Tài liệu Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư

viÖn ho¸ häc viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt ®Ò tµi: "nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung 6500 10/9/2007 Hµ Néi, 4 - 2006 B¶n quyÒn 2006 thuéc VHH - VAST §¬n xin sao chÐp toµn bé hoÆc tõng phÇn tµi liÖu nµy ph¶i göi ®Õn ViÖn tr−ëng VHH - VAST trõ tr−êng hîp sö dông cho môc ®Ých nghiªn cøu. viÖn ho¸ häc viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt ®Ò tµi: "nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung Hµ Néi, 4 - 2006 B¶n th¶o viÕt xong 1/ 2006. Tµi liÖu nµy ®−îc chuÈn bÞ trªn c¬ së kÕt qu¶ thùc hiÖn §Ò tµi cÊp Nhµ n−íc, m· sè KC 10. 25 Danh s¸ch c¸n bé tham giathùc hiÖn ®Ò tµi Hä vµ tªn C¬ quan c«ng t¸c Chñ nhiÖm ®Ò tµi 1. GS.TSKH. TrÇn V¨n Sung ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN C¸n bé tham gia nghiªn cøu 1. PGS. TS. NguyÔn H÷u §Þnh Khoa Ho¸ Tr−êng §HKHTN, §HQG Hµ Néi 2. ThS. NguyÔn ViÖt Th¾ng 3. ThS. TrÇn V¨n Léc 4. ThS. TrÇn V¨n ChiÕn nt 5. ThS. TrÇn §øc Qu©n nt 6. CN. Ph¹m ThÞ Ninh nt 7. TS. TrÞnh ThÞ Thuû nt 8. TS. NguyÔn ThÞ Hoµng Anh nt 9. TS. NguyÔn Thanh §¹m 10. ThS. NguyÔn TuyÕt Mai 11. DS. Lª TiÕn Dòng 12. TS. Phïng ThÞ Vinh nt ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN BÖnh ViÖn K Hµ Néi nt XN D−îc phÈm TW I ViÖn KiÓm nghiÖm Môc lôc Tr 1. 2. Bµi tãm t¾t 1 PhÇn chÝnh b¸o c¸o 3 2.1. PhÇn tæng quan 3 2.1.1. Cyclophosphamide 3 2.1.1.1. C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide 3 2.1.1.2. Tæng hîp cyclophosphamide Tiªu chuÈn cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ trong c¸c D−îc ®iÓn T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt Nam C¸c d¹ng s¶n phÈm chÝnh cña cyclophosphamide vµ nhu cÇu vÒ thuèc cyclophosphamide 5 11 2.1.2. TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña §Ò tµi 14 2.2. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cña §Ò tµi 19 2.2.1. Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide 19 Quy tr×nh tinh chÕ s¶n phÈm cyclophosphamide 28 Nghiªn cøu kh¼ng ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña s¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ®−îc KiÓm nghiÖm s¶n phÈm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh, BP 2001 Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña s¶n phÈm cyclophosphamide 29 2.2.5. Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm 36 2.2.6. Nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng thuèc cyclophosphamide pha tiªm 39 2.2.6.1. §Ò c−¬ng nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng 39 2.2.6.2. KÕt qu¶ nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng 42 2.2.7. Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide 48 2.2.7.1. Nghiªn cøu ®é bÒn cña nguyªn liÖu cyclophosphamide Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide ë trong dung dÞch n−íc 48 C¸c kÕt qu¶ kh¸c 50 2.1.1.3. 2.1.1.4. 2.1.1.5. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. 2.2.7.2. 2.2.8. 9 13 32 33 49 3. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ 51 B¸o c¸o quyÕt to¸n tµi chÝnh Lêi c¶m ¬n Tµi liÖu tham kh¶o 55 1. Bµi tãm t¾t 1.1. §Æt vÊn ®Ò HiÖn nay ViÖt Nam vÉn ph¶i nhËp khÈu mét l−îng lín thuèc cyclophosphamide ®Ó ®iÒu trÞ ung th− vµ mét sè bÖnh kh¸c cã nguyªn nh©n tù miÔn. Theo dù tÝnh, hµng n¨m sè tiÒn ®Ó nhËp khÈu cyclophosphamide riªng cho nhu cÇu ch÷a bÖnh ung th− lµ kho¶ng 26 tØ ®ång. §Ò tµi "Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" cã m· sè KC 10.25 ®Æt ra c¸c môc ®Ých sau ®©y: • Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide cã tÝnh kh¶ thi, vµ tÝnh kinh tÕ cao. • Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña cyclophosphamide; KiÓm nghiÖm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh BP 2001. • Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm trªn d©y chuyÒn GMP. Thuèc bµo chÕ xong ph¶i ®¹t tiªu chuÈn thuèc tiªm cña D−îc ®iÓn Anh BP 2001. • Nghiªn cøu ®¸nh gi¸ l©m sµng giai ®o¹n I thuèc cyclophosphamide tæng hîp ®−îc trªn bÖnh nh©n ung th−. 1.2. Nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: 1.2.1. Nguyªn liÖu: C¸c ho¸ chÊt ®−îc sö dông cã ®é tinh khiÕt P. A. cña h·ng Merck, CHLB §øc. 1.2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: • C¸c ph−¬ng ph¸p dïng ®Ó ph©n tÝch cÊu tróc cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc lµ hiÖn ®¹i vµ phï hîp nh− phæ MS, LC/MS, IR vµ NMR (1H -, 13C NMR) ®−îc thùc hiÖn t¹i ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam. • C¸c ph−¬ng ph¸p tæng hîp ®−îc dùa theo patent cña §øc, Liªn minh Ch©u ¢u, Mü cã kÕt hîp víi c¸c tµi liÖu tham kh¶o kh¸c, ®−îc thùc hiÖn t¹i tr−êng §HKHTN - §HQG Hµ Néi vµ ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN. 1 • C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu vÒ y d−îc ®−îc sö dông lµ nh÷ng ph−¬ng ph¸p quy chuÈn cña Bé Y tÕ, ®−îc thùc hiÖn t¹i c¸c c¬ quan khoa häc do Bé Y tÕ chØ ®Þnh nh− ViÖn KiÓm nghiÖm, xÝ nghiÖp D−îc phÈm TW I vµ bÖnh viÖn K Hµ Néi. 1.3. C¸c kÕt qu¶ ®· ®¹t ®−îc: • §· tiÕn hµnh nghiªn cøu vµ ®Ò ra ®−îc quy tr×nh kh¶ thi cã hiÖu qu¶ kinh tÕ vµ øng dông quy tr×nh nµy ®Ó tæng hîp 4250 gam cyclophosphamide. • §· ®−a ra ®−îc bé phæ chuÈn cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc gåm: IR, MS, LC/ MS, 1H -, 13C - NMR. • S¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ra ®· ®−îc nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ ®éc tÝnh b¸n cÊp, ®−îc ph©n tÝch, kiÓm nghiÖm theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh BP 2001. TÊt c¶ c¸c tiªu chÝ ®Òu ®¹t. • Cyclophosphamide ®· ®−îc bµo chÕ thµnh thuèc bét pha tiªm trªn d©y chuyÒn GMP cña xÝ nghiÖp D−îc phÈm TW I. Thuèc vµ n−íc cÊt pha tiªm ®¹t tiªu chuÈn BP 2001. • Thuèc cyclophosphamide ®· ®−îc nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n I ®èi víi bÖnh nh©n ung th− t×nh nguyÖn t¹i bÖnh viÖn K Hµ Néi. KÕt qu¶: Víi liÒu 750 mg/ m2 da c¬ thÓ c¸c bÖnh nh©n ®Òu cã ®¸p øng mét phÇn. LiÒu 750 mg/ m2 da c¬ thÓ lµ liÒu sö dông an toµn. 1.4. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ • §Ò tµi ®· hoµn thµnh tèt c¸c môc tiªu ®· ®Ò ra vµ theo ®óng tiÕn ®é. • Thanh quyÕt to¸n tµi chÝnh theo ®óng dù to¸n vµ quy ®Þnh cña nhµ n−íc. • §Ò nghÞ Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ xem xÐt phª duyÖt giai ®o¹n tiÕp theo cña §Ò tµi ®Ó nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n II vµ III nh»m ®¸nh gi¸ hiÖu qu¶ chèng ung th− cña thuèc vµ ®−a ra s¶n xuÊt, ®¸p øng nhu cÇu trong n−íc, thay thÕ thuèc nhËp khÈu. 2 PhÇn chÝnh b¸o c¸o 2. 2.1. PhÇn tæng quan 2.1.1. Cyclophosphamide Cyclophosphamide cã tªn khoa häc lµ (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino] tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoÆc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,Otrimethylendiamidophosphat (I); c«ng thøc tæng lµ C7H15Cl2N2O2P. H2O, khèi l−îng ph©n tö lµ 279,1. C«ng thøc cÊu t¹o lµ: Cl O H2C N Cl H2C P O HN . H2O I Tinh thÓ cyclophosphamide cã mµu tr¾ng hoÆc gÇn tr¾ng, tan trong n−íc, rÊt dÔ tan trong cån, tan võa ph¶i trong ete. 2.1.1.1. C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide Cyclophosphamide ®−îc sö dông nhiÒu trong l©m sµng víi mét phæ t¸c dông réng vµ hiÖu qu¶ ®èi víi c¸c bÖnh ung th− ë ng−êi. Ngoµi lý do vÒ t¸c dông ®iÒu trÞ, cyclophosphamide cßn cã c¬ chÕ t¸c dông rÊt ®éc ®¸o vµ tÝnh chän läc trong ®iÒu trÞ. HiÖn nay cyclophosphamide lµ lo¹i thuèc chèng ung th− ®−îc sö dông nhiÒu nhÊt trong ®iÒu trÞ ho¸ chÊt liÒu cao víi tæng liÒu l−îng dïng lµ 500 -700mg/m2 da ng−êi trong 1 ®Õn 4 ngµy. Lµ mét lo¹i ho¹t chÊt dÔ mÊt nit¬, cyclophosphamide ®ãng vai trß ankyl ho¸ ADN lµm cho ADN kh«ng th¸o rêi ®−îc, do vËy kh«ng t¹o thµnh ARN do ®ã dÉn tíi viÖc t¸i s¶n xuÊt tÕ bµo bÞ k×m h·m, tr−íc hÕt lµ ®èi víi 3 c¸c hÖ tÕ bµo ph¸t triÓn nhanh nh− c¸c tuyÕn tiÕt, da, tuû x−¬ng vµ ®Æc biÖt lµ c¸c u ¸c tÝnh [1,2]. C¸c hîp chÊt cã tÝnh ankyl ho¸ sÏ tÊn c«ng vµo qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña a xÝt nucleic vµ k×m h·m sù ph¸t triÓn hoÆc tiªu diÖt nh÷ng tÕ bµo bÞ bÖnh. Tuy nhiªn, chóng còng tÊn c«ng c¶ tÕ bµo lµnh vµ ë liÒu hiÖu dông chóng còng cã ®éc tÝnh ®¸ng kÓ. Theo t¸c gi¶ Charlotte le Roux vµ céng sù th× c¬ chÕ alkyl ho¸ cña cyclophosphamide ®−îc lý gi¶i nh− sau [6]: O HO O P O P CH 2 Cl H 2N NH N CH2 CH2 Cl N -H + +H + O O P H 2N CH2 CH2 Cl N CH2 CH2 Cl CH 2 Cl CH2 CH2 Cl (A) Cyclophosphamide (I) - Cl O O P H 2N O CH2 CH2 Nu N CH2 CH2 Nu + Nu - O O - Cl - P H 2N (B) H 2N N CH 2 CH2 Nu O P CH2 CH2 Nu N CH2 CH2 Cl + Nu - O - O P H 2N N CH2 CH 2 Cl Trong c¬ thÓ cyclophosphamide gi¶i phãng ra chÊt phosphoramidat (A) mét t¸c nh©n alkyl ho¸ cã ho¹t tÝnh sinh häc. Ho¹t tÝnh sinh häc cña chÊt (A) ®−îc gi¶i thÝch qua d·y ph¶n øng bao gåm: ®ãng vßng néi ph©n tö; më vßng nucleophil. Qu¸ tr×nh nµy lÆp l¹i hai lÇn dÉn ®Õn s¶n phÈm cuèi cïng ®−îc alkyl ho¸ hai lÇn (B). Tuy nhiªn, c¬ chÕ chÝnh x¸c cña qu¸ tr×nh alkyl ho¸ cña chÊt (A) vÉn lµ vÊn ®Ò cßn Ýt ®−îc biÕt. C¸c b−íc theo tr×nh tù trªn bao gåm c¸c chÊt azinidin trung gian ®· ®−îc minh chøng b»ng c¸c thÝ nghiÖm ®¬tªr« ho¸. Nh−ng liÖu chÊt (A) sÏ tham gia ph¶n øng alkyl ho¸ nguyªn vÑn hay liªn kÕt P-N sÏ bÞ c¾t tr−íc khi alkyl ho¸ th× hiÖn vÉn cßn tranh c·i [6]. Theo nguyªn lý vÒ ''d¹ng vËn chuyÓn" (transport) vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh '' (active form) cña mét biÖt d−îc ®èi víi c¸c chÊt cã t¸c dông ankyl ho¸ th× mét ho¹t chÊt cÇn ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ ë ''d¹ng vËn chuyÓn'' tøc lµ ë d¹ng ch−a cã ho¹t tÝnh. D¹ng nµy sÏ chuyÓn thµnh ''d¹ng ho¹t tÝnh'' trong c¬ thÓ vµ nÕu cã thÓ th× ngay t¹i vÞ trÝ 4 cÇn ®iÒu trÞ cã nghÜa lµ lµm t¨ng ®é chän läc cña thuèc. VÝ dô: §èi víi c¸c chÊt dÔ bÞ lo¹i nit¬ th× hîp chÊt chøa nhãm oxit nit¬ (N→O) lµ mét '' d¹ng vËn chuyÓn'' thùc thô. Nguyªn lý nµy ®· ®−îc ¸p dông víi lo¹i thuèc ch÷a ung th− tiÒn liÖt tuyÕn lµ stilbeoestroldiphosphate. Nh− ®· biÕt th× trong c¬ thÓ ng−êi bÖnh, t¹i bé phËn bÞ ung th− cã tån t¹i mét enzym d¹ng phosphamidasa vµ phosphatasa cã thÓ thuû ph©n ®−îc liªn kÕt phosphamide vµ este cña axit phosphoric. Víi ý t−ëng lµ: ®é chän läc cña thuèc sÏ t¨ng ®¸ng kÓ, nÕu ''d¹ng ho¹t tÝnh'' ®−îc t¹o thµnh trùc tiÕp t¹i vÞ trÝ cÇn ®iÒu trÞ, ng−êi ta ®· tæng hîp ra chÊt phosphamide este II ®Ó nghiªn cøu ®éng d−îc häc cña cyclophosphamide. Cl H2C NH N Cl H2C P R1 O O R2 II 2.1.1.2. Tæng hîp cyclophosphamide Cyclophosphamide ®· ®−îc Arnold, Bourseaux vµ Hirsch [3,4] t×m ra lÇn ®Çu tiªn n¨m 1956 trong phßng nghiªn cøu cña nhµ m¸y Asta víi ký hiÖu lµ B518. ViÖc tæng hîp ra chÊt nµy lµ kÕt qu¶ cña sù mong muèn ¸p dông nguyªn lý ''d¹ng vËn chuyÓn" vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh ''. Cyclophosphamide ®−îc sö dông trong ®iÒu trÞ ung th− tõ n¨m 1958 hoÆc 1970 [1]. Ngoµi ra, cyclophosphamide cßn ®−îc sö dông nh− mét chÊt øc chÕ miÔn dÞch ®Ó ®iÒu trÞ c¸c bÖnh tù miÔn nh− nh−îc c¬, thÊp khíp, lupót ban ®á vµ ®Æc biÖt ®Ó chèng th¶i ghÐp trong c¸c ca ghÐp t¹ng [19, 24, 25]. Arnold, Bourseaux vµ Brock [7] ®· nghiªn cøu mèi quan hÖ gi÷a cÊu tróc vµ ho¹t tÝnh kh¸ng ung th− cña hîp chÊt nµy. KÕt qu¶ thu ®−îc ë chÊt cyclophosphamide lµ rÊt kh¶ quan vÒ mÆt d−îc lý vµ l©m sµng [4]. C¬ chÕ biÕn ®æi cña cyclophosphamide trong c¬ thÓ ®· ®−îc C.L. Roux vµ céng sù tiÕp tôc nghiªn cøu [6]. 5 Mét dÉn xuÊt kh¸c cña cyclophosphamide cã nhãm thÕ ë m¹ch vßng còng ®· ®−îc tæng hîp ®Ó nghiªn cøu ho¹t tÝnh chèng ung th− [7, 8, 25]. Cyclophosphamide cßn ®−îc sö dông lµm ®éc tè cho s¬n chèng hµ dïng cho c¸c tµu biÓn [9]. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, tÝnh chÊt d−îc lý cña cyclophosphamide vÉn cßn ®−îc tiÕp tôc nghiªn cøu [10,11,12]. KÓ tõ khi t×m ra cyclophosphamide vµo n¨m 1956 vµ b¶n quyÒn s¸ng chÕ (patent) ®Çu tiªn ®−îc chÊp nhËn vµo n¨m 1957 [26] cho ®Õn nay vÉn lu«n cã c¸c b¶n quyÒn s¸ng chÕ míi vÒ tæng hîp cyclophosphamide ®−îc ®¨ng ký. B¶n quyÒn s¸ng chÕ gÇn ®©y nhÊt mµ chóng t«i cã ®−îc lµ cña Ulf Niemeyer vµ céng sù vµo cuèi n¨m 2001 [28]. Nh×n chung c¸c patent vÒ tæng hîp cyclophosphamide ®Òu dùa theo s¬ ®å nh− sau: HN Y O R4 + N R2 1 O OH R1 Y + POCl3 Triethylamin P dung m«i N R3 2 R1 N R2 R3 3 víi R1 vµ R2 lµ chloroethyl, R3 vµ R4 lµ H. Ng−êi ta th−êng ¸p dông gi¶i ph¸p kü thuËt tiªn tiÕn ®−îc gäi lµ "ph¶n øng hai b−íc trong cïng mét nåi ph¶n øng" (twostage one-pot reaction). Lîi thÕ cña gi¶i ph¸p kü thuËt nµy lµ: − HiÖu suÊt tæng cña ph¶n øng cao − Kh«ng ph¶i t¸ch s¶n phÈm trung gian − Chi phÝ cho thiÕt bÞ ph¶n øng thÊp − Gi¶m thêi gian s¶n xuÊt − Tiªu thô Ýt nguyªn liÖu ®Çu − Kh«ng ph¶i ch¹y s¾c ký hoÆc c¸c b−íc tinh chÕ kh¸c − Gi¶m l−îng chÊt th¶i g©y ®éc h¹i tíi m«i tr−êng §Ó thùc hiÖn kü thuËt nµy, ng−êi ta cho phosphoryl halogenid vµ hai chÊt amin lµ bis 2- chloroethyl amin vµ n- propylamin- 3- ol t¸c dông víi nhau trong mét dung m«i h÷u c¬ tr¬ víi mét chÊt kiÒm hç trî, tr¸nh sù cã mÆt cña n−íc vµ alcol, 6 kh«ng cÇn t¸ch c¸c s¶n phÈm trung gian. C¸c t¸c nh©n ®−îc cho lÇn l−ît vµo b×nh ph¶n øng. §iÒu ®Æc biÖt quan träng ë ®©y lµ h¹n chÕ tèi ®a ¶nh h−ëng cña n−íc hoÆc h¬i Èm ®èi víi c¸c t¸c nh©n, ®Æc biÖt lµ POCl3. NÕu cã mÆt n−íc trong m«i tr−êng ph¶n øng th× sÏ cã nhiÒu s¶n phÈm phô vµ hiÖu suÊt thu ®−îc cyclophosphamide bÞ gi¶m nhanh chãng. Vµ nh− vËy s¶n phÈm chØ kÕt tinh ®−îc sau khi ph¶i cã thªm b−íc tinh chÕ vÝ dô ch¹y s¾c ký cét. Nh÷ng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide tr−íc n¨m 2001 ch−a ®¸nh gi¸ ®−îc hÕt møc ®é ¶nh h−ëng cña n−íc ®èi víi ph¶n øng nµy. Ngoµi n−íc ra, th× c¸c alcol còng kh«ng ®−îc cã mÆt trong m«i tr−êng ph¶n øng. Ng−êi ta ®· chøng minh ®−îc r»ng: sù cã mÆt l−îng vÕt methanol hoÆc ethanol trong dung m«i sÏ t¹o ra nhiÒu ph¶n øng phô vµ lµm gi¶m hiÖu suÊt. Ph¶n øng ®−îc thùc hiÖn trong mét dung m«i hoÆc mét hçn hîp dung m«i h÷u c¬ tr¬. Cã thÓ sö dông c¸c dung m«i nh−: dichlorometan, 1,2- dichloroetan, chloroform, dioxan, acetonitril, tetrahydrofuran vµ toluen. Nång ®é cña hçn hîp ph¶n øng, tøc lµ tû lÖ gi÷a c¸c chÊt 1, 2, 3, víi thÓ tÝch dung m«i cã thÓ dao ®éng tõ 0,1 ®Õn 6 mol/ lit. C¸c amin 1 vµ 2 ®−îc sö dông theo tû lÖ mol t−¬ng ®−¬ng nhau. NÕu amin 2 Ýt h¬n amin 1 5% hoÆc nhiÒu h¬n 20% còng kh«ng cã vÊn ®Ò g×. ChÊt kiÒm hç trî (®Ó kÐo axit ra khái hçn hîp ph¶n øng) cã thÓ lµ triethylamin, pyridin, hoÆc natri cacbonat. Nh×n chung, tû lÖ mol gi÷a c¸c amin víi chÊt kiÒm lµ t−¬ng ®−¬ng nhau. VÝ dô: NÕu amin 2 (n- propylamin- 3- ol) tham gia ph¶n øng ë d¹ng muèi th× cÇn hai ®−¬ng l−îng chÊt kiÒm hç trî, cßn nÕu nã ë d¹ng kiÒm tù do th× chØ cÇn mét ®−¬ng l−îng chÊt kiÒm hç trî lµ ®ñ. Ph¶n øng ng−ng tô cña POCl3 víi amin lµ ph¶n øng to¶ nhiÖt. §Ó kiÓm so¸t ®−îc nhiÖt ®é ph¶n øng ta ph¶i cho c¸c t¸c nh©n vµo tõ tõ vµ ph¶i lµm l¹nh hçn hîp 7 ph¶n øng. Cã nhiÒu c¸ch kh¸c nhau khi cho c¸c t¸c nh©n vµo b×nh ph¶n øng ®−îc m« t¶ trong c¸c b¶n quyÒn s¸ng chÕ. VÝ dô: Cã thÓ nhá giät tõ tõ POCl3 vµo mét amin ë d¹ng kiÒm tù do; hoÆc chÊt kiÒm hç trî nh− triethylamin ®−îc cho tõ tõ vµo hçn hîp gåm POCl3 vµ mét amin ë d¹ng muèi. ë giai ®o¹n ®Çu cña ph¶n øng nhiÖt ®é nh×n chung ®−îc gi÷ trong kho¶ng tõ - 40 oC ®Õn 20 oC, trong nhiÒu tr−êng hîp ng−êi ta gi÷ ph¶n øng ë nhiÖt ®é gi÷a - 20 oC ®Õn ± 10 oC. NhiÖt ®é cã thÓ t¨ng tíi 100 oC sau khi ®· ph¶n øng ®−îc mét nöa, hoÆc t¨ng ®Õn nhiÖt ®é s«i cña dung m«i nÕu cÇn thiÕt b»ng c¸ch ®un nãng. Trong mét tr−êng hîp kh¸c ng−êi ta còng cã thÓ tiÕn hµnh nh− sau: • B−íc mét: Cho chÊt bis- 2- chloroethylamin vµo b×nh, sau ®ã cho tõ tõ n- propylamin- 3- ol cïng víi chÊt kiÒm hç trî (vÝ dô: triethylamin) vµo b×nh. ChÊt n- propylamin- 3- ol cã thÓ ®−a vµo b×nh ph¶n øng ë d¹ng muèi vµ trong dung m«i; chÊt bis- 2- chloroethylamin vµ kiÒm hç trî sÏ lÇn l−ît ®−îc ®−a tõ tõ vµo b×nh, hoÆc còng cã thÓ ®−îc cho ch¶y cïng mét lóc vµo b×nh tõ hai ng¶ sao cho chÊt kiÒm hç trî lu«n lu«n d− so víi bis- 2- chloroethylamin. • B−íc hai: POCl3 cã thÓ ®−îc cho tõ tõ cïng víi chÊt kiÒm hç trî vµo hçn hîp ph¶n øng cña b−íc mét, hoÆc ng−îc l¹i, hçn hîp cña b−íc mét ®−îc cho tõ tõ vµo dung dÞch POCl3 vµ chÊt kiÒm hç trî. Nh»m gi¶m thiÓu tèi ®a l−îng n−íc trong hçn hîp ph¶n øng th× tÊt c¶ c¸c ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ ph¶n øng ®Òu ph¶i kh« tuyÖt ®èi. VÝ dô: ph¶i sÊy nãng thiÕt bÞ ph¶n øng ®Ó lo¹i h¬i n−íc, lµm khan dung m«i vµ c¸c t¸c nh©n tr−íc lóc ph¶n øng. POCl3 ph¶i cÊt l¹i trong ®iÒu kiÖn kh« tr−íc khi dïng. Hµm l−îng n−íc tr−íc lóc ph¶n øng kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 0,5%, tèt h¬n c¶ lµ trong kho¶ng tõ 0,001% ®Õn 0,1%. C¸c s¶n phÈm phô sÏ ®−îc h¹n chÕ nÕu hçn hîp ph¶n øng ®−îc xö lý víi c¸c chÊt phô gia tr−íc khi ph¶n øng. C¸c chÊt phô gia nµy cã thÓ lµ: R©y ph©n tö; oxit nh«m ë c¸c d¹ng kh¸c nhau, chlorua canxi (d¹ng khan hoÆc ngËm n−íc), P2O5 vµ 8 MgCl2. L−îng chÊt phô gia nh×n chung dao ®éng trong kho¶ng 5 ®Õn 150 gam/ mol chÊt bis- 2- chlor ethylamin. Hçn hîp ph¶n øng cã thÓ ë d¹ng dung dÞch hoÆc huyÒn phï vµ th−êng ®−îc khuÊy tõ 1 cho ®Õn 3 giê tr−íc lóc ph¶n øng ng−ng tô ®−îc 2 b¾t ®Çu b»ng viÖc cho thªm chÊt kiÒm hç trî hoÆc POCl3 vµo b×nh. Sau khi ph©n tö chlor thø nhÊt hoÆc thø hai cña POCl3 ®· ph¶n øng, ng−êi ta cã thÓ läc t¸ch muèi t¹o thµnh hoÆc röa hçn hîp ph¶n øng, sau ®ã cho ph¶n øng tiÕp tôc b»ng c¸ch bæ sung thªm amin vµ chÊt kiÒm hç trî. Xö lý hçn hîp ph¶n øng sau khi ph¶n øng kÕt thóc ®−îc b¾t ®Çu b»ng viÖc läc t¸ch muèi, hoÆc/ vµ röa víi n−íc ë c¸c ®é pH kh¸c nhau. CÇn chó ý tr¸nh sù thuû ph©n hoÆc tan vµo n−íc cña s¶n phÈm b»ng c¸ch cho thêi gian tiÕp xóc víi pha n−íc ng¾n vµ lµm l¹nh hçn hîp. Cã thÓ xö lý hçn hîp ph¶n øng theo ph−¬ng ph¸p khan, nghÜa lµ trung hoµ hçn hîp ph¶n øng b»ng khÝ HCl cho tíi pH = 4 - 6. Ngoµi ra, sö dông c¸c axit yÕu nh− axit acetic, axit oxalic còng ®em l¹i kÕt qu¶. 2.1.1.3. • Tiªu chuÈn cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ trong c¸c D−îc ®iÓn Trong D−îc ®iÓn ViÖt Nam, lÇn xuÊt b¶n thø 3, Nhµ xuÊt b¶n Y häc, n¨m 2002 chóng t«i kh«ng thÊy cã cyclophosphamide. • Trong D−îc ®iÓn Anh BP 2001 trang 510, nh÷ng tiªu chuÈn chÝnh cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ nh− sau: − Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 98,0% vµ kh«ng qu¸ ®−¬ng l−îng cña 102,0% (RS)- 2- [bis (2- chloroethyl) amino] tetrahydro- 2H- 1, 3, 2- oxaphosphorin- 2- oxit tÝnh theo chÊt khan. − Lµ bét tinh thÓ mµu tr¾ng hoÆc gÇn tr¾ng, tan trong n−íc, tan hoµn toµn trong cån, tan Ýt trong ete. − §iÓm nãng ch¶y 51 oC. Chªnh lÖch ®iÓm nãng ch¶y kh«ng ®−îc qu¸ 2 o C. 9 − pH: Dung dÞch cña 0,50 gam cyclophosphamide trong 25 ml n−íc ®· khö CO2 sÏ cã pH tõ 4,0 ®Õn 6,0, ®o ngay sau khi pha. − Cl- (chlorid): Hoµ tan 0,15 gam cyclophosphamide trong 15 ml n−íc ®· khö CO2. Hµm l−îng ion Cl- cña dung dÞch võa pha chÕ kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 330 ppm. − PO43- (phosphat): Hoµ tan 0,10 gam cyclophosphamide trong 100 ml n−íc ®· khö CO2. Hµm l−îng ion phosphat cña dung dÞch kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 100 ppm. − Kim lo¹i nÆng: Kh«ng ®−îc qu¸ 20 ppm tÝnh theo ch×. − N−íc: Tõ 6,0 ®Õn 7,0% x¸c ®Þnh víi l−îng 0,300 gam cyclophosphamide theo ph−¬ng ph¸p b¸n vi l−îng. • D−îc ®iÓn ch©u ¢u (EP 1997) trang 697: còng ®−a ra c¸c ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh vµ c¸c tiªu chuÈn cña cyclophosphamide t−¬ng tù nh− D−îc ®iÓn Anh BP 2001. • D−îc ®iÓn Mü (USP 25) trang 491 n¨m 2002: − Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 97,0% vµ kh«ng nhiÒu qu¸ 103,0% tÝnh theo s¶n phÈm khan. − L−u ý: RÊt thËn träng khi lµm viÖc víi cyclophosphamide v× ®ã lµ chÊt g©y ®éc tÕ bµo m¹nh. − §ãng gãi vµ b¶o qu¶n: B¶o qu¶n trong thïng kÝn, ë nhiÖt ®é trong kho¶ng tõ 2 oC ®Õn 30 oC. − pH: n»m gi÷a 3,9 vµ 7,1 trong mét dung dÞch (1 trong 100), ®o 30' sau khi pha. − N−íc: Tõ 5,7 ®Õn 6,8%. 10 − Kim lo¹i nÆng: Hoµ tan 1,0 gam cyclophosphamide trong 25 ml n−íc, nÕu cÇn thiÕt th× läc l¹i dung dÞch. Hµm l−îng kim lo¹i nÆng kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 0,002%. • D−îc ®iÓn NhËt B¶n JP XIII trang 314: − Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 97,0% − Tinh thÓ tr¾ng hoÆc bét tinh thÓ. − Tan rÊt tèt trong axit acetic b¨ng, tan hoµn toµn trong cån, trong anhydrit acetic vµ trong CHCl3, tan trong n−íc vµ ete. − §iÓm nãng ch¶y 45 oC - 53 oC. − Mµu s¾c dung dÞch: Hoµ tan 0,20 gam cyclophosphamide trong 10 ml n−íc, dung dÞch ph¶i trong suèt vµ kh«ng mµu. − Cl-: KiÓm tra víi dung dÞch cña 0,40 gam cyclophosphamide ë nhiÖt ®é kh«ng qu¸ 20 oC. Dung dÞch chuÈn lµ: 0,40 ml 0,01 mol/ lit axit HCl. Hµm l−îng ion Cl- kh«ng qu¸ 0,036%. − Kim lo¹i nÆng: KiÓm tra víi 1,0 gam cyclophosphamide. Dung dÞch so s¸nh ®−îc pha víi 2,0 ml dung dÞch ch× tiªu chuÈn. Hµm l−îng kim lo¹i nÆng kh«ng qu¸ 20 ppm. − N−íc: Tõ 5,7 ®Õn 7,0% (0,5 gam, chuÈn ®é trùc tiÕp). − §ãng thïng vµ b¶o qu¶n: Thïng kÝn, b¶o qu¶n ë d−íi 30 oC. 2.1.1.4. T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt Nam Khoa Ho¸ häc tr−êng §¹i häc Tæng hîp Hµ Néi ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu c¸c ph−¬ng ph¸p ®iÒu chÕ vµ c¬ chÕ t¸c dông cña c¸c hîp chÊt c¬ phèt pho nh»m phôc vô n«ng nghiÖp vµ y tÕ [13-15]. Cyclophosphamide ®· qua b−íc nghiªn cøu c¬ b¶n trong ®Ò tµi ''Tæng hîp mét sè hîp chÊt c¬ kim cã ho¹t tÝnh sinh lý m¹nh'' cÊp Bé §¹i häc, Trung häc 11 chuyªn nghiÖp, m· sè 149/Q§ ngµy 01/3/1972, nghiÖm thu ngµy 30/10/1975 vµ ®Ò tµi cÊp nhµ n−íc '' Tæng hîp c¸c chÊt chèng virus'' m· sè 510801, Hµ Néi 2002. HiÖn nay cyclophosphamide ®· vµ ®ang ®−îc sö dông trong ch−¬ng tr×nh ®a hoÆc ®¬n ho¸ trÞ liÖu ®Ó ch÷a c¸c chøng bÖnh sau: • C¸c bÖnh b¹ch cÇu: BÖnh b¹ch cÇu d¹ng lymph« bµo vµ dßng tuû bµo cÊp hay m·n. • U h¹ch ¸c tÝnh: BÖnh Hodgkin, ung th− h¹ch kh«ng Hodgkin, u t−¬ng bµo. • U t¹ng ®Æc ¸c tÝnh cã di c¨n vµ kh«ng di c¨n: Ung th− buång trøng, ung th− cæ tö cung, néi m¹c tö cung, ung th− tinh hoµn, ung th− vó, ung th− phæi tÕ bµo nhá, u nguyªn bµo thÇn kinh, u nguyªn bµo vâng m¹c, sarcoma Ewing. • C¸c bÖnh tù miÔn tiÕn triÓn: Viªm khíp d¹ng thÊp, bÖnh khíp do vÈy nÕn, lupus ban ®á hÖ thèng, s¬ cøng b×, viªm m¹ch m¸u hÖ thèng (kÌm héi chøng thËn h−), mét sè thÓ viªm cÇu thËn (kÌm héi chøng thËn h−), bÖnh nh−îc c¬ nÆng, thiÕu m¸u t¸n huyÕt tù miÔn, bÖnh ng−ng kÕt tè l¹nh. • §iÒu trÞ øc chÕ miÔn dÞch trong ghÐp t¹ng. Cyclophosphamide cã thÓ dïng ®−îc c¶ hai ®−êng uèng hoÆc tiªm. Sau khi uèng, thuèc ®−îc hÊp thô tíi 75% qua ®−êng tiªu ho¸, nã ph©n bè réng r·i ë kh¾p c¸c m« vµ ®i qua hµng rµo m¸u n·o. Cyclophosphamide cßn ®i qua c¶ rau thai vµ s÷a mÑ. Thêi gian b¸n huû cña cyclophosphamide lµ tõ 4 ®Õn 8 giê. Thuèc ®¹t nång ®é ®Ønh trong huyÕt thanh trong vßng 1 giê sau khi uèng. Nã ®−îc th¶i trõ qua n−íc tiÓu ë d¹ng kh«ng biÕn ®æi d−íi 10% vµ d¹ng chuyÓn ho¸ tõ 85- 90%. Cyclophosphamide cã thÓ g©y ra c¸c t¸c dông phô. Tuy nhiªn c¸c t¸c dông ngo¹i ý th−êng phô thuéc vµo liÒu dïng vµ hÇu hÕt c¸c tr−êng hîp bÞ t¸c dông phô ®Òu cã thÓ håi phôc ®−îc. C¸c t¸c dông phô cã thÓ cã cña cyclophosphamide: + VÒ huyÕt häc: Gi¶m b¹ch cÇu kÌm theo nguy c¬ bÞ nhiÔm trïng; gi¶m tiÓu cÇu kÌm t¨ng nguy c¬ xuÊt huyÕt; thiÕu m¸u kÌm gi¶m Hemoglobine (trªn 2g/ 100ml so víi gi¸ trÞ ban ®Çu). 12 + VÒ tiªu ho¸: Buån n«n vµ ãi möa + §−êng niÖu sinh dôc: Viªm bµng quang + §èi víi gan: Ýt gÆp + Rông tãc 2.1.1.5. C¸c d¹ng s¶n phÈm chÝnh cña cyclophosphamide vµ nhu cÇu vÒ thuèc cyclophosphamide • Trªn thÞ tr−êng trong n−íc vµ quèc tÕ hiÖn nay cã c¸c th−¬ng phÈm chÝnh chøa ho¹t chÊt cyclophosphamide nh− sau: − Endoxan d¹ng viªn bao vµ d¹ng bét pha tiªm cña h·ng Asta Medica [17], − Cytoxan d¹ng viªn nÐn vµ bét pha tiªm cña h·ng Bristol - Myers Squibb. − Neosar d¹ng bét pha tiªm cña h·ng Pharmacia & Upjohn. • Theo thèng kª cña Bé Y tÕ, hµng n¨m n−íc ta cã kho¶ng 150.000 ng−êi míi m¾c bÖnh ung th− cÇn ®−îc ®iÒu trÞ [16]. Sè l−îng bÖnh nh©n ngµy cµng t¨ng do tû lÖ sèng kÐo dµi cña nh÷ng bÖnh nh©n ung th− ®· m¾c tõ 3 ®Õn 5 n¨m. Trong sè ®ã kho¶ng 30% cÇn ®−îc ®iÒu trÞ tiÕp ë giai ®o¹n cuèi vµ giai ®o¹n di c¨n. Nh− vËy, trong 1 n¨m cã kho¶ng 50.000 bÖnh nh©n cÇn dïng cyclophosphamide ®¬n ®éc hay phèi hîp víi c¸c lo¹i thuèc kh¸c. Mçi ®ît ®iÒu trÞ cÇn sö dông 500mg/ m2 da; trung b×nh cÇn 6 ®ît ®iÒu trÞ cho mét bÖnh nh©n. DiÖn tÝch bÒ mÆt da trung b×nh cña ng−êi ViÖt Nam lµ 1,6m2. Nh− vËy: + Mét ®ît ®iÒu trÞ cÇn : 500mg/m2 da x 1,6 m2 = 800mg + S¸u ®ît ®iÒu trÞ cÇn: 800mg/m2 da x 6 = 4800mg + Sè thuèc cÇn dïng cho ViÖt Nam trong 1 n¨m sÏ lµ: 4800mg x 50.000 ng−êi = 240.000.000mg (240kg). 13 Gi¸ thuèc hiÖn nay cña §øc lµ: ≈ 45.000®/ 200mg; cña Hµn Quèc lµ: ≈ 22.000®/ 200mg. Nh− vËy nÕu chØ tÝnh theo gi¸ thuèc cña Hµn Quèc th× sè tiÒn ViÖt Nam cÇn ph¶i chi ®Ó mua thuèc ®· lµ: 22.000® x 240.000.000 : 200 = 26.400.000.000® (hai m−¬i s¸u tû bèn tr¨m triÖu ®ång). Sè liÖu trªn cho thÊy, cÇn gÊp rót tæ chøc nghiªn cøu s¶n xuÊt cyclophosphamide trong n−íc ®Ó ®iÒu trÞ ung th− vµ c¸c bÖnh kh¸c. Ngoµi viÖc sö dông ®Ó ®iÒu trÞ ung th− th× cyclophosphamide cßn ®−îc dïng nhiÒu ®Ó ®iÒu trÞ c¸c bÖnh kh¸c nh− chèng th¶i ghÐp (dïng cho c¸c ca ghÐp gan, thËn, da, v.v...), c¸c bÖnh thuéc vÒ øc chÕ miÔn dÞch nh− lupót ban ®á, vÈy nÕn, viªm khíp thÓ nhÑ .... §iÒu ®Æc biÖt quan träng n÷a lµ: cyclophosphamide cã thÓ ®−îc bµo chÕ b»ng c¸ch ®ãng viªn nÐn dïng ®−êng uèng gi¸ rÎ, dÔ b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn ®Ó phôc vô ®ång bµo vïng s©u, vïng xa, ng−êi nghÌo bÞ m¾c bÖnh ung th− vµ mét sè bÖnh kh¸c. 2.1.2. TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña ®Ò tµi • Giíi thiÖu vÒ chñ nhiÖm ®Ò tµi vµ c¬ quan qu¶n lý ®Ò tµi: Tªn ®Ò tµi: "Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" M∙ sè: KC.10. 25 Thêi gian thùc hiÖn: 24 th¸ng (Tõ 1/ 1/ 2004 ®Õn 31/ 12 / 2005) CÊp qu¶n lý: Nhµ n−íc Kinh phÝ: Tæng sè: 2.900 triÖu ®ång Trong ®ã, tõ Ng©n s¸ch SNKH: 1.900 triÖu ®ång Thuéc ch−¬ng tr×nh: Khoa häc vµ C«ng nghÖ träng ®iÓm cÊp nhµ n−íc giai ®o¹n 2001-2005: "Khoa häc vµ C«ng nghÖ phôc vô b¶o vÖ vµ ch¨m sãc søc kháe céng ®ång". Chñ nhiÖm ®Ò tµi: Hä vµ tªn: TrÇn V¨n Sung Häc hµm/häc vÞ: GS. TSKH. Chøc danh khoa häc: Nghiªn cøu viªn cao cÊp (NCVCC) §iÖn tho¹i: (CQ)/ 04-7564794; (NR) 04-8570894; Fax: 04-8361283; Mobile: 0913210527 14 E-mail: [email protected] §Þa chØ c¬ quan: ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH & CNVN 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi §Þa chØ nhµ riªng: Sè nhµ 35, Ngâ 198, phè Th¸i Hµ, Hµ Néi C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi: ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam §iÖn tho¹i: 04-7564312; Fax: 04- 8361283 E-mail: [email protected] §Þa chØ: 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt, QuËn CÇu GiÊy, Hµ Néi Môc tiªu cña ®Ò tµi: X©y dùng ®−îc quy tr×nh c«ng nghÖ tæng hîp vµ tinh chÕ thuèc cyclophosphamide ®¹t tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh (BP- 2001). • Néi dung nghiªn cøu: + Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ cyclophosphamide + KiÓm tra ®é tinh khiÕt cña c¸c ho¸ chÊt, dung m«i sö dông + Tinh chÕ c¸c ho¸ chÊt, dung m«i sö dông + Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ s¶n phÈm trung gian I + Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ s¶n phÈm trung gian II + Nghiªn cøu quy tr×nh ®iÒu chÕ cyclophosphamide trong c¸c ®iÒu kiÖn ph¶n øng kh¸c nhau (dung m«i, t¸c nh©n) + Nghiªn cøu tinh chÕ cyclophosphamide trong c¸c ®iÒu kiÖn kh¸c nhau. + X¸c ®Þnh cÊu tróc vµ kiÓm tra ®é tinh khiÕt cña cyclophosphamide: KiÓm tra ®é tinh khiÕt b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p s¾c ký nh− s¾c ký líp máng, s¾c ký khÝ, s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC), s¾c ký láng g¾n khèi phæ (LC/ MS) vµ ph©n tÝch nguyªn tè. + X¸c ®Þnh cÊu tróc cña cyclophosphamide b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p phæ nh− IR, MS, NMR, so s¸nh víi phæ cña chÊt chuÈn. 15