Tài liệu Báo cáo môn học cncb thịt & thủy sản ứng dụng áp suất cao trong bảo quản và chế biến thịt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO MÔN HỌC CNCB THỊT & THỦY SẢN Đề tài ỨNG DỤNG ÁP SUẤT CAO TRONG BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN THỊT GVHD: Th.S Nguyễn Thị Hiền SVTH : HC07TP NĂM HỌC 2010- 2011 1 MỞ ĐẦU Theo xu hướng toàn cầu hóa, các nhà sản xuất các sản phẩm thịt đang phải cạnh tranh gay gắt với nhau. Để giữ vững và nâng cao vị trí của họ, các công ty thực phẩm và thịt cần quan tâm đến sự thay đổi trong thói quen mua sắm và tiêu thụ sản phẩm của người tiêu dùng, cũng như quan điểm và nhu cầu của họ. Nhu cầu của người tiêu dùng thay đổi liên tục nhưng một vài quan điểm chính không thay đổi. Nhìn chung, người tiêu dùng luôn đòi hỏi chất lượng cao và sự tiện dụng của các sản phẩm thịt, với mùi vị tự nhiên. Bên cạnh đó, họ còn yêu cầu sự an toàn và các sản phẩm phải tự nhiên không bổ sung phụ gia như các chất bảo quản, chất giữ ẩm… Để đáp ứng tất cả những yêu cầu này mà không làm giảm độ an toàn thực phẩm cần phải áp dụng các công nghệ mới trong công nghiệp thực phẩm nói chung và trong công nghiệp thịt nói riêng. Hơn nữa, các sản phẩm thịt đóng gói chân không dạng lát mỏng và dạng ướp là những dòng sản phẩm có nhu cầu gia tăng rất cao trong vài năm gần đây. Những sản phẩm này có khả năng nhiễm khuẩn trước khi đóng gói. Vì thế, giải pháp cần thiết là ứng dụng các kỹ thuật mới cho các dòng sản phẩm trên. Hiện nay, một vài công nghệ mới đang được nghiên cứu trong đó áp suất cao là một phương pháp có tiềm năng ứng dụng rất cao. Áp suất cao là một kỹ thuật rất hứa hẹn đối với các sản phẩm thịt và nó cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các dòng sản phẩm mới tiêu thụ ít năng lượng. 2 1. Lịch sử phát triển: Giáo sư PW Bridgman (1914), một người tiên phong trong vật lý áp suất cao, báo cáo về albumin lòng trắng trứng và lòng đỏ bị đông tụ dưới áp suất thủy tĩnh cao 500-600 MPa mà không có sự phân rã của lớp vỏ. Điều này cho thấy rằng áp suất thủy tĩnh cao (cao áp) là một công cụ hữu ích cho chế biến thực phẩm thay vì xử lý nhiệt. Tuy nhiên ứng dụng của áp suất cao để chế biến thực phẩm đã gần như bỏ qua cho đến khi sự khởi đầu của dự án "Phát triển áp suất cao lên men sử dụng DenseMass" được hỗ trợ bởi Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thuỷ sản (1989) tại Nhật Bản . Đặc biệt, các nhà khoa học về thịt ở Úc đã tiến hành áp dụng áp suất cao kể từ đầu những năm 1970 (Macfarlane 1973; Bouton, Ford, Harris, Macfarlane, O'Shea 1977). Kể từ khi khởi phát của các dự án tại Nhật Bản, việc áp dụng áp suất cao để chế biến thực phẩm đã thu hút nhiều sự chú ý ở Nhật Bản và Châu Âu bởi vì những thay đổi trong đặc tính của nguyên liệu thực phẩm gây ra bởi áp suất trong các phương thức khác nhau từ nhiệt (Cheftel 1992 ; Hayashi 1992; Johnston 1995; Knorr 1996). Một số loại thực phẩm được chế biến bằng việc sử dụng áp suất đã có mặt trên thị trường. (Suzuki 2002). Nhìn chung, áp suất cao sử dụng trong khoảng 100-600 MPa tại nhiệt độ phòng. Áp suất cao làm phá hủy các tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn và vô hoạt enzyme, nhưng không làm thay đổi đặc điểm bề ngoài của sản phẩm và giữ lại một số vitamins. Tuy nhiên, khả năng chịu đựng của vi sinh vật rất khác nhau phụ thuộc vào giống và loại thịt được xử lý. Ảnh hưởng của xử lý áp suất cao cũng phụ thuộc vào áp suất sử dụng, nhiệt độ và thời gian. Sử dụng áp suất cao có thể gây ra những biến đổi đặc biệt về cấu trúc của sản phẩm và khả năng này có thể được sử dụng để phát triển một dòng sản phẩm mới hoặc gia tăng chức năng của một số thành phần nào đó. Vì thế, để có thể áp dụng kỹ thuật này trên quy mô công nghiệp với các nghiên cứu từ phòng thí nghiệm cần tiến hành: Thiết lập các điều kiện xử lý tốt nhất cho mỗi loại sản phẩm. Kết hợp áp suất cao với các hệ thống đóng gói mới, các chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên, enzyme… 3 2. Ảnh hưởng của áp suất cao trong công nghiệp thịt Ảnh hưởng của áp suất cao lên các thành phần dinh dưỡng trong thịt Thịt là môi trường tốt cho sự phát triển của vi sinh vật, thành phần hóa học của thịt chủ yếu là nước, protein (15-21%), chất béo (0,5-25%), các vitamin (giàu vitamin nhóm B) và các oligonutrient. Theo quan điểm vật lý, khi gia tăng áp suất sẽ có một ảnh hưởng vật lý lên các phân tử làm chúng tiến lại gần nhau hơn dẫn đến sự chuyển pha, sự chuyển pha này có thể đảo ngược lại sau khi giảm áp. Điều này là những gì đã xảy ra với nước và chất béo. Theo quan điểm hóa học, áp suất cao tác động nhẹ hơn so với nhiệt độ. Các liên kết cộng hóa trị không bị phá vỡ nhưng các liên kết yếu như liên kết hydro và liên kết kỵ nước có thể bị biến đổi bất thuận nghịch (Cheftel, 1995). Ảnh hưởng của áp suất lên nước chủ yếu bao gồm sự giảm nhiệt độ nóng chảy và gia tăng sự ion hóa dẫn đến sự giảm pH. Những biến đổi này là thuận nghịch theo áp suất. Nhưng chúng góp phần làm biến đổi những đặc điểm của sản phẩm được xử lý áp suất cao. Calpastatin bị ức chế tại áp suất từ 200MPa trở lên trong khi calpain bị thoái hóa ở áp suất trên 400MPa. Tại áp suất thấp hơn 200MPa các lysosome bị phá vỡ, khả năng tự phân gia tăng và thịt mềm hơn. Cathepsin H và aminopeptidase bị vô hoạt ở áp suất từ 200MPa trở lên và cathepsin D bị vô hoạt khi áp suất đạt tới 500MPa (Montero & Gomez-Guillen, 2002). Các vitamin và đường trong thịt không bị biến đổi bởi áp suất cao nhưng các polysaccharide có thể bị biến đổi. Nhìn chung, sự hình thành gel bị ức chế bởi áp suất cao vì áp suất cao có thể biến đổi nhiệt độ chuyển pha từ sol đến gel. Sự đông lại có thể được tạo ra bởi áp suất và sau đó gel tạo thành sẽ mềm và sáng hơn.. Cấu trúc chính của protein bị ảnh hưởng nhẹ bởi áp suất cao, sự biến đổi các liên kết yếu có thể làm biến tính protein hoặc ngược lại làm hoạt hóa enzyme. Các ảnh hưởng này rất khác nhau phụ thuộc vào loại protein và điều kiện của quá trình xử lý. Áp suất cao mang lại sự chuyển pha thuận nghịch cho lipid từ lỏng thành rắn dẫn đến sự đông lại. Nếu là một hỗn hợp lipid, áp suất cao có thể tạo ra sự phân tách các pha khác nhau bằng việc phá hủy các tế bào membrane. Cheah và Ledward (1996) cũng nghiên cứu các ảnh hưởng của áp suất về quá trình oxy hóa chất béo 4 trong cơ bắp băm nhỏ. Trên cơ sở dựa vào số đo của acid thiobarbituric (TBA), họ chỉ ra rằng trị giá TBA không tăng trong cơ bắp băm nhỏ tiếp xúc với áp suất cao lên đến 200 MPa, sau đó hơi tăng lên khi áp suất là 300 MPa, và tăng rõ rệt khi 800 MPa. Áp suất cao trên 300 MPa đến 400 MPa sẽ làm giảm myoglobin và oxymyoglobin, Fe2+ myoglobin trở thành Fe3+ metmyoglobin và protein globin bị biến tính., từ đó làm gia tăng quá trình oxy hóa lipid. Ngoài ra, nguyên nhân của sự gia tăng còn có thể do các kim loại trong thịt nằm trong các muối phospholipids hoặc muối acid hữu cơ với kim loại. Vì thế trong quá trình áp suất cao, các ion kim loại (có thể là Fe và Cu) đã giải thoát ra khỏi các phức chất này và xúc tác phản ứng oxy hóa chất béo. Hoặc sự gia tăng oxy hóa chất béo trong thịt ở áp suất cao có thể do sự thay đổi cấu tạo của hemoprotein làm bộc lộ các nhóm heme xúc tác oxy hóa chất béo. Ngược lại, Orlien và Hansen (2000) đã báo cáo quá trình oxy hóa lipid ở áp suất cao không liên quan đến việc giải phóng các nonheme sắt hay hoạt tính xúc tác của metmyoglobin, nhưng có thể liên quan đến sự phá hủy membrane. Theo Cheftel và Culioli (1997), sự oxy hóa gây ra bởi áp suất có thể được hạn chế các quá trình công nghệ cho các sản phẩm thịt, bằng cách đóng gói sản phẩm hay sử dụng các chất chống oxy hóa. Loại bỏ oxy hoặc thêm dioxide carbon (CO2) trước khi xử lý áp suất cao để ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid. Ảnh hưởng của áp suất cao đến độ mềm thịt Khi một con vật được giết mổ, quá trình co cứng sẽ phát triển trong vòng vài giờ với sự co của các sợi cơ và làm tăng độ nhớt của thịt. Miếng thịt sau đó sẽ mềm nhưng hương vị bị giảm sút đáng kể, và thịt đó thì không phù hợp cho nấu ăn và chế biến vì độ nhớt cao và khả năng giữ nước thấp. Nếu thịt được giữ ở nhiệt độ thấp trong một vài ngày, thịt trở nên mềm mại và giữ trạng thái đó trong vài tuần tiếp theo. Vì vậy, quá trình sử dụng rộng rãi nhất cho thịt với cải tiến của hương vị và mùi được gọi là conditioning và aging. Nếu những miếng thịt dai, đặt biệt là từ những con động vật già có thể được làm mềm bởi áp suất cao thì áp suất cao có tiềm năng lớn trong việc tận thu nguồn nguyên liệu từ thịt của các con vật già, tránh lãng phí. 5 Một thử nghiệm để tăng độ mềm của thịt bởi áp suất cao lần đầu tiên được thực hiện bởi Macfarlane (1973) ở Úc. Một điều rất quan trọng là phải lựa chọn thời gian nào của thịt sau khi giết mổ thích hợp cho việc áp dụng áp suất cao. 2.2.1. Ảnh hưởng của áp suất cao lên cơ trước giai đoạn tê cứng: Macfarlane (1973) đã thực hiện các phép đo khác nhau trên các cơ Biceps femoris tại 100 MPa trong 2-4 phút. Kết quả cho thấy các cơ rút ngắn khoảng 35% so với các cơ không được xử lý áp suất. Tuy nhiên các phép đo lực cắt chỉ ra rằng áp suất làm tăng độ mềm của thịt. Kết quả nghiên cứu của Macfarlane cho thấy rằng việc sử dụng áp suất cao trong vài phút ở nhiệt độ môi trường đã làm giảm lực cắt lên cơ trước tê. Phương pháp làm tăng độ mềm cho thịt bởi áp suất cao cũng đã được báo cáo trong các tài liệu của Macfarlane (Macfarlane, Mckenzie, Turner, và Jones năm 1981; Macfarlane và Morton 1978) và những người khác (Elgasim và Kennick 1982; Kennick, Elgasim, Holmes, và Meyer 1980; Riffero và Holmes 1983). 2.2.2. Ảnh hưởng của các quá trình xử lý nhiệt và áp suất cao lên cơ sau giai đoạn tê cứng Mặc dù việc sử dụng áp suất tác động lên cơ trước tê cứng là một cách hiệu quả trong việc xử lý độ dai của thịt. Quá trình còn có tiềm năng áp dụng cho thịt sau tê cứng. Bouton et al. (1977) chứng minh rằng cơ sau tê cứng của trâu, bò sẽ không đạt được biến đổi như vậy khi sử dụng lực cắt tương tự, trừ khi sử dụng áp suất cao ở nhiệt độ cao. Họ nói rằng khi áp suất là 150 MPa ở 60oC trong 30 phút là cần thiết để cải thiện giá trị cắt. Locker và Wild (1984) cũng cho rằng áp suất- nhiệt (PH) có hiệu quả trong việc giữ mềm thịt sau một thời gian đáng kể tại một nhiệt độ cao. Macfarlane (1985) đã trình bày một đề án bao gồm việc áp suất làm phân giải các protein và mức độ mềm thịt bằng cách kết hợp áp suất với nhiệt độ. Trong đề án của mình, các protein bị phân giải bởi áp suất cao là biến tính và không thể kết hợp bằng cách xử lý nhiệt, kết quả là làm mềm thịt. Việc sử dụng PH thì hiệu quả trong việc khắc phục độ dai. Tuy nhiên, quá trình này có ảnh hưởng không tốt cho thịt do màu nâu tạo ra bởi áp suất và nhiệt. 6 2.2.3. Cải thiện độ mềm của cơ sau tê cứng bằng cách sử dụng áp suất cao. Từ góc độ của các ứng dụng thương mại khi sử dụng áp suất cao, độ mềm của cơ sau tê cứng thì quan trọng hơn cơ trước tê cứng. Suzuki, Kim, Honma, Ikeuchi, và Saito (1992) đo độ cứng và độ đàn hồi của cơ bắp vai sau tê cứng thu được từ một con bò sữa già khi sử dụng áp suất cao từ 100-300 MPa trong 5 phút bằng máy Rheo Meter (Fudoh Công ty, Nhật Bản. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể nào về độ đàn hồi. Điều này cho thấy cơ sau tê cứng có thể được làm mềm bằng áp suất cao mà không cần xử lý nhiệt. Việc sử dụng P-H trong thời gian dài được Macfarlane đề xuất (1985), còn những người khác (Bouton et al 1977;. Riffero và Holmes 1983) thì cho rằng không cần thiết phải kết hợp với nhiệt độ trong việc làm mềm cơ sau tê cứng nếu áp suất sử dụng cao hơn so với trong thí nghiệm. 2.2.4. Cơ chế làm mềm và sự gia tăng những biến đổi của thịt khi sử dụng áp suất cao Ta biết rằng thịt của con vật sau khi chêt sẽ bị mềm sau một khoảng thời gian nhất định do những thay đổi xảy ra trong cơ, chủ yếu là do tác động của các protease nội sinh: - Sự suy yếu của tương tác actin-myosin - Phân mảnh của tơ cơ thành các phân đoạn ngắn do Z-line tan rã - Sự thoái hóa của các sợi đàn hồi bao gồm connectin (còn gọi là titin) - Suy yếu của mô liên kết. Để làm rõ cơ chế gây ra áp suất làm mềm thịt hoặc việc tăng tốc các biến đổi của thịt, các đối tượng sau đây đã được xem xét: - Áp suất ảnh hưởng lên tương tác của actin-myosin - Áp suất ảnh hưởng đến sự phân mảnh của tơ cơ, - Áp suất ảnh hưởng đến sự chuyển đổi -connectin thành  -connectin - Áp suất ảnh hưởng lên mô liên kết 7 2.2.4.1. Các ảnh hưởng từ sự tương tác của actin-myosin. Quá trình tương tác của actin-myosin và cơ cấu của các sợi cơ được biến đổi trong thời gian con vật sau khi chết được minh chứng bằng những thay đổi trong hoạt tính ATPase của tơ cơ. Ouali (1984) báo cáo rằng hoạt tính ATPase gia tăng tại cường độ ion thấp (khoảng dưới 0,2 M KCl), trong khi nó giảm ở những cường độ cao hơn (0,3 M hoặc cao hơn) khi gia tăng thời gian bảo quản. Ông kết luận rằng giá trị nghiêng (giá trị xác định sự nhạy cảm với cường độ ion) có thể là một thông số chỉ thị chính xác về mức độ lão hóa của cấu trúc các sợi cơ và được thể hiện bằng các chỉ số sinh hóa của Miofibrillar Aging (BIMA). Nishiwaki, Ikeuchi, và Suzuki (1996) đo hoạt tính của ATPase (cường độ ion là khoảng 0,06-0,32 M KCl) của các cơ được xử lý bằng áp suất cao (30-300 MPa, 5 phút) và ở 4oC trong 7 ngày. Sự thay đổi giá trị BIMA được hiển thị trong hình 8.1. Đối với cơ được xử lý như trên, giá trị BIMA tăng dần với sự gia tăng của thời gian lưu trữ và đạt khoảng 2,5 lần so với các cơ của con vật chết (hình 8,1). Giá trị BIMA của các tơ cơ gia tăng khi tăng áp suất lên 200 MPa và đạt đến mức giống như của các tơ cơ để ở 4oC trong 7 ngày. Tuy nhiên, khi áp suất cao hơn (300 MPa) sẽ làm sụt giảm đáng kể giá trị của BIMA. Sự thay đổi cấu trúc của các sợi mỏng gây ra bởi áp suất là yếu tố chính ảnh hưởng đến giá trị BIMA thu được trong các sợi cơ khi sử dụng áp suất cao trong một thời gian ngắn (5 phút). Những thay đổi cấu trúc mạnh mẽ được quan sát từ những sợi cơ được xử lý áp suất , những thay đổi đó không quan sát thấy trong các sợi cơ không xử lý bằng áp suất. Kết quả này gợi ý rằng việc áp dụng áp suất cao cho các sợi cơ là nguyên nhân gây ra những thay đổi trong hoạt tính của ATPase và giá trị BIMA của các sợi cơ. 8 Hình 1: Ảnh hưởng của áp suất cao và thời gian lên giá trị BIMA 2.2.4.2. Ảnh hưởng đến sự phân mảnh của tơ cơ Các tơ cơ khi sử dụng các điều kiện đồng hóa thì ngắn hơn và tạo ra những khúc cơ ngắn hơn là của những miếng thịt sau khi giết mổ (Takahashi, Fukazawa, và Yasui 1967) và sự phá vỡ các tơ cơ tại Z-line thì liên quan đến sự gia tăng độ mềm thịt (Davey và Gilbert 1967; Fukazawa và Yasui 1967; Takahashi et al 1967). Do đó sự phân mảnh các sợi tơ cơ được coi là hữu dụng để dự đoán sự mềm của thịt (Calkins và Davis năm 1980; Olson, Parrish, và Stromer 1977). Suzuki, Watanabe, Iwamura, Ikeuchi, và Saito (1990) cho thấy mức độ phân mảnh trong tơ cơ từ các bắp thịt trâu, bò với áp suất (100-300 MPa, 5 phút) trong hình 8.2. Mức độ phân mảnh được thể hiện như tỷ lệ phần trăm của số cơ tơ đoạn gồm 1-4 sarcomeres (khúc cơ) để tổng số tơ cơ dưới kính hiển vi tương phản pha. Mức độ phân mảnh, thì ít hơn 10% so với các cơ bắp không được xử lý áp suất, đã được tăng tốc bằng cách tăng áp lên hơn 30%, 70%, 80%, và 90% tương ứng tại 100, 150, 200, và 300 MPa. Mức độ phân mảnh, 80% đến 90%, trên mức tối đa của 9 các phân mảnh của tơ cơ trong các cơ tự nhiên. Từ các kết quả của sự phân mảnh này là sự tiếp xúc ngắn của các cơ sau tê cứng trong điều kiện áp suất cao có vẻ là hữu ích cho quá trình làm mềm thịt. Hình 2: Ảnh hưởng của áp suất cao lên mức độ phá vỡ tơ cơ Các yếu tố đặc trưng trong những báo cáo của Suzuki et al. (1990) đó là tác động của áp suất cao đến cấu trúc myofibrillar (sợi cơ tơ) sau tê cứng trong các bắp thịt trâu, bò. Trong tơ cơ được xử lý tại 100 MPa, quá trình co của các sarcomere được quan sát, và sự khác biệt trong mật độ giữa các A-band và I-band trở nên đồng nhất so với các mẫu bình thường (không qua xử lý). Đánh dấu sự vỡ của cấu trúc dạng sợi của I-band và sự biến mất của các M-line được quan sát trong tơ cơ của các cơ bắp tại tại áp suất 150 MPa. Trong tơ cơ của các cơ bắp tại 200 MPa, mạch liên tục cấu trúc của sarcomere đã gần như hoàn toàn bị mất, với tấm A-và I-sợi trải rộng trên các khúc cơ này. Sự biến mất của M-line và sự dày lên của Z-line, có thể là do sự co rút của I-filament, đã được quan sát. Sự phân tách của các A-band, thêm vào đó nhiều thay đổi đã được đề cập và được quan sát trong tơ cơ của các cơ bắp tại áp suất 300 MPa. Chiều dài của các sarcomere(khúc cơ), được xử lý tại 100 MPa, 10 dường như đã dần dần phục hồi với sự gia tăng áp suất, vì những mất mát ngày càng nhiều của kết cấu liên tục. Như đã đề cập, phân mảnh của tơ cơ có nguồn gốc từ sự đứt đoạn của tơ cơ tại Z-line, trong khi các Z-line từ tơ cơ bị phân mảnh trong các cơ bắp được xử lý áp suất vẫn còn nguyên vẹn. Mặc dù việc xử lý áp suất cho các cơ sau tê cứng diễn ra trong thời gian ngắn (5 phút) và nhiệt độ thấp (khoảng 10oC), thì sự thay đổi siêu cấu trúc (ultrastructure) của tơ cơ phù hợp với những báo cáo của Macfarlane và Morton (1978) và Locker và Wild (1984). Việc áp dụng áp suất cao được biết là ảnh hưởng của tình trạng kết hợp của cả hai actin và myosin, đó là những thành phần chủ yếu của tơ cơ. Một số báo cáo mô tả sự khử polymer của actin-F (Ikkai và Ooi 1966; Ivanov, Bert, và Lebedeva 1960; O'Shea, Horgan, và Macfarlane 1976), myosin polymer (Josephs và Harrington 1966, 1967, 1968), và actomyosin (Ikkai và Ooi 1969) dưới áp suất cao đã được công bố. Mặc dù nó không rõ liệu sự khử polymer của actin-F xảy ra trong cơ và sự suy thoái của các sợi-I. (tức là, sự khử polymer của F-actin do áp suất cao) có thể là một trong những nguyên nhân của sự phân mảnh. Một khả năng làm tăng tốc sự phân mảnh của tơ cơ và đông tụ của các myofibrillar protein tại nơi phân tách đã được Macfarlane đề nghị (1985) có thể làm tăng độ mềm của thịt khi sử dụng áp suất cao. Từ những quan sát và phân tích ultrastructural SDS-PAGE của tơ cơ (dữ liệu không được hiển thị, Suzuki et al 1990)., Cơ chế cho sự rối loạn trong cấu trúc liên tục của tơ cơ gây ra bởi áp suất trong các điều kiện khác nhau. 2.2.4.3. Ảnh hưởng từ sự chuyển đổi -Connectin thành -Connectin Nghiên cứu gần đây cho thấy một cách rõ ràng rằng một protein, thường được gọi là connectin (còn gọi là titin) duy trì tính đàn hồi và tính ổn định cơ học của cơ xương. Lúc chết, các -connectin (khoảng 3.000 kDa) tồn tại cùng với một lượng nhỏ các phân đoạn phụ của nó, -connectin (khoảng 2.000 kDa; Maruyama, Kimura, Yoshidomi, Sawada, và Kikuchi 1984; Wang, McClure và Tu 1979). 11 Hình 3: Biểu diễn kết quả chạy điện di trong gel 2% polyacrylamide chứa 0,1% SDS và 0,5% agarose. Chú thích: -  = -connectin -  = -connectin - 1200k = 1200 kDa peptide - N = nebulin - M = chuỗi myosin lớm Bởi vì khi sử dụng áp suất cao không tạo nên các chuỗi peptid , do đó nó được quan tâm để giải thích những nghi ngờ rằng tại sao việc chuyển đổi -connectin thành -connectin được gây ra bởi áp suất. Có hai lý thuyết về cơ chế tách 12 connectin; một là sự phân hủy protein bởi calpain (protease làm tăng hoạt tính Ca2+) và cathepsin D (Kim et al 1993, 1995;. Suzuki, Kim, và Ikeuchi 1996), và hai là các phản ứng trực tiếp của ion Ca2+ (Tatsumi, Hattori, và Takahashi năm 1996). Báo cáo của Kim et al. (1993) cho thấy rằng hiệu quả của áp suất cao lên các connectin trong isolated myofibrils (cơ riêng biệt) tương tự như của connectin trong cơ bắp, được quan sát những phân tích của SDSPAGE. Họ tìm thấy hai loại chất ức chế protease, 1 mM leupeptin và 1 mM E64, hoàn toàn ngăn chặn sự suy thoái của connectin (100-400 MPa cho 5 phút), mặc dù các tơ cơ bên trong đều có sự hiện diện của 3mM CaCl2. Như vậy giả thiết về sự suy thoái của connectin do tác động trực tiếp của các ion canxi dưới áp suất cao như vậy là không thể xảy ra. Kết quả này chứng minh sự tham gia của một số protease nội sinh, đặc biệt là calpain, trong việc chuyển đổi connectin thành -connectin. Điều này có thể được giải thích bằng cách giả sử rằng sự mẫm cảm của connectin đối với calpain được tăng rõ rệt bởi việc áp dụng các áp suất, nhưng khả năng của calpain để thủy phân connectin được giảm dần với tăng áp suất. Nó đã được chứng minh rằng áp suất cao 100 MPa hoặc cao hơn thì sẽ làm tăng tính mẫm cảm đến quá trinh proteolysis (phân hủy Protein). Bởi vì nồng độ ion canxi trong dung dịch sarcoplasmic là gần tối ưu để kích hoạt calpain do việc hình hành từ lưới sarcoplasmic trong khi sử dụng áp suất cao (Suzuki, Okamoto, Ikeuchi, và Saito1993, 1994), mức độ chuyển đổi của -connectin thành -connectin được cho là chủ yếu liên quan đến sự phụ thuộc áp suất của các thay đổi cấu trúc của connectin và sự vô hoạt của calpain. Cơ chế cho việc chia connectin dưới áp suất cao có lẽ là giống như trong cơ suốt quá trình xử lý (Kim et al 1995). Sự gia tăng của những hợp chất được trích ly từ connectin có thể cho thấy được những thay đổi về chất lượng của cấu trúc connectin trong cơ gây ra bởi áp suất (Suzuki et al 1987). 2.2.4.4. Ảnh hưởng của các mô liên kết Độ mềm của thịt thì phụ thuộc vào hai thành phần khác nhau: độ dai và độ dẻo dai của actomyosin. Độ dẻo dai của actomyosin là do các protein myofibrillar, trong khi độ dai do sự hiện diện của các mô liên kết. Nói chung, nó được chấp nhận rằng 13 những thay đổi của các mô liên kết trong quá trình bảo quản thịt thì thấp hơn so với những biến đổi trong myofibrillar protein. Một vài báo cáo mô tả những ảnh hưởng của áp suất đến mô liên kết cũng như là đối với protein tơ cơ. Ratcliff, Bouton, Ford, Harris, và Macfarlane (1977) cho thấy rằng mặc dù sử dụng P-H có hiệu quả trong việc loại bỏ được tính dai của tơ cơ (độ dai actomyosin), độ mềm của các mẫu được xử lý thì được hạn chế bởi độ dai của các mô liên kết. Macfarlane et al. (1981) cũng cho thấy một sự chuyển tiếp do thiếu vắng của các actin-F, nhưng mà do các mô liên kết đã không được thay đổi trong thermograms (biểu đồ nhiệt độ) của cơ đã được sử lý bằng áp suất. Beilken, Macfarlane, và Jones (1990) cho rằng áp suất điều trị ở các nhiệt độ khác nhau, từ 40 C đến 80C có rất ít hoặc không có biến đổi rõ rệt về sự dẻo dai hơn là để tăng nhiệt độ bằng xử lý nhiệt làm giảm độ dai. Suzuki, Watanabe, Ikeuchi, Saito, và Takahashi (1993) báo cáo rằng không có sự khác biệt đáng kể trong siêu cấu trúc (ultrastructure), điện di, nhiệt độ hòa tan, và thermogram (biểu đồ nhiệt độ) của phân quét calorimetry (đo nhiệt lượng) (DSC) phân tích của các collagen bắp phân lập từ một con bò sữa già đã được quan sát trong số các mẫu cơ không được xử lý áp suất và các cơ được xử lý áp (100-400 MPa, 5 phút). Ảnh hưởng của áp suất vào nhiệt độ biến tính và enthalpy theo thermogram được thể hiện trong bảng 1. Gần đây Nishimura, Hattori, và Takahashi (1995) cho rằng sự suy yếu của các mô liên kết trong cơ, endomysium (vỏ nội cơ) và perimysium (màng cơ), gây ra trong quá trình thì tương quan với sự mềm thịt bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử để quét . Ueno, Ikeuchi và Suzuki (1999) mô liên kết trong các cơ đã qua chế biến và xử lý áp suất bằng kính hiển vi quét điện tử. Trong suốt thời gian xử lý, sự suy yếu cấu trúc của các endomysium và perimysium và sự phá vỡ các cấu trúc tổ ong đã xuất hiện. Trong cơ được xử lý áp suất, biến dạng của cấu trúc tổ ong của endomysium được tăng lên với sự gia tăng của áp suất tác động lên các cơ bắp, và mở rộng mạng lưới của endomysium đã được quan sát trong các mẫu cơ tại 400 MPa. Hiện nay, kết luận đó không phải là chắc chắn rằng các áp suất gây ra những thay đổi cơ cấu trong các mô liên kết dẫn đến một số hiệu ứng đáng kể đến độ mềm của thịt. Nhưng nếu muốn hiểu rõ thêm thì phải nghiên cứu sâu hơn nữa để làm rõ vấn đề này. 14 Bảng 1: Ảnh hưởng của áp suất lên tình trạng biến tính của collagen trong cơ Control 100 MPa 150 MPa 200 MPa 300 MPa To 62.40  62.13  62.58  62.80  62.68  Nhiệt độ biến tính (oC) TP TC 1.03 65.65  0.67 68.70  0.66 65.35  0.25 68.95  1.03 66.05  0.88 68.80  1.65 66.03  0.99 68.73  0.63 65.90  1.23 68.95  0.65 0.64 0.64 0.72 0.83 H (mJ/mg) 15.00  1.40 15.53  1.65 15.78  1.80 16.93  1.10 15.50  1.65 To = Nhiệt độ bắt đầu biến tính; Tp = nhiệt độ biến tính nhiều nhất; Tc = Nhiệt độ kết thúc biến tính, H = enthalpy của biến tính, mJ/mg khối lượng khô. Nguồn: Suzuki, Wantanabe, Ikenchi, Saito, and Takahashi (1993). Ảnh hưởng của áp suất cao lên vi sinh vật Tốc độ và động học vô hoạt vi sinh vật phụ thuộc vào một vài thông số như: loại vi sinh vật, cường độ áp suất, thời gian, nhiệt độ, pH, hoạt tính nước và thành phần thực phẩm. Nhìn chung, sự ức chế càng tốt khi áp suất càng cao. 2.3.1. Sự phá hủy của áp suất lên vi sinh vật: Sự ức chế vi sinh vật bởi áp suất cao có lẽ là do tác động của nhiều yếu tố kết hợp lại. Áp suất cao không ức chế hoặc phá hủy một vị trí nào đó trong tế bào hoặc một chức năng của tế bào., mà sự chết của tế bào là bởi những hư hỏng nhiều hoặc tích tụ bên trong tế bào (Simpson & Gilmour, 1997). Màng tế bào là mục tiêu chính của sự phá hủy, chủ yếu qua việc làm rối loạn sự vận chuyển các chất của màng tế bào do hậu quả của sự kết tinh phospholipid. Các chức năng khác của tế bào bị ảnh hưởng bởi áp suất bao gồm: sự thay đổi trao đổi ion, thành phần acid béo, hình thái học của ribosome, hình thái học tế bào, biến tính protein và ức chế hoạt tính enzyme, sự mất ổn định của việc sao chép DNA, sự hình thành không bào…Sự khác nhau về tính chất của màng tế bào có thể là một nhân tố quan trọng trong việc xác định ảnh hưởng của áp suất hoặc stress lên vi sinh vật. Trong một vài hệ vi sinh vật, người ta cho rằng sự phá hủy là do rối loạn sự vận chuyển protein qua màng tế bào (Vogel, Molina-Guiterrez, Ulmer, Winter, & Ganzle, 2001). Đây có thể là cơ chế chung làm cho tế bào chết. Nhìn chung, các tế bào chết gia tăng khi tăng áp suất nhưng nó không tuân theo động học bậc 1. 15 2.3.2. Khả năng chịu áp suất cao của vi sinh vật Nhìn chung, các vi khuẩn gram dương chịu được áp suất cao hơn vi khuẩn gram âm. Hình thái tế bào cũng ảnh hưởng đến tác động của áp suất, vi khuẩn hình que bị ảnh hưởng nhiều hơn hình cầu. Các tế bào ở pha phát triển dễ bị ảnhh hưởng hơn các tế bào ở pha ổn định. Bảng 2: Sự tiêu diệt vi sinh vật bởi áp suất Ít mẫn cảm Bào tử Gram dương Tế bào trong pha ổn định Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Listeria, Escherichia coli O157:H7 aw thấp Dễ mẫn cảm Tế bào sinh dưỡng Gram âm Tế bào trong pha phát triển Yersinia, Vibrio, Salmonella, parasites aw cao pH acid Nhiệt độ cao Có thuốc kháng sinh Nguồn: Masoliver và Grebol. Nhiệt độ có vai trò quan trong trong việc ức chế vi sinh vật bằng áp suất cao. Tại nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, sự ức chế sẽ thấp hơn so với các nhiệt độ khác. Độ chảy màng có thể bị phá vỡ dễ dàng hơn tại nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu. Khi các tế bào được làm sốc lạnh trước khi dùng áp suất cao, chúng có khả năng chịu áp tốt hơn. Điều này được giải thích là do sự duy trì độ chảy màng của tế bào ở nhiệt độ thấp. Sự thích nghi của màng ở nhiệt độ thấp được thực hiện bằng việc thay đổi độ phân nhánh và làm giảm chiều dài của các acid béo màng, vì thế làm cho vi sinh vật chịu được áp suất tốt hơn (Wemekamp-Kamphuis, Karatzas, Wouters, & Abee, 2002). Các protein tạo ra trong quá trình sốc lạnh có thể bảo vệ tế bào trước áp suất cao. Sự khác nhau về ảnh hưởng của áp suất lên các giống gây bệnh của một vài loài (Listeria monocytogenes; Staphylococcus aureus; Escherichia coli và Salmonella typhimurium) đã được báo cáo bởi một vài tác giả (Alpas, Kalchayanand, Bozoglu, Sikes, Dunne, & Ray, 1999; Simpson & Gilmour, 1997). 16 2.3.3. Ảnh hưởng của thực phẩm lên khả năng chịu áp suất cao của vi sinh vật Theo Archer (1996), 2 ảnh hưởng chính của thực phẩm lên độ an toàn vi sinh là: ảnh hưởng của thành phần thực phẩm trong suốt quá trình xử lý và ảnh hưởng sau xử lý trong suốt quá trình phục hồi của vi sinh vật. Khả năng chịu áp suất của vi sinh vật có thể bị tác động bởi nhiều yếu tố môi trường và bên trong, bản chất của môi trường là quan trọng nhất. Kết quả đạt được trong môi trường tổng hợp hoặc môi trường đệm không thể kết luận ngay tức khắc về tình trạng của thành phần thực phẩm. Như đã biết, thành phần thực phẩm có độ acid thấp như thịt (bảng 1) và sữa (Garcıa-Graells, Masschalck, và Michiels, 1999), có khuynh hướng bảo vệ vi khuẩn chống lại ảnh hưởng của áp suất cao so với môi trường đệm phosphate. Bảng 3: Sự giảm lượng vi khuẩn sau khi xử lý áp suất 500 MPa, 40oC trong 10 phút Giống Carnobacterium pisciola LMG2739 Enterococcus faecium CTC492 Escherichia coli CTC1007 Escherichia coli CTC1018 Escherichia coli CTC1023 Lactobacillus sakei CTC494 Lactobacillus sakei CTC746 Leuconostom carnosum CTC747 Listeria innocua CTC1014 Pediococcus acidilactici F Staphylococcus carnosus LHT2012 Nguồn: Garriga (chưa xuất bản) Dung dịch đệm Phosphate 5.79 6.79 7.23 5.53 5.78 7.01 6.33 6.33 7.92 5.60 4.75 Mẫu thịt 4.67 4.67 3.97 5.54 4.51 3.98 4.22 3.91 4.55 3.84 1.29 Khả năng chịu áp suất cao của vi khuẩn có thể được gia tăng đáng kể khi được xử lý trong môi trường giàu dinh dưỡng chứa các chất như carbohydrate, các chất này có thể bảo vệ vi khuẩn khỏi sự hư hại (Hoover et al., 1989). Sự có mặt của carbohydrate và protein trong thể nhũ tương thực phẩm làm gia tăng khả năng chịu áp suất của một vài vi sinh vật (Simpson và Gilmore, 1997). Sau khi so sánh sự ức chế vi khuẩn trong các sản phẩm thịt ở các hoạt tính nước khác nhau (bảng 2). Dựa trên bảng ta thấy mức độ chết của Staphylococcus aureus và vi khuẩn acid lactic 17 trong thịt đùi lợn khô là thấp nhất nếu so với thịt bò ướp và thịt đùi lợn nấu chín. Trong thực tế, khả năng chịu áp suất cao của vi sinh vật sẽ gia tăng khi giảm hoạt tính nước. Bảng 4: So sánh sự tiêu diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus và lactic acid bacteria (LAB) bằng 600 MPa, 31oC trong 6 phút Sản phẩm được đóng gói chân không Thịt bò ướp Jambon nấu chín Ban đầu dùng HHP Ban đầu dùng HHP Staph. aureus 3.62 0.95 3.70 2.58 Độ giảm 2.67 1.12 LAB 4.94 0.95 5.63 1.06 Độ giảm 3.99 4.57 Aw 0.985 0.987 Nguồn: Garriga et al Loài Jambon muối hun khói Ban đầu dùng HHP 2.74 2.19 0.55 4.23 2.65 1.58 0.890 Vi khuẩn dễ nhạy cảm với pH gần tối ưu sau khi xử lý nhiệt hoặc áp suất. vì thế, không chỉ pH thấp làm gia tăng sự ức chế trong quá trình xử lý mà còn ức chế sự phát triển tế bào bị tổn thương bởi nhiệt hoặc áp suất. Ngoài ảnh hưởng của pH thì không có ảnh hưởng đáng kể nào gây ra bởi các acid hữu cơ. Điều này có thể là do áp suất chỉ ảnh hưởng chủ yếu lên sự ion hóa và các acid hữu cơ là những chất ức chế đặc thù dưới dạng không hòa tan. Acid sorbic tác động giống như acid hữu cơ, nhưng nó cũng tác động đến màng tế bào của vi khuẩn, và tác động sẽ nhiều hơn khi kết hợp với áp suất (Mackey, Forestiere, và Isaacs, 1995). 2.3.4. Ảnh hưởng của loại thiết bị lên hiệu quả ức chế vi sinh vật của áp suất cao Các thiết bị áp suất và môi trường khác nhau có thể tạo ra những kết quả khác nhau về những vi khuẩn sống sót trong suốt giai đoạn bảo quản. Hơn nữa, sự khác nhau về thời gian, nhiệt độ, áp suất trong quá trình thực tế tại các vị trí khác nhau của thùng áp suất có thể dẫn đến một sự ức chế vi sinh vật không đồng nhất tại các vị trí khác nhau đó. Trái với quá trình thanh trùng hay tiệt trùng cổ điển, điểm tới hạn của áp suất cao là ở gần vỏ thiết bị, bởi vì sự truyền nhiệt xảy ra giữa vỏ thiết bị và khối chất lỏng, dẫn đến sự giảm nhiệt độ sản phẩm nằm ở gần vỏ thùng. Ảnh hưởng của thời gian tăng áp, tốc độ xả áp và nhiệt độ của quá trình vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Một tốc độ giảm áp chậm có thể làm giảm hiệu quả của quá trình và do đó việc giảm áp phải được thực hiện nhanh. 18 Sản phẩm thịt đùi lợn đã chín và bao gói được xử lý bằng áp suất tại 600MPa trong 6 phút tại 31oC trong 2 thiết bị khác nhau (A và B), số lượng vi khuẩn lactic trong suốt giai đoạn bảo quản lạnh đã được đánh giá (hình sau). Hình 4: Động học phát triển của vi khuẩn lactic trong jambon chín theo thời gian Trong mẫu của thiết bị A, số lượng vi sinh vật luôn nằm dưới hàm lượng phát hiện trong suốt thời gian lưu mẫu (120 ngày, 4oC). Các mẫu trong thiết bị B được giữ dưới điểm phát hiện trong 30 ngày bảo quản, khi kết thúc thời gian lưu trữ thì số lượng của chúng khoảng 108cfu/g. Trong một thí nghiệm tương tự (bảng 3) so sánh ảnh hưởng của áp suất lên các mẫu đùi lợn khô được cấy Listeria monocytogenes, và trong 2 thiết bị khác nhau (A và C) tại 600MPa, 31oC trong 6 phút. Bảng 5: So sánh sự tiêu diệt Listeria monocytogenes trong 2 thiết bị khác nhau Thời gian Thiết bị A Thiết bị C a Trước khi dùng HHP 2.71 2.75a b 1 ngày sau khi qua HHP 0/2 3/3b 30 ngày sau khi qua HHP 0/3b 3/3b 60 ngày sau khi qua HHP 0/3b 3/3b b 120 ngày sau khi qua HHP 0/3 2/3b Nguồn: Garriga et al. a log10 cfu g-1. b Số lượng mẫu có Listeria monocytogenes trong 10 g/số lượng mẫu thử ban đầu. 19 Qua thí nghiệm thấy rằng mẫu trong thiết bị A đã vô hoạt hoàn toàn Listeria monocytogenes (trong 10g) trong suốt giai đoạn tồn trữ (120 ngày). Trong khi ở thiết bị C thì mầm bệnh vẫn hiện diện trong suốt thời gian tồn trữ. Sự khác nhau này không phải là do mẫu vì các mẫu được lấy từ một nguồn và được chuẩn bị giống nhau nhưng chỉ khác thiết bị. Do đó có ý kiến cho rằng cần thiết lập các cách thức chuẩn bị mẫu cho các thiết bị áp suất trước khi kiểm tra thí nghiệm. Ảnh hưởng của áp suất cao đến các cấu tử hương. Như ta đã biết thịt có hương vị tương tự như huyết thanh hoặc huyết, khi có thay đổi về nhiệt để sản xuất sẽ ảnh hưởng đến hương vị (thường có ảnh hưởng tốt). Mùi vị của bắp thịt nấu chín thì phong phú hơn là các bắp thịt có mùi tự nhiên. Hầu hết các cấu tử tạo nên hương vị và "meaty flavor" bao gồm một lượng đường khử (thường là glucose), một nguồn axit amin và peptide, và hợp chất làm tăng hương vị (taste enhancer)(ví dụ như inosinic acid; Baines và Mlotkiewicz 1984). Nói chung có thể chấp nhận rằng hầu hết các thành phần này làm cho các mô cơ bắp tăng thời gian bảo quản, do phản ứng hóa học của các thành phần nhất định của cơ. Rất ít thông tin về các ảnh hưởng của áp suất cao đến các cấu tử tạo mùi và hương vị cho thịt. Trong báo cáo của Suzuki, Homma, Fukuda, Hirao, Uryu, và Ikeuchi (1994) cho thấy rằng số lượng của các peptide và axit amin dường như tăng lên khi ta xử lý áp suất cao đến 300 MPa (5 phút) đối với bắp thịt thỏ dorsi Longissimus, nhưng sự khác nhau giữa các lần xử lý bằng áp suất cao đã không ý nghĩa thống kê. Khi các cơ bắp được lưu trữ tại 2C trong 7 ngày, số lượng PPM (phenol reagent positive materials) tăng lên đáng kể (khoảng 140-150%) đã được khảo sát cả đối với các cơ bắp được xử lý lẫn không được xử lý bằng áp suất cao. Số lượng PPM từ các cơ bắp được xử lý áp suất cao thì cao hơn những từ các cơ bắp không được xử lý. Nhưng PPM lai giảm tại 400 MPa, so với 300 MPa, có thể là do một giảm nhẹ của hoạt động phân giải protein của enzyme nội sinh trong cơ bắp gây ra bởi áp suất cao , giả thiết này phù hợp những nghiên cứu của Ohmori, Shigehisa, Taji, và Hayashi (1992), Homma, Ikeuchi, và Suzuki (1994), và Jung, de Anton-Lamballerie, Taylor, và Ghouk (2000). Homma et al. (1994) mô tả những ảnh hưởng của việc sử dụng áp 20