Tài liệu Báo cáo bài tập lớn dược liệu bình vôi (stephania)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN HỮU CƠ BÁO CÁO BÀI TẬP LỚN DƯỢC LIỆU: BÌNH VÔI (Stephania) GVHD: Phan Nguyễn Quỳnh Anh Lớp: HC17HD Nhóm 3 NỘI DUNG I. SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VÔI...............................................................................6 1. Phân loại khoa học.....................................................................................................6 2. Đặc điểm thực vật......................................................................................................7 2.1. Stephania glabra (Roxb.) Miers............................................................................7 2.2. Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang..........................................................7 2.3. Stephania pierrei Diels..........................................................................................8 2.4. Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong........................................................8 2.5. Stephania cambodiana Gagnep.............................................................................8 2.6. Stephania dielsiana Y. C. Wu...............................................................................8 2.7. Stephania excentrica H. S. Lo...............................................................................9 2.8. Stephania cepharantha Hay..................................................................................9 2.9. Stephania sinica Diels...........................................................................................9 2.10. Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang.......................................................9 3. Phân bố, trồng hái và chế biến..................................................................................9 II. THÀNH PHẦN HÓA HỌC...................................................................................10 1. Rotundin................................................................................................................... 10 1.1. Công thức phân tử: C21H25NO4............................................................................10 1.2. Công thức cấu tạo:...............................................................................................10 1.3. Tính chất vật lý....................................................................................................11 1.4. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học................................................11 2. Roemerin.................................................................................................................. 12 2 2.1. Công thức phân tử: C18H17NO2............................................................................12 2.2. Công thức cấu tạo................................................................................................12 2.3. Tác dụng..............................................................................................................12 3. Cepharanthin...........................................................................................................12 3.1. Công thức phân tử: C37H38N2O6...........................................................................12 3.2. Công thức cấu tạo:...............................................................................................13 3.3. Tác dụng..............................................................................................................13 III. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VÔI..................13 1. Phương pháp chung chiết tách các hợp chất alkaloid........................................13 1.1. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực. 13 1.2. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn (ethanol, methanol )....................................................................................15 1.3. Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết........................................16 2. Tách chiết và tinh chế Rotundin từ củ Bình vôi.................................................18 IV. CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TRONG CÂY BÌNH VÔI................................21 1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm........................................21 2. Phương pháp chiết xuất Routundin trong công nghiệp.....................................22 V. 2.1. Chiết xuất Routundin thô.................................................................................22 2.2. Quy trình tinh chế routundin thô......................................................................23 PHƯƠNG PHÁP ĐINH TINH:............................................................................23 1. Định tính bằng thuốc thử.....................................................................................23 2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng.............................................................................24 3 VI. ĐINH LƯỢNG ROTUNDIN................................................................................24 1. Định lượng bằng phương pháp cân:....................................................................24 1.1. Nguyên tắc chung.............................................................................................24 1.2. Các bước tiến hành:..........................................................................................25 2. Định lượng alkaloid bằng phương pháp acid- base............................................26 2.1. Nguyên tắc chung.............................................................................................26 2.2. Các bước tiến hành...........................................................................................27 3. Phương pháp đo quang:.......................................................................................29 4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.................................................30 VII. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TINH KHÁNG KHUẨN CỦA ROEMERINE..................................................................................................................31 1. Nguyên liệu............................................................................................................31 2. Kiểm tra độ nhạy..................................................................................................31 3. Kết quả..................................................................................................................31 VIII. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ROUTUNDIN...33 IX. Ứng dụng...............................................................................................................34 X. TÀI LIỆU THAM KHẢO:.....................................................................................35 4 MỤC LỤC HÌNH Hình 1. Cây bình vôi...........................................................................................................6 Hình 2. Củ bình vôi khô......................................................................................................9 Hình 3. Công thức cấu tạo của Rotundin..........................................................................11 Hình 4. Công thức cấu tạo của Roemerin.........................................................................12 Hình 5. Công thức cấu tạo của Cepharanthin....................................................................13 Hình 6. Sơ đồ chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực......15 Hình 7. Sơ đồ quy trình chiết L- Tetrahydropalmatin từ củ bình vôi................................21 Hình 8. MIC của roemerine và kháng sinh trong môi trường nuôi cấy Mueller-Hinton. . .32 Hình 9. Sự ức chế phụ thuộc vào nồng độ của roemerine đến sự sinh trưởng của bốn chủng S. aureus................................................................................................................. 32 Hình 10. Trục quay Rotarod.............................................................................................33 Hình 11. Sơ đồ nghiên cứu thời gian bám của chuột trên trục quay Rotarod....................33 Hình 12. Viên Rotundin 30mg..........................................................................................34 5 I. SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VÔI 1. Phân loại khoa học Hình 1. Cây bình vôi Giới (regnum): Plantae (không phân hạng): Angiospermae (không phân hạng) Eudicots Bộ (ordo): Ranunculales Họ (familia): Menispermaceae Chi (genus): Stephania Lour. Chi Stephania có khoảng trên 45 loài. Một số loài công bố ở Việt Nam:       6 Stephania glabra (Roxb.) Miers Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang Stephania pierrei Diels Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong Stephania cambodiana Gagnep Stephania dielsiana Y. C. Wu       Stephania excentrica H. S. Lo Stephania cepharantha Hay Stephania sinica Diels Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang Stephania brachuandra Diels Stephania kwangsiensis H. S. Lo 2. Đặc điểm thực vật 2.1. Stephania glabra (Roxb.) Miers Thân leo phát triển từ củ hình tròn, củ thường nằm ở khe đá, vỏ củ có các nốt sần, đôi khi có những rãnh nhỏ ngang dọc. Nhựa từ thân và lá không mang màu. Lá đơn, mọc so le, mép lá nguyên, đôi khi hơi chia thùy phần ngọn lá. Toàn thân và lá không có lông. Cuống lá dài 6 – 25 cm, gốc hơi phình lên và cong. Phiến lá hình tim, ngọn lá thuôn nhọn, mặt dưới xanh lợt. Lá có 9 – 11 gân xếp tỏa tròn do cuống lá dính vào 1/3 phiến lá tính từ gốc lá. Cụm hoa đực dạng tán kép, cuống cụm hoa dài 3 – 12 cm, mỗi cuống cụm hoa gồm nhiều tán, mỗi tán lại có nhiều tán cấp II, mỗi cuống tán cấp II mang 4 tán cấp III, kết thúc gồm 3 hoa với cuống của mỗi hoa rất ngắn. Hoa đực gồm 6 đài rời xếp thành 3 vòng (3 + 3), kích thước gần như bằng nhau. Đài hình trứng hẹp, chiều dài 1,55 mm. Ba cánh hoa hình trứng màu xanh khi còn trong nụ và chuyển màu vàng khi hoa nở, gốc cánh hoa đôi khi có thể tuyến. Bộ nhị hàn liền thành 1 trụ với 6 bao phấn màu vàng xếp thành vòng tròn, trên 1 trụ do chỉ nhị hàn liền tạo thành cột ngắn 0,5 – 1 mm. Khi hoa nở, các bao phấn mở nắp ngang ra xung quanh. Hạt phấn nhỏ màu vàng. Cụm hoa dạng xim tán, cuống các bông hoa rất ngắn nên các bông hoa xếp xít vào nhau thành dạng đầu. Mỗi đầu gồm 20 – 70 bông hoa. Cuống cụm hoa dài 2 – 5 cm. Hoa cái bất đối xứng. Mỗi hoa có một lá đài hình elip dài 1 mm. Hai cánh hoa gần như tròn, đường kính 1 – 1,2 mm, 1 đài và 2 cánh hoa xếp lệch về một phía của hoa. Bầu hình trứng, núm nhụy chia 4 – 5 thùy dạng gai nhỏ và hầu như không có vòi nhụy. Quả hạch hình trứng ngược dài 5 – 6 mm, rộng 4 – 5 mm. Vỏ quả ngoài nhẵn, lúc non màu xanh, chuyển sang màu vàng rồi đỏ sẫm khi chín. Hạt hình trứng ngược, cụt một đầu, vỏ hạch cứng chia nhiều vạng (17 – 20 vạch). Giá noãn có lỗ thủng ở giữa. Mùa hoa: tháng 2 – 4. Mùa quả: tháng 5 – 6. 2.2. Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang 7 Thân leo dài 2 – 3 m, củ tròn, bề mặt vỏ củ có nhiều nốt sần. Toàn cây không có lông, lá có cuống, phiến lá dạng tam giác, chop lá nhọn, gốc lá thay đổi từ từ đến gần bằng ít khi hơi lõm nông và rộng. Gân chính 9 – 10 chiếc, xếp dạng chân vịt, hệ gân phụ dạng mạng rõ. Cụm hoa đực xim tán kép mọc ở nách lá, cuống cụm hoa dạng sợi nhỏ dài 1 – 3,5 cm. Đỉnh cuống cụm hoa có 6 – 7 cuống tán giả (xim tán) dài 0,6 – 0,8 cm. Gốc mỗi cuống tán giả có một lá bắc hình mác nhỏ dạng vạch. Mỗi tán lá giả có 5 – 6 xim nhỏ. Mỗi xim nhỏ có 5 – 6 hoa. Hoa đực nhỏ, cuống ngắn 0,5 mm, có 6 lá đài xếp 2 vòng, 3 lá đài vòng tronh hình thìa dài khoảng 1,5 mm, rộng khoảng 0,5 mm, 3 cánh hoa hình quạt gần tròn, cong lõm đều, cao khoảng 0,8 – 1 mm, rộng 1 – 1,5 mm, phía trong gốc cánh hoa có 2 tuyến. Nhị đính thành cột ngắn, bao phấn dính liền thành đĩa, nứt ngang. Cụm hoa cái gần dạng đầu có cuống dạng sợi nhỏ dài 1 – 1,5 cm. Đỉnh cuống cụm hoa có 6 – 7 xim nhỏ. Ở gốc mỗi xim nhỏ có một phiến lá bắc dạng gai nhỏ, mềm. Mỗi xim nhỏ có 6 hoa. Hoa cái nhỏ, gần như không cuống, có một lá đài hình trứng ngược cao 1 – 1,2 mm, rộng 0,5 – 0,7 mm. Hai cánh hoa gần tròn, cong dạng vỏ hến, đường kính 1,5 mm. Bầu hình trứng, đường kính 4 – 5 mm, núm nhụy có 5 thùy dạng gai nhỏ mềm ngả ra phía ngoài. Chùm quả nhỏ, ít quả. Quả hạch hình trứng ngược, khi chín màu hồng. Vỏ quả trong hình trứng ngược, dài 5,5 – 6,5 mm, rộng 5,5 mm. Trên lưng có hai hàng vân ngang dạng trụ. Hai đầu trụ tù tròn, tạo thành 4 hàng vân hạt trên lưng vỏ quả trong. Giá noãn có lỗ. Mùa hoa: tháng 3 – 5. Mùa quả: tháng 6 – 7. 2.3. Stephania pierrei Diels Ngọn có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác. Hoa đực không có cánh hoa. 2.4. Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong Cành non và cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt. 2.5. Stephania cambodiana Gagnep Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác. 2.6. Stephania dielsiana Y. C. Wu 8 Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau có màu tím hay tím hồng. 2.7. Stephania excentrica H. S. Lo Cuống lá rất dài, có khi đến 14 cm. Giá noãn có lỗ lệch một bên. 2.8. Stephania cepharantha Hay Giá noãn không có lỗ. 2.9. Stephania sinica Diels Giá noãn không có lỗ 2.10. Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang. Lá có phiến tam giác, cuống lá bằng hoặc dài hơn phiến lá. 3. Phân bố, trồng hái và chế biến Các loài bình vôi ở nước ta phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Thường gặp ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Hòa Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu… Một số loài thương chỉ gặp ở vùng núi đất và biển như Stephania pierrei Diels, Stephania brachuandra Diels, Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong. Riêng loài Stephania pierrei Diels tập trung chủ yếu ở các tỉnh ven biển Bình Định, Phú Yên, Ninh Thuận. Hiện nay ta đang thu hái củ bình vôi chủ yếu từ nguồn mọc hoang. Khi thu về đem cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô hoặc đem chiết lấy 1tetrahydropalmatin. Có thể trồng bằng hạt. Thu hái quả chín, sấy lấy hạt đem gieo. Ngoài ươm cây giống bằng hạt có thể lấy các đoạn thân cây hoặc cắt phần đầu của củ đem trồng. 9 Hình 2. Củ bình vôi khô II. THÀNH PHẦN HÓA HỌC Trong củ bình vôi có alkaloid. Các loài cây bình vôi ta đang khai thác có alkaloid chính là l – tetrahydropalmatin. Hàm lượng alkaloid toàn phần cũng như l – tetrahydropalmatin (rotundin) thay đổi tùy theo loài và vùng thu hái. Theo Bùi Thị Hằng, hàm lượng l – tetrahydropalmatin đạt 3,55% ở loài Stephania brachuandra Diels (thu hái ở Hoàng Liên Sơn), 1,31% ở loài Stephania kwangsiensis H. S. Lo (thu hái ở Quảng Ninh), 0,72% ở loài Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong (thu hái ở Thanh Hóa), 0,62% ở loài Stephania cambodiana Gagnep (thu hái ở Lâm Đồng), 0,29% ở loài Stephania cepharantha Hay (thu hái ở Hà Sơn Bình), 0,21% ở loài Stephania pierrei Diels (thu hái ở Tây Nguyên). Theo Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ, loài Stephania glabra (Roxb.) Miers thu hái ở Ninh Bình có 2,96% alkaloid toàn phần và 0,59% l – tetrahydropalmatin; loài Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang thu hái ở Lạng Sơn có 4,41% alkaloid toàn phần và 3,06% l – tetrahydropalmatin. Năm 1941, Bùi Đình Sang chiết từ củ bình vôi một hỗn hợp alkaloid, trong đó chủ yếu là l – tetrahydropalmatin gọi à rotundin. Năm 1964, Ngô Văn Thu chiết được một alkaloid khác từ củ bình vôi gọi tên là alkaloid A. Đến năm 1971, Nuhn và Ngô Văn Thu xác định alkaloid A là roemerin. Năm 1992, Ngô Thị Tâm đã chiết được cepharanthin từ loài Stephania pierrei mọc ở Nghĩa Bình. Nam 1997 – 1999, Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ đã phân lập được l – tetrahydropalmatin, roemerin, palmatin từ loài Stephania glabra mọc ở Ninh Bình và l – tetrahydropalmatin, stepharin từ củ loài Stephania kuinanensis mọc ở Lạng sơn; cycleanin từ loài bình vôi thu hái ở Quảng Ninh. Năm 1999, Nguyễn Thị Hoài An đã phân lập được 3 alkaloid từ củ bình vôi mọc ở Mộc Châu (Sơn La) là 9,10 – hydroxy, 2,3 – dimethoxy tetrahydro – protoberberine, stepholidin, tetrahydrocolumbamin. 10 Ngoài alkaloid, trong củ bình vôi còn có tinh bột, đường và acid hữu cơ. 1. Rotundin 1.1. Công thức phân tử: C21H25NO4. 1.2. Công thức cấu tạo: Hình 3. Công thức cấu tạo của Rotundin Danh pháp IUPAC: (13aS)-2,3,9,10-tetramethoxy-6,8,13,13a-tetrahydro-5Hisoquinolino[2,1-b] isoquinoline. 1.3. Tính chất vật lý Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, không mùi không vị. Không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, ether, chloroform... Kết tinh trong cồn có điểm chảy: 141 - 144°C. 1.4. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học Năm 1941, DS. Trần Xuân Thuyết cùng với Giáo Sư, Tiến Sĩ Đỗ Tất Lợi và P.Bonnet đã phát hiện ra hỗ hợp alkaloid của củ bình vôi, đặt tên là rotundin – có tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn, đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết được rotundin (1944: Nhật; 1957: CHDC Đức; 1960: Liên Xô; 1962: Trung Quốc…) Theo Ngô Đại Quang (1999) tác dụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc. Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến 11 chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hóa chất. Phan Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh Dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm routindin liều cao trên chuột (150 mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5 g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc – 1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD 50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an toàn là cao của chế phẩm. Rotundin ít độc. Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1 – 2 ngày. Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30 mg và 60 mg, rotundin còn ở dạng tiêm là rotundin sulfat, mỗi ống 2 ml (60 mg) làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều thị loét dạ dày hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh, hen thắt phế quảng. 2. Roemerin 2.1. Công thức phân tử: C18H17NO2. 2.2. Công thức cấu tạo Hình 4. Công thức cấu tạo của Roemerin 2.3. Tác dụng 12 Theo Fakhrutdino Sf (1962), roemerin gây tê niêm mạc và phong bế. Đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp, với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trương. Roemerin đối kháng với tác dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine. Đối với hệ thần kinh trung ương, với liều thấp, roemerin có tác dụng an thần, gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến tử vong. Roemerin còn có tác dụng giãn mạch, hạ huyết áp. Liều LD 50 trên chuột là 0,125 g/kg tương đương với liều độc của cocain hydroclorid. 3. Cepharanthin 3.1. Công thức phân tử: C37H38N2O6. 3.2. Công thức cấu tạo: Hình 5. Công thức cấu tạo của Cepharanthin 3.3. Tác dụng Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada và Masao Tomita (1984), cepharanthin có tác dụng giãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuần hoàn, có tác dụng tăng cường sinh sản kháng thể nên có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ung thư, sự biến động số lượng hồng cầu hoặc sắc tố máu hầu như không có thay đổi khi dùng cepharanthin. Tác dụng phụ do uống cepharanthin liều cao không thấy xuất hiện. III. 1. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VÔI Phương pháp chung chiết tách các hợp chất alkaloid Theo bộ môn Công nghiệp Dược (2001), Dựa vào các tính chất chung của alkaloid người ta đưa ra 2 phương pháp chung để chiết tách alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật, bao gồm: 13 - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực. - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn (ethanol, methanol ). 1.1. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực  Ưu điểm: Hiệu suất chiết các hoạt chất từ dược liệu cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế loại các tạp đi kèm theo. Các dung môi hữu cơ không phân cực thường là các dung môi có khả năng chiết chọn lọc đối với các alkaloid ở dạng base.  Nhược điểm: Dung môi hữu cơ thường là các dung môi đắt tiền. Khi sử dụng các dung môi này để chiết đòi hỏi các thiết bị phức tạp . Phương pháp này bao gồm các giai đoạn sau:  Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu Để tăng khả năng chiết ta phải chia nhỏ dược liệu trước khi chiết nhằm làm tăng bề mặt tiếp xúc giữ hai pha rắn và lỏng đẩy nhanh quá trình khuếch tán. Tuy nhiên nếu ta chia nhỏ dược liệu quá thì dung môi sẽ khó chuyển động qua khối dược liệu và ta rất khó thu được dịch chiết, do đó tùy thuộc vào từng loại dược liệu ta có thể xay nhỏ khác nhau vừa để đảm bảo đẩy nhanh quá trình khuếch tán vừa dể dàng trong rút dịch chiết. Kiềm hóa và làm trương nở nguyên liệu bằng dung dịch kiềm (thường dùng Ca(OH) 2, NH4OH, Na2CO3…) để chuyển alkaloid trong nguyên liệu sang dạng base.  Giai đoạn 2: Chiết Sử dụng các dung môi chiết là các dung môi hữu cơ không phân cực (các dung môi không hòa lẫn với nước).  Giai đoạn 3: Tinh chế Tinh chế thu các alkaloid bằng cách chuyển dạng muối với acid và chuyển dạng base bằng kiềm và phân chia chúng giữa hai pha dung môi hữu cơ không phân cực và nước để loại các tạp chất không phải alkaloid. 14 Hình 6. Sơ đồ chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực  Ứng dụng: Hiện nay hầu hết các alkaloid được sản xuất trong nước cũng như trên thế giới sữ dụng phương pháp này. Mặt khác phương pháp này khi sử dụng chiết các dược liệu có nhiều chất nhầy có độ trương nở cao, tránh được sự trương nở quá mức của dược liệu và sự hòa tan chất nhầy vào dung môi gây khó khăn cho rút dịch chiết và tinh chế. 1.2. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn (ethanol, methanol )  Ưu điểm: Dung môi rẻ tiền, dể kiếm. Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít.  Nhược điểm: Dịch chiết rút ra lẫn nhiều tạp chất, khó tinh chế do đó mất mát nhiều trong khâu tinh chế làm cho hiệu suất chiết thấp. Đối với các vật liệu chứa nhiều chất nhầy, việc sử dụng nước làm dung môi chiết gặp khó khăn trong khâu rút chiết. 15 Phương pháp tiến hành bao gồm các giai đoạn sau:  Chuẩn bị nguyên liệu Nguyên liệu thực vật được xay thô, sau đó được làm ẩm cho trương nở bằng nước.  Tiến hành chiết Sử dụng dung môi là nước chiết alkaloid dưới dạng muối tự nhiên hoặc muối với acid vô cơ, hoặc dung môi là cồn ethylic hoặc methylic để chiết alkaloid cả dưới dạng muối và base.  Tinh chế: Trong trường hợp chiết bằng nước, alkaloid base được giải phóng từ dịch chiết bằng cách thêm kiềm sau đó được chiết bằng một dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước. Tiếp tục tinh chế bằng cách bốc hơi dung môi và kết tinh lại trong dung môi hữu cơ hoặc chuyển sang dạng kết tinh lại. Trong trường hợp chiết bằng cồn, dịch chiết cồn được cô đặc , thêm acid và loại các tạp chất bằng cách chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực, thêm kiềm chuyển alkaloid sang dạng base rồi chiết alkaloid bằng một dung môi hữu cơ. Bốc hơi dung môi hữu cơ rồi kết tinh alkaloid hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. Đối với các alkaloid khó tách có thể sử dụng phương pháp sắc ký hấp phụ hoặc phương pháp trao đổi ion. 1.3. Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết  Thăng hoa Thăng hoa có thể thực hiện trực tiếp trên dược liệu như tách caffein từ chè hoặc có thể sử dụng để tách và tinh chế các hợp chất có trong dịch chiết thô. Các thiết bị hiện đại cho phép sử dụng áp suất giảm và kiểm soát được nhiệt độ trong quá trình thăng hoa.  Cất Cất phân đoạn thường được sử dụng để tách các hợp phần trong một hỗn hợp các chất dễ bay hơi. Trong hóa thực vật nó được sử dụng rộng rãi trong phân lập các hợp phần của tinh dầu. Tuy nhiên khó có thể sử dụng phương pháp này để tách các hợp phần phụ trong hỗn hợp tinh dầu dưới dạng tinh khiết. Để phân lập tinh dầu và acid hydrocyanic và một số alcaloid thể lỏng như spartein, nicotin từ thực vật thường sử dụng phương pháp cắt lôi cuốn hơi nước. 16  Giải phóng phân đoạn Một số nhóm các hợp chất tự nhiên có thể giải phóng phân đoạn từ một hỗn hợp. Có thể lấy ví dụ một hỗn hợp muối alcaloid trong dung dịch nước nếu thêm từ từ vừa đủ từng phần kiềm lúc đầu các base yếu nhất sẽ được giải phóng ra dưới dạng base tự do. Tăng dần độ kiềm lên sẽ lần lượt giải phóng các base có tính kiềm mạnh dần. Mỗi lần thêm kiềm vào ta lắc hỗn hợp với dung môi hữu cơ ta sẽ thu được một loạt các phân đoạn base. Có thể dùng phương pháp này để tách các acid hữu cơ có thể hoà tan trong dung môi không trộn lẫn nước. Nếu ta có một hỗn hợp muối các acid hữu cơ ta có thể giải phóng phân đoạn các acid đó bằng cách thêm dần các acid vô cơ.  Kết tinh phân đoạn Đây là một phương pháp phân lập đã được sử dụng nhiều trước đây và hiện nay vẫn có giá trị trong việc tách các hỗn hợp khó tách. Phương pháp này sử dụng độ tan khác nhau của một hợp phần của một hỗn hợp cần tách trong một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhất định. Người ta thường sử dụng các dẫn xuất của các hợp phần cần tách để thay đổi độ tan của nó (ví dụ muối pirat của các alkaloid, asazon của đường).  Sắc ký hấp phụ Trong các trường hợp khác nhau tách và phân lập các hợp chất từ thực vật, kỹ thuật sắc ký là một trong những kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất. Để tẩy màu và làm trong dung dịch ta sử dụng than hoạt, các tạp chất màu sẽ bị hấp phụ bởi than hoạt và sau khi lọc ta sẽ thu được một dung dịch không màu. Tất cả các chất rắn khi được phân chia nhỏ đều có khả năng hấp phụ ít nhiều các chất khác trên bề mặt của nó và ngược lại tất cả các chất đều có thể bị hấp phụ từ dung dịch ở các mức độ khác nhau. Hiện tượng hấp phụ chọn lọc là nguyên lý cơ bản của sắc ký. Quá trình cơ bản của sắc ký có thể được mô tả dựa trên thí nghiệm của Tswett như sau: Dịch chiết ether dầu hoả (40-60°C) của lá cây tươi được cho qua một cột thuỷ tinh thẳng đứng trong có chứa bột Calci carbonat. Các sắc tố trong cột bị hấp phụ vào chất nhồi cột và sẽ tách trong quá trình chảy qua cột. Các sắc tố hấp phụ mạnh hơn như xanthophyl và clorophyl sẽ tập trung thành các băng màu đặc trưng rõ rệt gần đỉnh cột trong khi các sắc tố có độ hấp phụ kém hơn như các caroten tập trung ở các băng thấp hơn phía dưới. Thường việc tách hoàn toàn các thành phần thành các băng rõ rệt không xảy ra ở giai đoạn hấp phụ đầu tiên mà trong giai đoạn này các băng còn tập trung gần nhau ở phần đỉnh cột. Tiếp tục triển khai cột bằng dung môi tinh khiết, các chất bị hấp phụ sẽ di chuyển dần xuống phía dưới và các băng được tách ra xa nhau hơn. Trong nhiều trường hợp quá trình được tiến hành hiệu quả hơn nhờ sử dụng dung môi triển khai khác mà các chất ít bị hấp phụ từ nó hơn. Ví dụ nếu ether dầu hỏa có chứa một ít alcol được cho thẳng 17 qua cột trong thí nghiệm được mô tả ở trên thì các băng sẽ tách ra xa nhau hơn và sẽ chạy qua cột nhanh hơn so với khi chỉ dùng ether - dầu hỏa để triển khai. Khi ta cho dung môi tiếp tục chạy qua cột, băng thấp hơn trong cột sẽ chạy tới đáy và biến mất, sắc tố sẽ thu được ở dịch chảy ra ở đáy cột. Quá trình này gọi là quá trình giải hấp phụ (elution ), dung dịch đó được gọi là dung dịch giải hấp phụ (eluate ). Các chất dễ dàng hấp phụ từ các dung môi không phân cực như ether dầu hỏa, benzen thường dễ dàng giải hấp phụ bằng các dung môi phân cực như alcol, nước, piridin... Một vài các hợp chất bị hấp phụ ở pH nhất định sẽ được giải hấp phụ ở một pH khác. Các chất khác nhau thường được dùng làm chất hấp phụ là: nhôm oxyd, silicagel, magnesi oxyd, kaolin, calci carbonat, than hoạt và các loại đường. Sucrose ở dạng bột được Tswett sử dụng để tách các chlorophyl A và B. Khi ta tiến hành sắc ký các chất không màu, các băng của các chất bị hấp phụ không thể trông thấy được. Trong một số trường hợp có thể sử dụng đèn tử ngoại để xác định các vùng phát quang dưới ánh sáng tử ngoại hoặc có thể chia sắc phổ ra nhiều phần nhỏ riêng biệt và giải hấp phụ hoặc chiết rừng phần nhỏ đó riêng rẽ. Đôi khi người ta thu dịch giải hấp phụ của toàn bộ cột thành các phần riêng biệt rồi tiến hành phân tích riêng các phần riêng biệt đó. Dụng cụ để tiến hành sắc ký hấp phụ rất đơn giản chỉ gồm một cột bảng thủy tinh trong nhồi chất hấp phụ. Sắc ký hấp phụ thương được sử dụng trong phân lập và tinh chế các Vitamin, hormon, một số các alcaloid, các glycosid tim, antraquinon... 2. Tách chiết và tinh chế Rotundin từ củ Bình vôi Theo Ngô Đại Quang (1999) quy trình chiết tách được tiến hành như sau:  Chiết tách sản phẩm thô: Trước hết củ bình vôi được rửa sạch cạo vỏ ngoài rồi xát nhỏ thành miếng với kích thước thích hợp rồi ngâm ở bể chứa dung dịch chiết xuất gồm nước và các chất đệm vô cơ ở pH thích hợp. Các hoạt chất alcaloit sẽ hoà tan và được chiết ra khỏi bã. Quá trình chiết được thực hiện 2-3 lần rồi bã được ép kiệt. Dịch chiết để lắng, lọc và trung hoà ở ph thích hợp để thu kết tủa. Kết tủa được lọc, phơi và sấy. Sản phẩm thô sau khi sấy có hàm lượng rotundin vào khoảng 27- 32%.  Quá trình tinh chế: 18 Sản phẩm thô sẽ được tinh chế thành dạng dược dụng có hàm lượng rotundin > 98,2% (theo Dược điển Trung Quốc). Quá trình tinh chế được tiến hành theo 3 giai đoạn như sau:  Giai đoạn 1: Sản phẩm thô được nghiền nhỏ, hoà tan trong dung dịch đệm và kết tinh ở môi trường pH = 5. Trong giai đoạn này phần lớn những sản phẩm phụ và tạp chất như muối vô cơ, xenluloza, tinh bột được loại bỏ. Tuy nhiên bán sản phẩm (dạng bột) vẫn có màu sẫm, nhiệt độ nóng chảy chưa ổn định và hàm lượng rotundin chỉ đạt khoảng 80%.  Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này bán sản phẩm được hoà tan trong một hỗn hợp dung môi. Những dung môi đó hoà tan chủ yếu các alcaloit mà không hoà tan được các muối vô cơ cũng như các hợp chất hữu cơ mạch dài như xenluloza, tinh bột, đường khử. Để sản phẩm không bị phân huỷ và biến màu nên ở giai đoạn này chỉ gia nhiệt nhẹ. Dung dịch được lọc nóng và kết tinh chậm ở nhiệt độ thấp trong thời gian 10-12 giờ. Tinh thể được lọc và rửa nhiều lần bằng hỗn hợp dung môi nói trên (đã làm lạnh) đến khi nhận được bán thành phẩm có hàm lượng rotundin tới 90%.  Giai đoạn 3: Tinh chế và tẩy màu. Bán thành phẩm có hàm lượng rotundin 90% được hoà tan từ từ trong một hỗn hợp dung môi và được điều chỉnh ở nồng độ thích hợp nhất. Nếu nồng độ quá cao thì quá trình kết tinh diễn ra quá nhanh làm thành phẩm không sạch; nếu nồng độ thấp quá thì lượng hao hụt sẽ lớn, hiệu suất kết tinh thấp. Sau đó chất tẩy và chất ức chế oxy hoá được cho thêm, đồng thời khuấy đều trong vòng 30-45 phút. Sau đó để yên đế kết tinh. Sản phẩm được tạo ra dưới dạng muối sunfat hoặc nitrat hay clorua tuỳ theo mục đích điều chế. Tiếp đó là quá trình lọc hút chân không và kết tinh lại ở nhiệt độ thấp. Thành phẩm thu được là những tinh thể hình kim, màu trắng ngà. Quá trình tinh chế lại đã nâng hàm lượng rotundin từ 90% lên 98,2%, hiệu suất tinh chế đạt 88,2%. Đây là giai đoạn rất quan trọng, cần xác định tỷ lệ dung môi hoà tan thật thích hợp thì mới thu được thành phẩm có chất lượng tết và hiệu suất tinh chế cao. Theo Trần Trọng Biên, Nguyễn Quốc Huy, Nguyễn Văn Hân trong tạp chí dược học số 488 tháng 12/2016 trang 26-30 Củ của các loài có tên chung là bình vôi (Stephania spp.) từ lâu đã được sử dụng làm nguyên liệu để chiết xuất L-tetrahydropalmatin (C21H25O4N) hay rotundin - một alcaloid có tác dụng an thần, gây ngủ, giảm đau. Tuy nhiên hàm lượng rotundin trong các loài bình vôi rất khác nhau. Trong đó, loài Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sapa được xác định có hàm lượng rotundin trong củ cao (có thể đạt 3,69 %), thích hợp để chiết xuất rotundin. Các phương pháp thông thường để chiết xuất rotundin từ củ bình vôi gồm: chiết rotundin dạng base bằng dung môi hữu cơ như dầu hỏa, cloroform, ethanol, n-hexan, dicloromethan…; chiết rotundin dạng muối bằng nước, nước acid… Nhìn chung các phương pháp trên đều cho sản phẩm rotundin có hàm lượng cao (> 95 %). Tuy nhiên, nhiều quy trình tiến hành phức tạp, sản phẩm kém ổn định, hiệu suất quy trình thấp hoặc 19 không được công bố cụ thể. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là cải tiến phương pháp chiết xuất, tinh chế rotundin từ củ bình vôi cho hiệu suất cao và ổn định. Phương pháp nghiên cứu: - Định lượng: Phương pháp HPLC. - Chiết xuất: Phương pháp ngâm lạnh. - Tinh chế: sử dụng ethanol 96%, hỗn hợp aceton – nước hoặc ethyl acetat. - Đánh giá chất lượng sản phẩm: cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, hàm lượng rotundin, độ tinh khiết HPLC.  Kết quả: Đã khảo sát, so sánh 3 phương pháp tinh chế rotundin từ tủa rotundin thô gồm phương pháp tẩy màu và kết tinh trong ethanol 96 %, phương pháp kết tủa trong hỗn hợp aceton – nước và phương pháp sử dụng ethyl acetat, trong đó phương pháp sử dụng ethyl acetat cho hiệu suất tốt nhất. Trên cơ sở các kết quả đã công bố trước đó, nghiên cứu đã cải tiến giai đoạn tinh chế rotundin sử dụng dung môi ethyl acetat. Kết quả từ 5 kg nguyên liệu tươi (hàm lượng rotundin 1,02 %) thu được 48,13 g rotundin tinh khiết (hàm lượng 99,42 %). Hiệu suất toàn quá trình đạt 93,8 % tính theo hàm lượng rotundin có trong nguyên liệu. Đây là tiền đề cho những nghiên cứu ở quy mô lớn hơn. Theo PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị, sách Kĩ thuật sản xuất dược phẩm tập I, trang 232-233:  Chiết xuất L- tetrapalmatin dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ - Alcaloid toàn phần: Củ bình vôi phơi khô tán nhỏ, kiềm hóa với amoniac 10%. Chiết với cloroform. Gạn lấy dịch chiết rồi cô đặc và thêm vào dịch đã cô H2SO4 10% sẽ có muối sulfat của alcaloid. Lại kiềm hóa sulfat alcaloid bằng amoniac pH=8 rồi chiết alcaloid base bằng cloroform. Cô chân không ta được alcaloid toàn phần. - Tách L - tetrahydropalmatin: Alcaloid ở trên hòa tan vào H2SO4 1%. - Thêm Na2CO3 đến pH=6. L tetrahydropalmatin sẽ tủa xuống, lọc lấy tủa. Nước cái thêm Na2CO3 đến pH=8 sẽ thu được tủa một số các alcaloid khác.  Chiết xuất L-tetrahydropalmatin từ củ bình vôi dưới dạng muối bằng nước Củ bình vôi tươi được bào thành lát mỏng chiết bang dung dịch acid sulfuric 0,3%. Dịch chiết rút ra để lắng trong. Gạn phần trong. Phần dịch đục được lọc qua vải. Dịch thu được sau khi gạn, lọc đưoc tủa alcaloid base bằng dung dịch Ca(OH),. Lọc lấy tủa alcaloid toàn phần. Tủa này được sấy cho khô. Tủa alcaloid toàn phần khó thu được bằng phương pháp này có chứa từ 10% đến 30% Ltetrahydropalmatin. 20