blot. Hai cá thể có cùng quan hệ huyết thống khi họ có chiều dài đoạn DNA sau khi xử lý bằng enzyme cắt giới hạn giống nhau ít nhất một nửa [14] Phương pháp này cho kết quả chính xác trên 99,99%. Tuy nhiên, ngày nay, kỹ thuật này không được sử dụng do RFLP đòi hỏi phải có một lượng mẫu máu lớn, mất nhiều thời gian để thực hiện phân tích, kết quả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng DNA ly trích, thao tác kỹ thuật, chất lượng enzyme cắt và nguy cơ ngoại nhiễm là rất lớn. - Xét nghiệm quan hệ huyết thống sử dụng kỹ thuật PCR-STR Các vị trí vi vệ tinh (STRs) sẽ được nhân bản bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR đem phân tích trên hệ thống điện di mao quản để biết được chiều dài sản phẩm khuếch đại từ đó xác định số lần lặp lại của trình tự STR. Xét nghiệm DNA hiện nay được thực hiện dựa trên so sánh 16 - 24 vị trí STR, từ đó xác suất để 2 cá thể khác nhau có cùng toàn bộ vị trí STR là cực thấp, dưới 10-10 [1]. Các vị trí STR sử dụng trong nhận diện cá thể ở người thông thường là các trình tự dài 4 base vì chúng mang bốn đặc tính tiêu biểu sau: - Tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao, nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau. 6 - Dễ dàng thực hiện khuếch đại nhiều vị trí STR trong cùng một phản ứng PCR. - Đột biến gen thấp. - Kích thước ngắn, khó bị phân hủy bởi các tác động cơ học và hóa học nên có thể thu được từ những mẫu đã bị phân hủy một phần. Các nghiên cứu về các vị trí STR có giá trị trong nhận diện cá thể thực hiện trên quy mô lớn tạo thành cơ sở khoa học cho các bộ kit xét nghiệm DNA hiện nay. CODIS (Combined DNA Index system) là cơ sở dữ liệu DNA lớn nhất toàn cầu, tạo lập bởi FBI – Mỹ. Cơ sở dữ liệu này hiện gồm 13 vị trí STR [13]. Năm 2004, FBI tiến hành phân tích trên 600000 mẫu và xây dựng cơ sở dữ liệu CODIS tại 13 vị trí STR khảo sát. FBI đòi hỏi phân tích nhận diện cá thể có giá trị khi nó phân tích trên 4 vùng RFLP hoặc trên 13 vị trí loci này. Nếu tất cả 13 vị trí loci được phân tích, khả năng hai người sẽ có cùng một bảng DNA là 1/1010, làm cho nó trở thành một phương tiện hiệu quả để nhận diện cá thể [15]. Hai hãng sản xuất các sản phẩm sinh học phân tử là PERKIN ELMER và PROMEGA (Mỹ) đã cho xuất xưởng nhiều bộ kit STR khác nhau; các bộ kit STR trên 3 loci, 9 loci , 12 loci, 16 loci và 24 loci đã lần lượt ra đời. 1.2. Kỹ thuật PCR-STR 1.2.1. Giới thiệu PCR - STR là kỹ thuật cho phép phân tích tính đa hình của các DNA vi vệ tinh bằng việc thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các vị trí STR này và phân tích kết quả bằng điện di mao quản [16] [17]. 1.2.2. Phƣơng pháp thực hiện Trong xét nghiệm quan hệ huyết thống hiện nay, phản ứng PCR STR được thiết kế là một phản ứng multiplex PCR khuếch đại cùng lúc 16- 24 vị trí STR. 16-24 cặp primer tham gia phản ứng được gắn nhóm màu huỳnh quang khác nhau.  Sau quá trình PCR, ta có hỗn hợp đoạn DNA khuếch đại các vị trí STR có màu huỳnh quang của primer tương ứng.  Tiến hành điện di mao quản sản phẩm PCR cùng với allelic ladder. Allelic ladder chứa tất cả các trường hợp lặp lại của các vị trí STR ở các màu huỳnh quang. Các vị trí có primer khuếch đại gắn cùng một màu huỳnh quang sẽ 7 được phân tích cùng nhau cùng với ladder. Số lần lặp lại của trình tự STR được xác định dựa trên allelic ladder được điện di cùng (hình 1.2).  Cả mẫu và ladder trước khi điện di sẽ được trộn với một lane standard mang một màu huỳnh quang riêng biệt. Phần mềm đọc kết quả dựa trên màu huỳnh quang này để loại ra các tín hiệu nhiễu, so sánh sản phẩm PCR với allelic ladder cho biết số lần lặp lại của vị trí STR (hình 1.1)[18].  PowerPlex ®Fusion System là bộ mix PCR STR khuếch đại 24 vị trí STR bằng 4 nhóm primer có gắn màu huỳnh quang lần lượt là: Fluorescein, JOE, TMR-ET và CXR-ET và màu huỳnh quang thứ năm của WEN Internal Lane Standard 500 (bảng 1.1).  Ưu điểm: Là kỹ thuật PCR tiên tiến phát triển từ multiplex PCR kết với tín hiệu huỳnh quang trên trình tự primer khuếch đại và phân biệt được một lượng lớn các sản phẩm PCR đích khác nhau.  Nhược điểm: Kết quả đọc dựa trên cường độ màu huỳnh quang RFU (relative fluorescence units) và kích thước sản phẩm đòi hỏi cao ở chất lượng phản ứng PCR. Trang thiết bị cho phản ứng PCR đắt tiền, khó sử dụng rộng rãi. Hình 1.1: Kết quả hiển thị Liz scan -WEN Internal Lane Standard 500 [4] 8