Tài liệu Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp nhà nước nghiên cứu tạo interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung thư

viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi khoa häc cÊp nhµ n−íc Nghiªn cøu t¹o interleukin-2 t¸i tæ hîp dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th− M∙ sè KC 04.33 Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGs, ts. tr−¬ng nam h¶i 6702 24/12/2007 hµ néi - 2007 Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi ®éc lËp cÊp Nhµ n−íc M∙ sè: KC. 04. 33 Nghiªn cøu t¹o interleukin-2 t¸i tæ hîp dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th− Chñ nhiÖm §Ò tµi: PGS. TS. Tr−¬ng nam h¶i 01 / 2005 – 06 / 2007 BỘ KHOA HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BKHCN V.CNSH BKHCN V.CNSH --------ÂÂÂ--------       VKHCNVN V.CNSH     Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài  NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP DÙNG CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Mã số:   KC. 04. 33  Chủ nhiệm đề tài:   PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI  Cơ quan chủ trì:   Viện Công nghệ sinh học  Cơ quan chủ quản:    Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam  Thời gian thực hiện:     01/2005 ‐ 06/2007    Hà Nội - 2007 Bản báo cáo viết xong ngày 15 / 12/ 2007. Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC. 04. 33. Mọi sao chép phải được sự đồng ý của Viện Công nghệ sinh học. Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Lêi c¶m ¬n Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu thuộc 3 cơ quan nghiên cứu khoa học là (i) Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (ii) Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN, Bộ Giáo dục và Đào tạo và (iii) Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế đã tham gia thực hiện đề tài. Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cám ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên và Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y tế đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và kinh phí cho các tập thể cán bộ chủ trì và tham gia thực hiện đề tài này. Chủ nhiệm và tập thể cán bộ nghiên cứu thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Vụ Quản lý Khoa học và Công nghệ các ngành KT-KT của Bộ Khoa học và Công nghệ và Ban chủ nhiệm chương trình KC. 04 đã tạo điều kiện thuận lợi về kinh phí và quản lý trong suốt thời gian thực hiện đề tài. CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 2 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN ..................................................8 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP......9 BÀI TÓM TẮT ......................................................................................................................11 LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................................15 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ... 17 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI .........................................................17 1.1.1. Ung thư và các liệu pháp chữa trị ung thư.............................................................17 1.1.2 Ung thư thận và u hắc tố.........................................................................................18 1.1.3 Các liệu pháp chữa trị ung thư................................................................................19 1.1.4. Interleukin-2 và ứng dụng trong điều trị ung thư ..................................................19 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC ............................................................23 CHƯƠNG 2. LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........26 2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................................................26 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN ........................................................26 2.2.1 Tạo dòng gen IL-2 ..................................................................................................26 2.2.2 Tạo đột biến điểm của gen IL-2 .............................................................................26 2.2.3. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau ...........................................27 2.2.4. Nghiên cứu và tối ưu điều kiện lên men cho các chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen IL-2 .................................................................................................................27 2.2.5. Tách chiết, tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính chất của IL-2. .......27 2.2.6. Đánh giá chất lượng IL-2 ......................................................................................27 2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................29 2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................................29 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................30 CHƯƠNG 3. NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ Đà THỰC HIỆN ............................47 3.1. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2.............................................................................. 47 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2...............47 3.1.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1-TA ........................................48 3.1.3. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2.............................................................49 3.1.4. Kết luận .................................................................................................................50 3.2. KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2.......................................................................51 3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys125 bằng Ser125 ....51 3.2.2. Gây hồi biến Ser25 thành Leu25 ..............................................................................54 3.2.3. Kết luận .................................................................................................................58 3.3. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU............59 3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào vi khuẩn E. coli..............................59 3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong nấm men P. pastoris.................................63 3.3.3. Biểu hiện gen rhIL2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris ..........................65 3.3.4. Kết luận .................................................................................................................68 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 3 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN 5L, 14L...............................................................................................69 3.4.1. Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp trong bình tam giác .............................69 3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 5, 14L. ...73 3.4.3. Kết luận .................................................................................................................74 3.5. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ..............................................................................................................75 3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực......................................................75 3.5.2. Cắt protein lai bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực và kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 bằng Western blot..............................................76 3.5.3. Kết luận .................................................................................................................77 3.6. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2 ................................................78 3.7. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO NUÔI CẤY CTLL-2 ....79 3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL-2 .................................79 3.7.2. Xác định hoạt tính sinh học của các mẫu rhIL2MN biểu hiện trong E. coli BL21 .......80 3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2 biểu hiện trong P. pastoris ...............82 3.7.4. Kết luận. ................................................................................................................83 3.8. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT...........84 3.8.1. Kết quả nghiên cứu................................................................................................84 3.8.2. Kết luận .................................................................................................................97 3.9. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 ...............................................................98 3.9.1. Hiệu giá của sản phẩm IL-2 ..................................................................................98 3.9.2. Tính vô trùng của sản phẩm IL-2 ..........................................................................98 3.9.3. Tính an toàn của sản phẩm IL-2 ............................................................................98 3.9.4. Chất gây sốt của sản phẩm IL-2 ............................................................................98 3.9.5. Tính chất lý hóa của sản phẩm ..............................................................................99 3.9.6. Kết luận .................................................................................................................99 CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC................. 100 4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC ......................................................................................100 4.2. TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ ..........................102 4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ.........................................................................................104 4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG ............................................................................................104 4.5. ĐÀO TẠO ..................................................................................................................105 4.6. HỢP TÁC QUỐC TẾ .................................................................................................105 4.7. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ ..........................................................................106 4.8. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .......................................................106 4.9. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................................................107 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................110 5.1. KẾT LUẬN ................................................................................................................110 5.2. ĐỀ NGHỊ....................................................................................................................111 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................112 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 4 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 MỤC LỤC CÁC HÌNH Hình 1. Sự phát triển của tế bào ung thư ..................................................................................18 Hình 2. Cấu trúc không gian của Interleukin-2 ........................................................................20 Hình 3. Sự tác động của ProleukinRIL-2 lên tế bào ung thư.....................................................23 Hình 4. Tóm tắt các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ ...............................................................28 Hình 5. Điện di các RNA tổng số tách từ mẫu mô lách người Việt Nam ................................47 Hình 6. Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 .....................................................................................48 Hình 7. Kết quả cắt kiểm tra DNA các plasmid bằng enzyme EcoR I. ...................................48 Hình 8. Kết quả so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI......49 Hình 9. So sánh trình tự amino acid đã được dịch mã của gen IL-2 nhận được.......................50 Protein_IL-2) và trình tự amino acid đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen............................50 quốc tế với số đăng ký NP_000577...........................................................................................50 Hình 10. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...........................................................52 Hình 11. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid các dòng biến nạp bằng Not I và Nco I .............53 Hình 12. Kết quả đọc trình tự nucleotide của dòng số 4 chứa gen rhIL2 .................................54 Hình 13. Cấu trúc của hai plasmid pTZ600 và pTZ900 ...........................................................56 Hình 14. Sơ đồ mô tả quá trình tạo đột biến điểm định hướng tạo gen Trx-rhIL2-MN...........57 Hình 15. Kết quả đọc trình tự gen đã hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái) ..............58 Hình 16. Điện di SDS-PAGE protein Trx-rhIL2MN trên gel polyacrylamide 12,5% .............60 Hình 17. Western blot với kháng thể kháng hIL-2 ...................................................................61 Hình 18. Điện di protein rhIL2 dạng tan và không tan trên gel polyacrylamide 12,5%...........61 Hình 19. Ảnh phổ MS/MS của mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 của Trx được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. .......................................................................62 Hình 20. Ảnh phổ TOF MS và MS/MS của mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích 2+ của IL-2 được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. ..........................................63 Hình 21. Các peptide nhận dạng được qua khối phổ từ băng protein.......................................63 có kích thước 32 kDa.................................................................................................................63 Hình 22. Ảnh biểu hiện gen Trx-rhIL2MN. .............................................................................64 Hình 23. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................64 Hình 24. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...........................................................66 Hình 25. Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris.............67 Hình 26. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................67 Hình 27. Ảnh hưởng của IPTG tới sự biểu hiện của protein rhIL2MN...................................70 Hình 28. Ảnh hưởng của nồng độ Amp tới sự biểu hiện của protein .......................................71 Hình 29. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ................................................................71 Hình 30. Khảo sát thời gian thu mẫu biểu hiện .......................................................................72 Hình 31. Quá trình phát triển của chủng E. coli Bl21 và sinh tổng hợp Interleukin-2. ............73 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 5 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Hình 32. Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2-MN trên polyacryamide gel 12,5%...............73 Hình 33. Điện di protein tinh sạch lần 1 .................................................................................755 Hình 34. Điện di protein tinh sạch lần 2 .................................................................................755 Hình 35. Điện di sản phẩm protein cắt bằng enterokinase trên gel polyacrylamide 12,5% ...766 Hình 36. Mẫu Trx-rhIL2MN giữ ở dạng đông khô sau các khoảng thời gian..........................78 bảo quản khác nhau ...................................................................................................................78 Hình 37. Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro ................................................................79 Hình 38. Xác định và so sánh hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm ....................................81 Hình 39. Đồ thị minh hoạ sự phát triển của tế bào CTLL-2 dưới tác động..............................82 của các IL-2 khác nhau (rhIL2: VN, TQ1: Trung Quốc, US: Mỹ)............................................82 Hình 40. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính lúp) .................85 Hình 41. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................86 Hình 42. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường ....................................................86 Hình 43. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................87 Hình 44. Tiêu bản hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: .................87 Hình 45. Tiêu bản hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư dưới tác động của AOM: ...................................................................................................................88 Hình 46. Tế bào biểu mô niêm mạc bị giải biệt hóa, đang chuyển dạng..................................88 thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc do bắt màu kiềm đậm (PĐ: 100 x 10).........................88 Hình 47. Tế bào mô liên kết ở lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, đang chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc (PĐ: 100 x 10) .......................................89 Hình 48. Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) và mang u báng Sarcoma 180......................90 sau 12 ngày cấy truyền (b).........................................................................................................90 Hình 49. Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180:.............................................91 Hình 50. Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 tái tổ hợp ................92 Hình 51. Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u giữa các lô thí nghiệm .........................................92 Hình 52. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô đối chứng (x1000) ......................................93 Hình 53. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô tiêm chế phẩm IL2.VN ...............................93 Hình 54. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của chế phẩm IL2.TQ .................94 Hình 55. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường dưới kính .......................................94 hiển vi điện tử truyền qua (x10.000). ........................................................................................94 Hình 56. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 VN (x10.000).................95 Tế bào chết theo kiểu hoại thư...................................................................................................95 Hình 57. Tế bào u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 TQ (x10.000) ...........................95 Hình 58. Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm của các lô chuột thí nghiệm............................96 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 6 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 MỤC LỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện......................................................................8 Bảng 2. Kết quả tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô ................................................................77 Bảng 3. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu rhIL-2MN tái tổ hợp .....................................80 Bảng 4. Đơn vị hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm...........................................................81 Bảng 5. Khả năng hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển của mẫu ở nồng độ thử khác nhau.......82 Bảng 6. Đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL-2 thử nghiệm........................................................82 Bảng 7. Số trung bình của u ở ruột 1 chuột trong các lô thí nghiệm ........................................85 Bảng 8. Định lượng các khối u báng Sarcoma 180 khi mổ chuột thí nghiệm ..........................90 Bảng 9. Tác động của chế phẩm IL2-TQ và IL2-VN lên thời gian sống thêm.........................96 của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180.............................................................96 Bảng 10. Các dòng gen và dòng vector tạo ra của đề tài ........................................................102 Bảng 11. Sản phẩm khoa học của đề tài .................................................................................102 Bảng 12. Danh sách các học viên được đào tạo......................................................................105 Bảng 13. Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ.........................................................105 Bảng 14. Danh sách các cơ quan hợp tác quốc tế ...................................................................105 Bảng 15. Kinh phí phân bổ cho các hạng mục........................................................................106 Bảng 16. Tóm tắt các nội dung công việc thực hiện và nội dung xin điều chỉnh ...................108 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 7 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN Số TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Họ và tên Học hàm, học vị PGS. TS. Trương Nam Hải PGS. TS. Phan Văn Chi TS. Phạm Thị Bích Hợp PGS. TS Đỗ Khắc Hiếu TS. Đinh Duy Kháng PGS. TS Trần Công Yên GS. TS. Nguyễn Đình Bảng Trần Bình Duyên GS. TS. Nguyễn Bá Đức Chức vụ, đơn vị Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, Viện CNSH Trách nhiệm trong đề tài Chương mục trong báo cáo Chủ nhiệm đề tài Toàn bộ nội Chủ đề mục dung báo cáo Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Hoá sinh protein, Chủ đề mục Viện CNSH Phó Phòng Công nghệ lên men Viện CNSH Trưởng phòng Tế bào động vật, Viện CNSH Trưởng phòng Vi sinh phân tử, Viện CNSH Trường Đại học khoa học tự nhiên, ĐHQGHN Trung tâm Quốc gia Kiểm định Vaccin và sinh phẩm y học Công ty CP dược TW Mediplantex Bệnh viện K Hà Nội Chủ đề mục Chủ đề mục Chủ đề mục Chủ đề mục Chủ trì đề tài nhánh Chủ trì đề tài Chưa thực nhánh hiện Chủ trì đề tài Chưa thực nhánh hiện Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 8 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP 1. Nội dung: Tạo dòng gen IL-2 Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Phan Văn Chi, NCS Lê Thị Bích Thảo, Th.S Đặng Thành Nam, Th.S Nguyễn Nam Long, CN. Bùi Thị Huyền. 2. Nội dung: Tạo đột biến gen IL-2 Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, CN.Vũ Minh Đức, CN. Đặng Trần Hoàng, CN. Nguyễn Hồng Thanh, NCS. Phùng Thu Nguyệt. 3. Nội dung: Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, PGS. TS Phan Văn Chi, PGS. TS Đinh Duy Kháng, CN. Vũ Minh Đức, CN. Đặng Trần Hoàng, KS. Lê Quỳnh Giang, Th.S Nguyễn Tiến Minh, NCS. Phạm Minh Tuấn. 4. Nội dung: Nghiên cứu điều kiện lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp mang gen IL-2 ở quy mô 5 và 14 lít. Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, TS. Phạm Thị Bích Hợp, Th.S Trần Thị Hường, CN. Vũ Minh Đức, Th.S Nguyễn Văn Hiếu, Th.S Hồ Tuyên, Th.S Lại Thanh Tùng, Th.S Phan Thị Hồng Thảo, CN. Phạm Thanh Huyền, CN. Phạm Kim Dung, KTV. Phan Văn Chí. 5. Nội dung: Tách chiết và tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính chất của nó. Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, CN. Vũ Minh Đức, CN. Đặng Trần Hoàng, CN. Nguyễn Hồng Thanh. 6. Nội dung: Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học. Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Đỗ Khắc Hiếu, TS. Đỗ Thị Thảo. Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 9 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 7. Nội dung: Thử nghiệm IL-2 trên mô hình động vật thí nghiệm Cơ quan tham gia: Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN. Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trần Công Yên, PGS. TS Nguyễn Thị Quỳ, ThS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, CN Bùi Thị Vân Khánh, CN. Nguyễn Thuỷ Chung, CN. Lê Thị Thanh, CN. Vũ Đình Quang, CN. Kiều Thị Thu Hà. 8. Nội dung: Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2 Cơ quan tham gia: Trung tâm Quốc gia Kiểm định vacxin và sinh phẩm y học Những người tham gia thực hiện: GS. TS Nguyễn Đình Bảng, TS. Nguyễn Thị Kim Hương. Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 10 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 BÀI TÓM TẮT Trong những năm gần đây, bệnh ung thư đang trở thành một trong những nguyên nhân gây tử vong cao ở nước ta do sự ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm cùng nhiều nguyên nhân khác. Do vậy việc điều trị các bệnh ung thư là rất cấp thiết, tuy nhiên giá thành các loại thuốc điều trị ung thư thường cao và phải nhập ở nước ngoài. Ngày nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học ở Việt Nam, việc sản xuất các protein tái tổ hợp phục vụ cho y học ngày càng được quan tâm. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn cần sản xuất thuốc ở trong nước dùng cho điều trị bệnh ung thư, Đề tài KC.04.33 đã được xây dựng để bước đầu tạo ra các sản phẩm protein tái tổ hợp Interleukin-2 dùng trong điều trị bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn. Đề tài đã được các cán bộ nghiên cứu từ 3 cơ quan phối hợp để thực hiện triển khai và thu được các kết quả chính như sau: 1. Tạo dòng gen IL-2 và tạo đột điểm của gen IL-2 Bằng các kỹ thuật di truyền chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ tế bào lách của người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2. Tuy nhiên để tạo ra IL-2 giống như dạng thương phẩm (Proleukin IL-2), chúng tôi đã tiến hành tạo các đột biến điểm của gen IL-2 như: i) Làm mất điểm glycosyl hóa Alanine-Proline-Threonine ở đầu N của IL-2 bằng cách biến đổi thành Alanine-Methionine-Alanine để giảm tính độc của IL-2 đối với tế bào, ii) đột biến gốc Cys125 thành Ser125 để hạn chế khả năng tạo sai cầu disulfide trong phân tử IL-2, iii) hồi biến Ser25 thành Leu25 để giúp cho phân tử IL-2 có cấu trúc giống như dạng thương phẩm Proleukin IL-2. 2. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau Các gen IL-2 cải biến và dạng tự nhiên đã được nhân lên và gắn vào các vector biểu hiện như pET32c (+), pPIC9, pPICzα để đưa vào các hệ biểu hiện trong E. coli và P. pastoris. Kết quả biểu hiện gen cho thấy chúng tôi đã biểu hiện thành công các protein lai Trx-rhIL2MN với kích thước khoảng 32 kDa và protein dạng đơn rhIL-2 với kích thước khoảng 15,4 kDa. Chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng 90 mg/l IL-2, cao hơn 2000 lần so với dự tính và chủng nấm men P. pastoris có khả năng tổng hợp IL-2 cao gấp 100 lần so với dự tính khoảng 5 mg/ml. Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 11 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 3. Nghiên cứu lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp mang gen IL-2 quy mô 5 và 14 lít. Các chủng vi sinh tái tổ hợp E. coli và P. pastoris mang gen IL-2 đã được nuôi cấy trong các hệ thống lên men Bioflo 110 dung tích 5 và 14 lít. Kết quả lên men trong cả hai hệ thống đều cho xấp xỉ sinh khối khoảng 70-80 g sinh khối ướt/lít và 192 mg protein lai Trx-IL2/lít. 4. Tách chiết và tinh chế IL-2 tái tổ hợp Protein lai Trx-rhIL2MN tạo ra trong vi khuẩn E. coli đã được tinh sạch bằng sắc ký ái lực và phần protein lai Trx được loại bỏ bằng enzyme enterokinase. Các thành phần không mong muốn như chí nhiệt tố (pyrogen) đã được loại ra khỏi IL-2 tái tổ hợp bằng bộ kit chuẩn. Protein tái tổ hợp được tổng hợp có độ tinh sạch cao đạt 99% và độ đặc hiệu 100% với kháng thể kháng IL-2 của người. 5. Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro Hoạt tính sinh học của chế phẩm IL-2 tái tổ hợp tổng hợp trong E. coli đã được xác định bằng phép thử sinh học trên tế bào nuôi cấy in vitro CTLL-2 đạt khoảng 2,7 x 106 U/mg, tương đương với mẫu của Trung Quốc sản xuất (2,9 x 106 U/mg). Trong khi đó, hoạt tính của rhIL-2 biểu hiện trong nấm men cao hơn đạt 4x106 U/mg. Cả hai dạng IL2 tái tổ hợp đều có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào CTLL-2. 6. Thử nghiệm IL-2 trên mô hình động vật gây ung thư thực nghiệm Kết quả nghiên cứu thử nghiệm IL-2 của VN trên chuột gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa ruột cho thấy IL-2 tái tổ hợp đã làm giảm 43,5% sinh khối u báng đường ruột, đạt hiệu lực kháng u (+) và có thể làm tăng thời gian sống của chuột lên 51,3% so với đối chứng. Đây là những kết quả sơ bộ ban đầu về nghiên cứu tác động điều trị của IL-2 trên mô hình tế bào động vật, tuy nhiên nó đã chứng tỏ chế phẩm IL-2 do Việt Nam sản xuất có hoạt tính đối với u báng ở chuột gây ung thư thực nghiệm. 7. Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2 Chế phẩm IL-2 tái tổ hợp đã được gửi sang Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y học để đánh giá theo quy trình chuẩn (SOP) của Tổ chức Y tế thế giới. Kết quả cho thấy chế phẩm IL-2 do đề tài tạo ra được đánh giá là an toàn, đảm bảo điều kiện vô trùng, có tính chất lý hóa phù hợp, hiệu giá tương đương với sản phẩm do Trung Quốc sản xuất và hàm lượng chất gây sốt trong ngưỡng cho phép. Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 12 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AOM Azoxymethane DNA Axit deoxyribonucleic Amp Ampicilin RNA Axit ribonucleic BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate BMGY Buffered Minimal Glycerol Media BMMY Buffered Minimal Methanol Media Bp Base Pair cDNA Complementary deoxyribonucleic acid Cys Cystein CNSH Công nghệ sinh học dNTP 2’-deoxyribonucleotide 5’-triphosphate dO2 dissovle oxygen E. coli Escherichia coli EDTA Ethylen diamin tetra acid acetic ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EST Electrospray Ionization FDA Food and Drug Administration FPLC Fast Protein Liquid Chromatography Fw Forward (xuôi chiều) GFX Glass Fiber matrix HPLC High Performance Liquid Chromatography IL Interleukin IPTG Isopropyl β-D-thiogalactosidase kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani LBA Luria-Bertani Ampicilin Leu Leucine Lys Lysine Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 13 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài MS/MS Mass spectrophotometry NBT Nitro Blue Tetrazolium NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density P. pastoris Pichia pastoris PMSF Phenyl Methane Sulphonyl Fluoride rhIL2MM Recombinant Human Interleukin-2 Mutant Methionin rhIL2MN Recombinant Human Interleukin-2 Mutant Natural RT-PCR Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction Rv Reverse (ngược chiều) SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis Ser Serine TBS Tris – Buffer Saline Trx- Thioredixin Xgal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-galactosidase YPD Yeast Peptone Dextrose Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 KC.04.33 14 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 LỜI MỞ ĐẦU Ung thư là sự phát triển và phân chia không bình thường của các tế bào do bị đột biến gen ở tế bào soma. Theo cảnh báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO), với hơn 10 triệu trường hợp xuất hiện mới hàng năm, bệnh ung thư đang trở thành một trong những nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới. Ở Việt Nam hàng năm nước ta có khoảng 150 000 bệnh nhân bị ung thư và khoảng 1/3 số bệnh nhân đã bị chết vì các bệnh ung thư (theo số liệu thống kê tại bệnh viện K, Hà nội và Trung tâm U bướu thành phố Hồ Chí Minh). Do vậy việc điều trị bệnh ung thư đang trở nên cấp thiết và quan trọng trong mục tiêu chăm sóc sức khỏe cộng đồng của nước ta. Hiện nay các phương pháp điều trị bệnh ung thư thường đang được sử dụng là phương pháp chiếu xạ, giải phẫu hay sử dụng hoá chất trong quá trình trị liệu. Tuy nhiên các phương pháp này thường gây nên các tác dụng phụ do tính không đặc hiệu có thể giết cả các tế bào ung thư lẫn tế bào thường và ảnh hưởng lớn tới sức khỏe của bệnh nhân ung thư. Do vậy phương pháp điều trị ung thư bằng miễn dịch trị liệu đã được ứng dụng một cách có hiệu quả để có thể tiêu diệt một cách chọn lọc các tế bào ung thư. Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng các cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch các tế bào T, NK nhằm nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư ác tính trong thời gian ngắn. Đây là phương pháp mới được áp dụng ở Việt Nam trong những năm gần đây để điều trị cho các bệnh nhân ung thư. Liệu pháp điều trị ung thư bằng miễn dịch đã bước đầu thành công với nhiều loại ung thư như ung thư tế bào máu, ung thư thận, ung thư bàng quang, u trung mô ác tính, u màng não, ung thư tuyến giáp, u hắc tố...Hiện nay, Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug Administration – US FDA) đã chính thức cho phép sử dụng Interleukin-2 (IL-2) để điều trị hai loại ung thư, đó là ung thư hắc tố (melanoma) và ung thư thận ác tính. Ngoài ra, hiện nay IL-2 còn được thử nghiệm với nhiều loại ung thư khác. IL-2 là một cytokine quan trọng thúc đẩy sự hoạt hoá các tế bào miễn dịch. IL-2 kích thích sự tăng sinh các tế bào chuyên biệt của hệ thống miễn dịch như tế bào T, tế bào NK để tấn công và tiêu diệt các tế bào ung thư. Theo một số công trình nghiên cứu cho thấy IL-2 có thể tăng cường hoạt hoá hệ thống miễn dịch của các bệnh nhân bị ung Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 15 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 thư biểu mô thận và u hắc tố. Ngày nay với sự phát triển của kỹ thuật di truyền phục vụ cho y dược, các sản phẩm cytokine của người có thể được tổng hợp dưới dạng tái tổ hợp để điều trị các bệnh ung thư. Hãng Amgen Pharmaceutical của Mỹ cũng đã phát triển sản phẩm thuốc Proleukin-2 để điều trị cho các bệnh nhân bị ung thư biểu mô thận ác tính và ung thư hắc tố. Ngoài ra do có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch nên ngoài việc điều trị ung thư thì IL-2 tái tổ hợp (rhIL2) còn có thể được sử dụng trong điều trị bệnh nhân bị nhiễm virus HIV. Tuy nhiên rhIL2 thường được sử dụng phối hợp với các chất khác như Interferon-α, flourouracil, cis-retinic acid… Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta hướng nghiên cứu tạo thuốc IL-2 dạng tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư vẫn chưa được tiến hành. Phương pháp miễn dịch trị liệu cần phải được triển khai ứng dụng ở các bệnh viện Trung ương để có thể theo kịp nền y học hiện đại của thế giới. Do vậy, ở nước ta hiện nay Bộ Y tế rất khuyến khích việc tự sản xuất thuốc trong nước để chữa trị cho bệnh nhân ung thư. Với trang thiết bị và nhân lực của phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam có thể thực hiện các nghiên cứu về chế tạo protein tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và khả năng về kỹ thuật và nhân lực, trong chương trình khoa học KC.04, Viện CNSH phối hợp cùng 3 cơ quan nghiên cứu đầu ngành trong cả nước để tiến hành đề tài KC.04.33 “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung thư’’. Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 16 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI 1.1.1. Ung thư và các liệu pháp chữa trị ung thư Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Tất cả các loại tế bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối u. Các khối u này có thể là lành tính (tumor) hoặc có thể biến thành ác tính (cancer). Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và chúng trơ với các tín hiệu chết theo chương trình của tế bào bình thường (apoptosis). Các tế bào ung thư cũng có thể lan sang các mô xung quanh và lan truyền trong cơ thể để tạo nên khối u thứ cấp. Quá trình này gọi là di căn. Để phát triển thì cả hai quá trình hình thành các loại khối u trên đều cần tạo ra các mạch máu mới, do đó mà gần đây một trong những liệu pháp chữa trị khối u đang được các nhà nghiên cứu quan tâm là tạo ra các chất ức chế quá trình tạo các mạch máu của khối u đang phát triển. Nguyên nhân của ung thư được xác định là do đột biến. Thế nhưng các đột biến gây ung thư khác với đột biến của bệnh di truyền ở hai điểm sau. Các đột biến dẫn đến ung thư chủ yếu là do đột biến tế bào soma, còn các đột biến ở bệnh di truyền xảy ra ở các tế bào mầm (the germ cells). Tuy nhiên cũng có trường hợp một số đột biến ở bệnh nhân bị bệnh di truyền đã tạo tiền đề cho sự phát triển một số dạng ung thư. Điểm khác thứ hai là ung thư không thể hình thành do đột biến đơn, mà nó là hậu quả của sự tích luỹ từ ít nhất 3 cho đến 20 đột biến xảy ra trong các gen điều khiển quá trình tăng sinh tế bào, phụ thuộc vào loại ung thư. Chính vì thế mà ung thư hay xảy ra ở người cao tuổi, vì cần có sự tích luỹ các đột biến gen. Điều này cũng giúp một phần lý giải tỷ lệ người bị bệnh ung thư cao gắn liền với ô nhiễm môi trường, hút thuốc lá... Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 17 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài Sự phân chia của tế bào bình thường KC.04.33 Sự phân chia của tế bào ung thư Tế bào bị phá hủy Hình 1. Sự phát triển của tế bào ung thư (http://www.edinformatics.com/biotechnology/cancer.htm) 1.1.2 Ung thư thận và u hắc tố Trong các loại ung thư có thể được điều trị bằng liệu pháp miễn dịch, 2 dạng ung thư là u hắc tố (melanoma) và ung thư thận ác tính bước đầu đã được điều trị có kết quả nhờ interleukin-2 [10, 11, 26]. Thận là một phần trong hệ tiết niệu. Chức năng chính của nó là lọc máu và sản xuất nước tiểu để loại bỏ chất thải ra ngoài cơ thể. Khi ung thư thận phát triển, nó có thể xâm lấn vào các cơ quan ở gần thận như gan, đại tràng, hoặc tuyến tuỵ. Tế bào ung thư thận có thể tách khỏi khối u ban đầu và di căn tới các bộ phận khác của cơ thể. Các triệu chứng của ung thư thận là đái ra máu, có khối u ở vùng thận. Các triệu chứng ít gặp hơn như mệt mỏi, chán ăn, đau ở vùng thắt lưng không khỏi, sốt lặp đi lặp lại nhiều lần. Ung thư thận tăng lên theo độ tuổi, bệnh thường xuất hiện nhiều nhất là trong độ tuổi 50-70. Nó xảy ra ở nam giới nhiều gấp đôi nữ giới. Nguyên nhân của ung thư thận là do đột biến gen, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự phơi nhiễm trong nghề nghiệp, tia xạ… Ung thư thận được điều trị chủ yếu bằng hormon, hoá chất, liệu pháp miễn dịch. U hắc tố là một loại ung thư khá thường gặp và đang có tần suất mắc bệnh tăng nhanh nhất trong một số loại ung thư hiện nay. Các nhà nghiên cứu dự đoán tần suất mắc bệnh tiếp tục tăng trong 20 năm tới. Nguyên nhân làm tăng tần suất mắc bệnh chưa được xác định. Một số yếu tố có thể có liên quan, như thói quen phơi nắng và những thay đổi mang tính chất toàn cầu như thủng tầng ozon và sự ô nhiễm môi trường. U hắc tố có thể gặp ở mọi lứa tuổi người trưởng thành. Theo thống kê thì u hắc tố có tính chất gia đình. Cắt bỏ khối u là lựa chọn điều trị dành cho u hắc tố. Sau khi Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 18