Tài liệu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT / --------------------------------------- NGUYỄN THỊ HIỆP ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI THÀNH THỤC VÀ NỒNG ĐỘ TINH TỚI KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH TIỀN NHÂN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI LỢN THU TINH ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Động vật học Hà Nội - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện, các số liệu trong luận văn là trung thực và chính xác. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn đầy đủ, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiệp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN! Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Linh, chủ nhiệm đề tài, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Bùi Xuân Nguyên, TS. Nguyễn Thị Ƣớc, những ngƣời thầy đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn tôi trong công việc chuyên môn cũng nhƣ những kinh nghiệm trong cuộc sống. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ Phôi đặc biệt là TS. Nguyễn Văn Hạnh, Ths. Nguyễn Thị Hồng, Ths. Nguyễn Thị Nhung, CN. Nguyễn Văn Lâm đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ và góp ý để tôi hoàn thành luận văn này. Luận văn đƣợc hoàn thành với sự tài trợ của Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ quốc gia trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng của giọt noãn bào chất đơn tính lên sự hoạt hóa trứng và sự phát triển của phôi” mã số 106.12-2012.93 do TS. Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm. Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện về thủ tục hành chính để tôi bảo vệ luận văn này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, những ngƣời đã luôn sát cánh, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014 Học viên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Nguyễn Thị Hiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... .v DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ …vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... ..viii PHẦN I. MỞ ĐẦU................................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề..................................................................................................... 1 1.2 Mục đích....................................................................................................... 2 1.3 Ý nghĩa ......................................................................................................... 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4 2.1 Sự hình thành và phát triển tế bào trứng lợn ............................................ 4 2.1.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng.................................................. 4 2.1.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng ......................................... 6 2.1.3 Sự thành thục của tế bào trứng .............................................................. 9 2.2 Thụ tinh ống nghiệm ở lợn ......................................................................... 10 2.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm và các giai đoạn của quá trình thụ tinh ....................................................................................................................... 10 2.2.2 Sự thành thục tế bào trứng lợn trong ống nghiệm ............................... 13 2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn ............. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.3 Tình hình nghiên cứu nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm (IVM/IVF) ở Việt Nam .......................................................................................................... 26 PHẦN III. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 29 3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu.............................................................. 29 3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .............................................. 29 3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi ............................................ 29 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................ 32 3.4.1 Chuẩn bị môi trƣờng thu và rửa buồng trứng ...................................... 32 3.4.2 Phƣơng pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng..................... 33 3.4.4 Phƣơng pháp phân loại chất lƣợng trứng............................................. 35 3.4.5 Phƣơng pháp đánh giá thành thục sau khi nuôi ................................... 37 3.4.6 Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF).......... 38 3.4.7. Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng phôi nang ..................................... 42 3.4.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 43 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 43 4.1 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới sự thành thục của tế bào trứng lợn... 44 4.2 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng lợn. ... 48 4.3 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm ......................................................................................... 50 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới kết quả thụ tinh trong ống nghiệm ở lợn 54 4.5 Ảnh hƣởng của nồng độ tinh sự phát triển và chất lƣợng của phôi lợn.... 63 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 70 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 70 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 71 DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn Bảng 4.2 . Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng hình thành tiền nhân đực của tế bào trứng lợn. Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với trứng loại A Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với trứng loại B1 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với trứng loại B2 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B1 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 43 47 49 53 56 57 61 62 63 http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 2.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng lợn 5 Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng 6 Hình 3. 1. Buồng trứng lợn lai kinh tế 33 Hình 3.2 Trứng lợn loại A, B1, B2 35 Hình 4.1 Trứng lợn ở giai đoạn GV (a) và giai đoạn MI. 44 Hình 4.2 Trứng lợn ở giai đoạn thành thục 45 Hình 4.3-a Tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng, 4.3-b Tế bào trứng 55 lợn đa thụ tinh Hình 4.4 Phôi ở giai đoạn 4 tế bào (a) và giai đoạn phôi dâu (b) 65 Hình 4.4. Phôi nang (Blastocyst) 66 Hình 4.5 Số tế bào/phôi nang 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BIỂU ĐỒ Tên biểu đồ Trang Biểu đồ 4.1. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng xâm nhập 58 của tinh trùng Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành 59 tiền nhân Biểu đồ 4. 3. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng thụ tinh 60 bình thƣờng của tế bào trứng lợn. Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng phân chia 64 của tế bào trứng lợn Biểu đồ 4.5. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành 65 phôi nang Biểu đồ 4.6. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới chất lƣợng phôi nang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 66 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt DMSO Tiếng Anh Dimethyl Sulfoxide Equine Chorionic ECG Gonadotropin Nghĩa tiếng Việt Chất bảo quản lạnh Gonadotropin nhau thai ngựa Yếu tố thúc đẩy tăng trƣởng EGF Epidermal growth factor FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bê FM Fertilization medium Môi trƣờng thụ tinh FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GSH Glutathione GV Germinal vesicle Giai đoạn bóng mầm GVBD Germinal Vesicle Break Down Giai đoạn tan bóng mầm HCG Human Chorionic Gonadotropin biểu mô Gonadotropin nhau thai ngƣời IVC In vitro Culture Nuôi phôi IVF In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm IVM In vitro muaturation Thành thục ống nghiệm LH Luteinsing Stimulating hormone Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN Hormone thể vàng http://www.lrc.tnu.edu.vn MI Metaphase I Trung kỳ I MII Metaphase II Trung kỳ II MPN Male pronuclear Tiền nhân đực NCSU 23 NCSU 37 North Carolina State University 23 North california state university 37 NST Môi trƣờng nuôi trứng, phôi Môi trƣờng nuôi trứng, phôi Nhiễm sắc thể pFF Porcine follicle fluid PMSG TCM Pregnant mare’s serum gonadotropin Tissue Culture Medium Dịch nang trứng lợn Huyết thanh ngựa chửa Môi trƣờng nuôi cấy TN Thí nghiệm tt/ml Tinh trùng/ml TTON Thụ tinh ống nghiệm vcs Và cộng sự ZP Zona pellucide Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN Màng trong suốt http://www.lrc.tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cuộc cách mạng khoa học công nghệ trong sinh học sinh sản mở đầu với các công nghệ trong lĩnh vực thụ tinh nhân tạo và cấy chuyển phôi trong suốt thế kỷ 20, đƣợc tiếp tục với nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM), thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF), kích hoạt sinh sản vô tính (trinh sản – parthenogenetic), nuôi phôi ống nghiệm và nhân bản các động vật bản địa bằng cách chuyển nhân từ các tế bào sinh dƣỡng. Các công nghệ này góp phần nâng cao năng suất sinh học vật nuôi, bảo tồn đa dạng sinh học. Lợn đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho con ngƣời. Ngoài ra, lợn còn có sự tƣơng đồng với con ngƣời về giải phẫu, di truyền học, sinh lý học (Meuren vcs., 2012) [40]. Do đó, việc tạo ra các sản phẩm phôi ống nghiệm ở lợn kết hợp với chuyển gene sẽ tạo ra nhiều cơ hội cho việc sử dụng động vật biến đổi gene nhƣ là thiết bị kiểm tra các phản ứng sinh học của sản phẩm dƣợc, con cho trong ghép mô khác loài, các dòng tế bào gốc phôi hay là sử dụng làm mô hình trong nghiên cứu các bệnh ở ngƣời (Nguyễn Thị Ƣớc vcs, 2008; Katska, 2006) [7, 25]. Hơn nữa, sự phát triển của các công nghệ in vitro cho phép tạo ra các sản phẩm tế bào trứng thành thục và phôi với số lƣợng lớn, giá thành thấp hơn so với các sản phẩm tạo ra trong cơ thể. Kỹ thuật nuôi thành thục trứng lợn trong ống nghiệm (IVM) sử dụng những tế bào trứng chƣa thành thục thu từ các nang trứng trên bề mặt buồng trứng. Điều này cho phép khai thác tiềm năng noãn khổng lồ của buồng trứng lợn. Hơn nữa, thời gian cho sự thành thục của tế bào trứng lợn và ngƣời là tƣơng tự nhau. Vì vây, nghiên cứu IVM ở lợn là nền tảng ý tƣởng cho kỹ thuật IVM ở ngƣời. Thành thục trứng bao gồm những thay đổi quan trọng trong nhân và tế bào chất của trứng. Thành thục nhân xảy ra trong suốt quá trình nối lại giảm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn phân. Thành thục tế bào chất cần thiết cho sự thành công của quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi. Sự thành thục tế bào chất không hoàn toàn của tế bào trứng xảy ra giải thích cho những vấn đề chính của sự thụ tinh và sự phát triển của phôi (Melanie, 2007) [39] Thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization) là một trong những kỹ thuật chủ yếu tạo phôi ống nghiệm. Con lợn đầu tiên sinh ra từ kỹ thuật này đƣợc công bố bởi Cheng vcs, 1986. Tiếp theo đó, Matiolli vcs., 1989 công bố về khả năng phát triển in vitro của trứng lợn thành thục, thụ tinh ống nghiệm. Thụ tinh ống nghiệm ở lợn bị thách thức bởi hiện tƣợng đa tinh trùng. Hiện tƣợng này xảy ra ở lợn nhiều hơn so với các loài động vật khác, ngay cả khi thụ tinh trong cơ thể dƣới các điều kiện thực nghiệm đa dạng (Hunter, 1990) [23]. Mặc dù các kỹ thuật về thành thục ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm ở lợn đã đƣợc cải thiện dần dần trong những năm gần đây, tỷ lệ đa tinh trùng cao ở lợn vẫn là một trong những vẫn đề chính trong hệ thống thụ tinh ống nghiệm ở lợn (Abeydeera, 2001) [9] Nhƣ vậy, hai vấn đề chính cần khắc phục để đảm bảo sự thành công trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn là sự không thành thục tế bào chất của trứng lợn và hiện tƣợng đa tinh trùng. Ở Việt Nam, đây cũng là một trở ngại lớn dẫn đến hiệu suất thấp trong thụ tinh ống nghiệm. Việc lựa chọn môi trƣờng nuôi thành thục và nồng độ tinh tối ƣu là điều kiện tiên quyết dẫn đến sự thành công trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm” 1.2 Mục đích Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thành thục, sự hình thành tiền nhân và sự phát triển của tế bào trứng lợn thụ tinh ống nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm 1.3 Ý nghĩa Góp phần tạo nguồn nguyên liệu trứng lợn thành thục phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực công nghệ Phôi trên động vật có vú, đặc biệt là lợn. Góp phần hoàn thiện hệ thống TTON trong điều kiện ở Việt Nam. Cung cấp nguồn nguyên liệu tế bào phôi chất lƣợng tốt phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo đặc biệt là theo hƣớng y sinh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1Sự hình thành và phát triển tế bào trứng lợn 2.1.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng Sự hình thành và phát triển nang trứng ở động vật có vú đƣợc chia làm ba giai đoạn: Từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp, nang thứ cấp và cuối cùng là nang trứng thành thục (De Graff). Nang nguyên thủy sinh ra từ biểu mô mầm chỉ có ở cơ thể con vật trong giai đoạn bào thai. Phân chia nguyên phân của tế bào mầm bắt đầu từ ngày thứ 13 của phôi cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh. Sau khi con vật đƣợc sinh ra thì các nang nguyên thủy sẽ phát triển thành nang thứ cấp. Nang nguyên thủy thƣờng bao gồm một tế bào trứng (ovocyt I) và đƣợc bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng, dẹt. Số lƣợng nang nguyên thủy của lợn rất lớn khoảng 12000 - 86000 nang. Nang sơ cấp: bao gồm một ovocyt I có đƣờng kính khoảng 30 - 60 m, nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngoài đƣợc bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng. Hạt Balliani là thể noãn đặc biệt: có tính ƣa axit, dạng hạt nhỏ, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành noãn hoàng. Nang nguyên thủy và nang sơ cấp là những nang trứng không có xoang nang. Nang thứ cấp đƣợc hình thành từ sự phát triển của nang sơ cấp, gồm một ovocyt I đã phát triển lớn hơn, chứa nhiều noãn hoàng hơn. Vỏ của ovocyt I dầy lên tạo thành màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh. Nang trứng thành thục (Nang De Graff) do nang thứ cấp phát triển thành gồm một ovocyt I có đƣờng kính 120 – 150 m, có nhiều noãn hoàng hơn, nhân to, tròn, rõ, vẫn còn hạt Balliani. Bao quanh tế bào trứng là màng trong suốt, bên ngoài màng trong suốt là vành phóng xạ. Xung quanh hai bên của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ovocyt I là phần tế bào hạt dày lên để giữ tế bào trứng gọi là đĩa trứng. Nang trứng thành thục có hai lớp vỏ: lớp vỏ bên ngoài mỏng, lớp vỏ bên trong dày hơn có chứa các mạch quản, lót trong màng trong là lớp tế bào hạt (lớp tế bào màng hạt). Giữa lớp màng hạt và màng phóng xạ của trứng là xoang nang chứa dịch nang có hormone estrogen và protein. Lợn là loài động vật đa thai sinh sản không theo mùa, một chu kỳ rụng trứng thì có nhiều trứng rụng vì vậy có nhiều nang trứng thành thục cùng phát triển trong một chu kỳ. Trong quá trình phát triển từ nang không có xoang thành nang có xoang trứng đƣợc di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, sau khi từ nang có xoang phát triển thành nang trứng thành thục thì trứng lại ra bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự rụng trứng. Giải phẫu miền vỏ buồng trứng của một gia súc cái có hoạt động sinh sản (Hình 2.1) [59] cho ta thấy nang trứng ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành xoang. Khi xoang đƣợc hình thành tế bào trứng tiếp tục phát triển cho đến khi thành thục và rụng ra khỏi buồng trứng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 2.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng lợn 2.1.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng Cấu tạo buồng trứng Quá trình hình thành tế bào trứng xảy ra ở lớp vỏ của buồng trứng từ những noãn bào nguyên thủy đƣợc phân bố vùng ngoại biên. Ở lợn, noãn bào nguyên thủy đƣợc hình thành từ những biểu mô phôi thai khi cơ thể vẫn còn trong giai đoạn bào thai. Những nang nguyên thủy này đạt 5000 ở thời điểm sinh (Black và Ericsion, 1968) [14] và giảm xuống 420.000 ở thời điểm thành thục về tính (Gosden và Telfer, 1987) [20]. Một số nang nguyên thủy có thể phát triển thành nang sơ cấp hoặc nang có xoang ở ngày 70 sau khi sinh. Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng [58] Trứng là loại tế bào lớn nhất trong cơ thể chỉ mang n nhiễm sắc thể, có dạng hình cầu (hình 2.2), ở lợn trứng có đƣờng kính từ 0,12 - 0,17 mm. Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: Nhân, nguyên sinh chất và màng bao Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn  Nhân: bao gồm lƣới nhiễm sắc thể và nhiều hạt nhân  Phần nguyên sinh chất: Bao gồm các thành phần chủ yếu là nƣớc, vật chất hữu cơ, muối khoáng và các vật chất khác.  Màng: Bao gồm ba lớp màng từ trong ra ngoài: Màng trong, mang giữa và màng ngoài. o Lớp màng trong: Là lớp màng mỏng bao bọc nguyên sinh chất, còn đƣợc gọi là màng noãn hoàng hay là màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi dƣỡng tế bào trứng đã thụ tinh. Trong màng có chứa men Muraminidaza. o Lớp màng giữa (màng trong suốt): Bao gồm nhiều tế bào, đƣợc sinh ra từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dƣỡng tế bào trứng. Tác dụng chủ yếu của màng này là đảm bảo dinh dƣỡng cho tế bào trứng trong buồng trứng và ngăn không cho tình trùng khác loài có thể đi vào nhân trong quá trình thụ tinh do trong màng chứa mem Zonalizin đặc hiệu cho từng loài. Giữa màng trong suốt và màng nguyên sinh chất một khoảng trống. Khoảng trống này có độ dày khoảng 14 - 24 m, có độ pH 3 - 5, chứa dịch có nồng độ ion cao. o Lớp màng ngoài: Bao gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế bào này đƣợc phân bố xung quanh tế bào trứng nên đƣợc gọi là màng phóng xạ, hay màng tia. Các tế bào này liên kết với nhau bởi axít Hyaluronilic. Khi tinh trùng gặp trứng ở phần acrosom (phần đầu tinh trùng) tiết ra men Hyaluronidaza để phân giải và thủy phân axít Hyaluronilic làm cho màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện cho quá trình thụ tinh xảy ra. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Ngoài cùng là lớp tế bào hạt cùng với lớp màng phóng xạ, lớp tế bào hạt tạo nên cho tế bào trứng lớp tế bào cumulus có vai trò rất quan trọng tới sự phát triển và chất lƣợng của trứng thành thục Quá trình phát triển từ noãn bào nguyên thủy đến hình thành trứng trải qua ba giai đoạn. Giai đoạn tăng số lƣợng noãn nguyên bào: Nhờ quá trình nguyên phân liên tiếp nhiều lần mà số lƣợng noãn nguyên bào đƣợc tăng lên. Do cơ chế của quá trình nguyên phân nên các noãn bào đƣợc hình thành đều mang bộ nhiễm sắc thể là 2n và đƣợc bao bọc bởi lớp tế bào biểu mô. Giai đoạn này diễn ra khi cơ thể con cái chƣa thành thục về tính. Đến khi cơ thể thành thục thì các noãn nguyên bào sẽ lần lƣợt đƣợc phát trình thành trứng thành thục. Giai đoạn sinh trƣởng: Noãn nguyên bào tích lũy chất dinh dƣỡng, tăng kích thƣớc và khối lƣợng hình thành nên các noãn bào sơ cấp và noãn bào cấp I, tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n. Giai đoạn hình thành trứng: Nhờ cơ chế giảm phân noãn bào cấp I giảm phân thông qua hai lần phân bào liên tiếp. - Lần phân bào I: Noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II (Noãn bào thứ cấp) có khối lƣợng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàn của noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kích thƣớc bé (cực cầu thứ nhất) - Lần phân bào II: Noãn bào cấp II phân chia hình thành tế bào trứng lớn và cực cầu bé thứ hai. Trong lúc đó cực cầu bé thứ nhất cũng phân chia thành hai cực cầu bé. Kết quả sau quá trình giảm phân từ một noãn bào cấp I cho một trứng lớn và ba cực cầu bé. Trứng và cực cầu bé đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội n. Trứng có khối lƣợng và kích thƣớc lớn vì đã nhận toàn bộ khối noãn hoàng từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn noãn bào cấp I điều đó có ý nghĩa phát triển của trứng, kết thúc giai đoạn giảm phân thì trứng thành thục. 2.1.3 Sự thành thục của tế bào trứng Sau khi trải qua quá trình hình thành và đạt đƣợc kích thƣớc cực đại, trứng sẽ chuyển sang giai đoạn thành thục. Sự thành thục của tế bào trứng bao gồm thành thục nhân và thành thục tế bào chất. Thành thục nhân: Là quá trình nối lại giảm phân và đạt tới giai đoạn trung kỳ II. Trong noãn hoàng chuẩn bị thành thục, nhân có kích thƣớc rất lớn và đƣợc gọi là túi phôi (Germinal Vesicle - GV). Sau khi bị kích thích bởi các kích dục tố hoặc điều kiện thích hợp của môi trƣờng nuôi thành thục in vitro, nhân lại nhanh chóng tiếp tục các kỳ của quá trình giảm phân (Meiosis). Kết thúc quá trình giảm phân I hình thành nên hai tế bào: Tế bào thứ nhất gồm có nhân và một chút tế bào bào chất tách ra khỏi noãn bào và nằm ngoài màng sinh chất nhƣng bên trong màng trong suốt đƣợc gọi là thể cực thứ nhất. Tế bào thứ hai là noãn bào II. Noãn bào này sẽ bị kìm hãm ở kỳ giữa của lần phân bào giảm nhiễm thứ hai (giai đoạn Metaphase II) cho đến khi thụ tinh (Nguyễn Mộng Hùng, 2000) [4]. Sự thành thục của nhân trứng bắt đầu bằng việc tan biến màng (GVDB), các nhiễm sắc thể đặc lại, điển hình là sự xuất hiện của thể cực thứ nhất và nhiễm sắc thể ở trạng thái metaphase II. Quá trình thành thục tế bào chất: Tế bào chất là nơi quan trọng trong việc tổng hợp các protein thiết yếu, chuẩn bị các điều kiện cho noãn bào có thể thụ tinh và phát triển phôi sớm. Biểu hiện của sự thành thục tế bào chất là việc tăng sinh các thể hạt (Mitochondries), xuất hiện thể Golgi, có sự di chuyển các hạt vỏ (Granules corticales) tới chu vi noãn bào ngay dƣới màng dịch tƣơng. Những hạt này chứa Ovoperpxidase có tác dụng ngăn không cho nhiều tinh trùng có thể xâm nhập vào một trứng (ngăn chặn hiện tƣợng đa tinh trùng) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn