Tài liệu Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh giai đoạn nảy mầm ở hạt đậu tương(glycine max)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN THỊ LAN PHƢỢNG ẢNH HƢỞNG CỦA ÁP SUẤT THẨM THẤU ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, HOÁ SINH GIAI ĐOẠN NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƢƠNG (Glycine mahx) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS NGUYỄN VĂN MÃ Học viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LAN PHƢỢNG HÀ NỘI, 2010 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây Đậu tƣơng (Glycine max (L) Merrill) hay còn gọi là đậu nành, là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị về mặt kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao. Trong hạt đậu chứa: 40% protein, 12-25% lipid, 10-15% glucid, các chất khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các vitamin A, B1, B2, D, E, F và các enzym, sáp, nhựa, cellulose 1 , 4 . Trong cây đậu tƣơng có nhiều loại axit amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu tƣơng đƣợc coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng kể các amino axit không thay thế cần thiết cho cơ thể ngƣời và động vật. Một đặc tính khác nữa ở cây đậu tƣơng là có vi khuẩn nốt sần ở rễ, tạo khả năng cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tƣơng có tác dụng cải tạo đất và bảo vệ môi trƣờng 4 . Ở Việt Nam, đậu tƣơng là cây trồng quan trọng và có mặt tƣơng đối sớm, sản phẩm từ đậu tƣơng đƣợc sử dụng phổ biến trong các bữa ăn hàng ngày nhƣ: đậu phụ, sữa đậu nành, dầu ăn, nƣớc tƣơng, bột đậu. Ngoài ra đậu tƣơng đƣợc dùng nhƣ một số bài thuốc cổ truyền ngừa ung thƣ, giảm sỏi thận... 8]. Không những đậu tƣơng đƣợc sử dụng cho ngƣời mà còn đƣợc sử dụng làm thức ăn cung cấp protein thực vật cho động vật nhƣ: khô dầu đậu tƣơng, bột đậu tƣơng... Đậu tƣơng là loại cây trồng quan trọng ở một số nƣớc trên thế giới nhƣ Mỹ, Braxin, Achentina, Trung Quốc, Ấn Độ, Paragoay, Canađa, Inđônêsia và các nƣớc khác. Sản lƣợng đậu tƣơng cũng tăng theo từng năm. Theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng xuất khẩu đậu tƣơng trên thế giới năm 2010 dự báo đạt 88,24 triệu tấn, tăng so với 86,35 triệu tấn của năm 2009. Vì vậy tổng sản lƣợng dầu đậu tƣơng thế giới dự báo đạt 39,97 triệu tấn trong năm 2010, tăng so với 37,98 triệu tấn của năm 2009. Tổng xuất khẩu dầu đậu tƣơng thế giới dự báo đạt 9,06 triệu tấn so với 9,01 triệu tấn của năm 2009. 2 Việc nâng cao năng suất cây đậu tƣơng mang lại nhiều lợi ích. Tuy nhiên vấn đề cơ bản hạn chế năng suất đậu tƣơng ở Việt Nam là điều kiện khí hậu, đặc biệt là hạn hán. Nƣớc ta có địa hình đa dạng, diễn biến khí hậu phức tạp, lƣợng mƣa phân bố không đều giữa các vùng và các thời kỳ trong năm nên hạn hán có thể xảy ra ở bất kỳ vùng nào, mùa nào, khi gặp điều kiện thiếu nƣớc năng suất sẽ giảm đáng kể 6 , 10 , 14 . Các nghiên cứu tìm hiểu bản chất khả năng chịu hạn của cây trồng nói chung và đậu tƣơng nói riêng ngày càng đƣợc mở rộng. Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật hiện đại, các nhà khoa học có điều kiện đi sâu tìm hiểu cơ chế sinh lý liên quan đến tính chịu hạn của thực vật nhƣ: ảnh hƣởng của thiếu nƣớc đến sự phát triển của hạt [44], [50], đến quá trình hô hấp [45] và quang hợp [46], [48]. Một số cơ chế hóa sinh và sinh học phân tử cũng đã đƣợc nghiên cứu nhằm: xác định vị trí của gen liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu [17], gen tổng hợp một số chất hình thành và tích lũy nhiều khi hạn hán: prolin [3], [12], nhóm amin bậc 4, một số đƣờng [27], [33], [37], [51]... Trên thế giới đã có một số nhà khoa học nghiên cứu nhƣ: James A.Bunce [42], Miquel Ribas Carbo [46], Sheila A.Blackman [52], tìm hiểu ảnh hƣởng của sự thiếu nƣớc đến quang hợp, hô hấp, sinh trƣởng đã đạt đƣợc kết quả nhất định. Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn khi xử lý phân vi lƣợng, khả năng quang hợp, chất lƣợng hạt khi gây hạn, nâng cao khả năng chịu hạn của đậu tƣơng: Ngô Đức Dƣơng [6], Điêu Thị Mai Hoa [11], Nguyễn Huy Hoàng [13], [16], Trần Thị Phƣơng Liên [17], Nguyễn Văn Mã [19], [20], [22], [23]. Đối với thực vật, để có thể tồn tại đƣợc với điều kiện bất lợi của môi trƣờng phải có những cơ chế thích nghi. Một trong những phản ứng thích nghi đó là việc tăng hàm lƣợng một số chất điều hoà áp suất thẩm thấu. Vì vậy việc nghiên cứu về áp suất thẩm thấu và ảnh hƣởng của áp suất thẩm thấu lên thực 3 vật nói chung, đậu tƣơng nói riêng là một việc quan trọng, xuất phát từ vấn đề này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh giai đoạn nảy mầm ở hạt đậu tương (Glycine max)”. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định một số chỉ tiêu trong điều kiện áp suất thẩm thấu (ASTT) khác nhau: khả năng nảy mầm, sinh trƣởng thân mầm, rễ mầm, khối lƣợng tƣơi, khối lƣợng khô, hàm lƣợng prolin, hoạt độ một số enzym trong mầm đậu tƣơng. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Xác định một số chỉ tiêu sinh lý nhƣ: tỷ lệ nảy mầm, sinh trƣởng thân mầm, rễ mầm, khối lƣợng tƣơi, khối lƣợng khô của mầm đậu tƣơng trong các điều kiện ASTT khác nhau. - Xác định hàm lƣợng prolin của mầm đậu tƣơng trong các điều kiện ASTT khác nhau. - Xác định hoạt độ các enzym proteaza, lipaza và -amylaza của mầm đậu tƣơng ở các điều kiện ASTT khác nhau. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tƣợng: Giống đậu tƣơng DT96, AK02. Phạm vi nghiên cứu: một số chỉ tiêu sinh lý (tỉ lệ nảy mầm, chiều dài thân mầm, rễ mầm, khối lƣợng tƣơi, khối lƣợng khô của mầm), hàm lƣợng prolin, hoạt độ các enzym proteaza, lipaza và -amylaza của mầm đậu tƣơng. 5. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn Bổ sung nguồn tài liệu cho việc nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh của mầm đậu tƣơng trong điều kiện ASTT khác nhau và mối quan hệ của chúng với khả năng chịu hạn của cây. Xác định đƣợc giống chịu đƣợc điều kiện ASTT cao phục vụ cho việc gieo trồng ở vùng ngập mặn hoặc vùng hạn. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây đậu tƣơng 1.1.1. Nguồn gốc cây đậu tương Cây đậu tƣơng thuộc họ Đậu (Fabaceae), bộ Fabales là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại. Năm 1948, Ricker và Morse đã khẳng định tên thực vật đúng của đậu tƣơng là Glycine max (L.) Merrill. Chi phụ Soja có hai loài Glycine max (L.) Merrill và Glycine soja Sieb et Zucc. Glycine max (L.) Merrill là cây trồng hàng năm, không phát hiện thấy loài hoang dại. Nó có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc). Xuất phát từ một loài đậu nành dại thân mảnh, dạng dây leo, ít phân nhánh, dạng bụi, xẻ lá chét lông chim, phiến lá hình ô van, chùm hoa có cuống ngắn, hoa tím hoặc trắng, quả thẳng hoặc cong, thƣờng có nhiều lông. Mỗi quả thƣờng có ba hạt hình tròn hoặc cầu. Vỏ hạt có màu sắc biến đổi từ vàng sáng đến nâu, đen, xanh. Khối lƣợng của hạt dao động từ 10g đến 20g [1], [4], [10]. Từ Trung Quốc, cây đậu nành đã đƣợc nhân rộng ra khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trƣớc công nguyên, đậu nành đƣợc đƣa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật. Giữa thế kỷ 17, đậu nành mới đƣợc nhà thực vật học ngƣời Đức Engelbert Caempfer đƣa về Châu Âu và đến năm 1954, đậu nành đƣợc du nhập vào Hoa Kỳ [28]. Những nghiên cứu về nguồn gốc cây đậu tƣơng chứng tỏ nó bắt nguồn từ Trung Quốc, các kết quả nghiên cứu về tế bào học, hình thái học, protein trong hạt và ADN của ty thể đã chứng tỏ rằng G. soj2a là tổ tiên hoang dại của cây đậu tƣơng trồng [4]. 1.1.2. Tình hình gieo trồng cây đậu tương Cây đậu tƣơng là cây có ý nghĩa về mặt kinh tế và môi trƣờng. Nó có tác dụng cải tạo đất. Trên thế giới, diện tích đậu tƣơng ngày càng đƣợc mở rộng, năng 5 suất ngày càng tăng. Đậu tƣơng có mặt ở khắp các châu lục, tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ, tiếp đến là châu Á và một số nơi khác trên thế giới. Ở Việt Nam, cây đậu tƣơng đƣợc trồng tƣơng đối sớm nhƣng do tập quán canh tác nên đậu tƣơng chƣa phát triển về diện tích và năng suất. So với bình quân chung của thế giới, năng suất đậu tƣơng của Việt Nam chỉ đạt 57%. Cả nƣớc hình thành 6 vùng sản xuất đậu tƣơng: vùng Đông Nam Bộ có diện tích lớn nhất chiếm 26,2% diện tích đậu tƣơng cả nƣớc, miền núi Bắc Bộ 24,7%; Đồng bằng sông Hồng 17,5%; Đồng bằng sông Cửu Long 12,4%; còn lại là vùng đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên chiếm 33,4%. Về sản lƣợng: 3 vùng Đồng bằng sông Hồng, Đông Nam Bộ, Đồng bằng sông Cửu Long chiếm 63% sản lƣợng đậu tƣơng cả nƣớc. Đặc biệt vùng Đồng bằng sông Cửu Long với 12,4% diện tích nhƣng lại chiếm 20,9% sản lƣợng đậu tƣơng cả nƣớc, năng suất bình quân đạt 16 tạ/ha [4]. 1.2. Các giai đoạn sinh trƣởng phát triển của đậu tƣơng 1.2.1. Giai đoạn nảy mầm Sau khi trồng, hạt đậu tƣơng ngấm nƣớc rất nhanh, trừ 1 vài giống đặc biệt là loại hoang dại, khả năng ngấm nƣớc chậm hơn. Trong điều kiện thuận lợi rễ xuất hiện sau khi trồng từ 1 đến 2 ngày. Rễ này gọi là rễ chính nó phát triển nhanh xuống phía dƣới đến ngày thứ 4, ngày thứ 5 rễ phụ bắt đầu xuất hiện. Sau 3-4 ngày lá mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất do sự sinh trƣởng mạnh của phần trên trụ mầm dƣới. Lúc đầu lá mầm có màu vàng nhạt, sau có màu xanh, sau cùng chuyển sang vàng và rụng xuống [1], 4 , [15]. Thực chất quá trình nảy mầm là một chuỗi biến đổi sinh lý, sinh hoá mạnh mẽ diễn ra trong hạt, chuẩn bị cho sự hình thành cây non. Đậu tƣơng thuộc cây hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các pha nhƣ sự nảy mầm của cây hai lá mầm, đó là: 6 + Pha trƣơng hạt: Tính từ khi bắt đầu nảy mầm, hạt hút nƣớc rất mạnh làm trƣơng hạt. + Pha hình thành và hoạt hoá enzym: Hạt có một lƣợng enzym nhất định nhƣng chủ yếu ở dạng liên kết, khi hạt hút nƣớc thì enzym mới đƣợc giải phóng ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh. + Pha tích luỹ chất dinh dƣỡng: Ngay trong những phút đầu tiên ngâm trong nƣớc, độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt chu trình hexozomonophotphat tăng lên nhiều lần, do vậy lƣợng ATP tích luỹ nhiều. + Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trƣng cho cơ thể trong giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dƣỡng trong hạt chủ yếu thuộc 3 nhóm chất hữu cơ là: gluxit, protein, lipit. Trong quá trình nảy mầm enzym -amilaza tác động vào liên kết 1,4- glucozit phân giải tinh bột thành các đextrin tham gia vào quá trình hô hấp ở các dạng saccarôzơ tích luỹ ở các tế bào trụ phôi. Protein đƣợc phân giải bởi enzym proteaza thành các axit amin và các amít. Phần lớn các axit amin tạo thành đƣợc vận chuyển vào trụ phôi để tổng hợp các phân tử protein đặc trƣng cho cơ thể. Enzym lipaza phân giải lipit thành axit béo và glixerol. Ngoài ra lipit còn đƣợc tái chuyển hoá thành gluxit cung cấp năng lƣợng cho hạt nảy mầm. Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nƣớc, nhờ cơ chế hút trƣơng của hạt làm hạt trƣơng lên. Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ, trong hạt bắt đầu tăng tính thuỷ hoá của keo nguyên sinh chất, giảm tính ƣa mỡ và độ nhớt của keo, dẫn đến những biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất trong hạt liên quan đến sự nảy mầm. Đặc trƣng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính enzym thuỷ phân, polisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành các chất đơn giản dẫn đến thay đổi hoạt động thẩm thấu. Các sản phẩm thuỷ phân này dùng làm nguyên liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ của phôi hạt, vừa làm tăng ASTT trong hạt, giúp cho quá trình hút nƣớc vào hạt nhanh chóng. 7 1.2.2. Giai đoạn cây con Sau khi gieo 5-7 ngày, thân rễ vƣơn dài và đƣa hai lá mầm lên khỏi mặt đất, hai lá mầm mở ra, thân mầm phát triển thành thân chính. Lúc này, cây con sống chủ yếu nhờ vào thức ăn dự trữ trong lá mầm. Khi bộ rễ phát triển hút chất dinh dƣỡng từ đất nuôi cây là lúc lá mầm chuyển thành màu vàng, rụng xuống đất (sau khi gieo 15-20 ngày) [15]. Nhu cầu về nƣớc của giai đoạn này khá lớn. Để đảm bảo hạt nảy mầm, hàm lƣợng nƣớc trong hạt phải đạt 50% so với khối lƣợng hạt [4], [15]. Thiếu nƣớc ở thời kỳ cây con sẽ làm giảm quá trình tăng trƣởng, nhƣng ít ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất nếu hạn không cản trở sự khép tán hoàn toàn [10]. 1.2.3. Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng Thân lá phát triển nhanh từ khi mọc đến khi ra hoa. Có hai loại đặc tính chính ở cây đậu tƣơng là sinh trƣởng của thân và ra hoa chính. Đối với đặc tính sinh trƣởng vô hạn, cây tiếp tục sinh trƣởng sinh dƣỡng hầu nhƣ trong suốt vụ trồng. Đặc tính sinh trƣởng hữu hạn, cây ngừng sinh trƣởng khi ra hoa. Ở giai đoạn này, bộ rễ phát triển nhanh cả về chiều rộng và chiều sâu. Nốt sần hình thành nhiều và bắt đầu hoạt động cố định đạm, cung cấp dinh dƣỡng cho cây [4 , [28]. Sự sinh trƣởng, phát triển của cây là kết quả của các quá trình trao đổi chất nhƣ quang hợp, hô hấp, vận chuyển các chất đồng hoá… Tất cả các quá trình này đều bị kìm hãm bởi sự thiếu nƣớc. Vì vậy, ở giai đoạn này nhu cầu về nƣớc cho cây sinh trƣởng, phát triển tăng hơn so với giai đoạn cây con. 1.2.4. Giai đoạn sinh trưởng sinh thực * Giai đoạn ra hoa Thời gian ra hoa đầu tiên đến ra hoa cuối cùng kéo dài từ 3 đến 4 tuần, tùy thuộc vào giống chín sớm hay chín muộn. Ở những giống sinh trƣởng hữu hạn, có 8 chùm hoa ở cả ngọn và nách lá, quả hình thành phân bố đều dọc theo thân, phía ngọn có phần nhiều hơn. Cây đậu tƣơng ra nhiều hoa nhƣng tỷ lệ hoa không đậu quả chiếm khoảng 20 - 80% [6], [10], [15]. Hoa rụng do nhiều nguyên nhân nhƣng chủ yếu là sự ảnh hƣởng bất lợi từ môi trƣờng, đặc biệt là hạn hán. Các nghiên cứu về nhu cầu nƣớc của cây đậu tƣơng cho thấy cây cần rất nhiều nƣớc ở giai đoạn này. Thiếu nƣớc dẫn đến giảm số chùm hoa, rụng hoa và giảm số quả [37]. * Giai đoạn hình thành quả và hạt Quả đầu tiên hình thành trong phạm vi 7 - 8 ngày sau khi hoa đầu tiên nở. Trong điều kiện bình thƣờng, quả sẽ phát triển đầy đủ sau khoảng 20 ngày, các chất dinh dƣỡng trong cây đƣợc vận chuyển vào hạt, quả mẩy dần [15]. Nhu cầu về nƣớc ở giai đoạn này của cây tăng cao, thiếu nƣớc làm rụng quả, giảm kích thƣớc hạt, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất của hạt [37]. * Giai đoạn quả chín Hạt phình to, kín khoang hạt, quả mẩy đều, cây ngừng sinh trƣởng, độ ẩm trong hạt giảm dần cho đến khi chỉ còn 13 - 15%. Lá đậu chuyển sang mầu vàng và rụng xuống đất [13]. Nhu cầu về nƣớc của cây đậu tƣơng ở giai đoạn này giảm hơn so với các giai đoạn trƣớc. Khi quả chín, để duy trì chất dinh dƣỡng, tránh bị nhiễm bệnh và nẩy mầm sớm cần phải điều chỉnh độ ẩm của đất giảm dần. Tính mẫn cảm của cây đậu tƣơng đối với sự thiếu hụt nƣớc ở các giai đoạn sinh trƣởng là khác nhau. Giá trị của tính mẫn cảm ở mỗi giai đoạn đƣợc cho là phần năng suất bị giảm do thiếu nƣớc nghiêm trọng ở giai đoạn đó. Kết quả cho thấy giá trị mẫn cảm của đậu tƣơng ở giai đoạn sinh dƣỡng là 0,12; ở thời kì ra hoa là 0,24; cuối ra hoa hình thành quả là 9 0,35 và giai đoạn quả chín là 0,13 [4]. Sử dụng giá trị này để có kế hoạch tƣới tiêu hợp lý cho từng giai đoạn sinh trƣởng của cây đậu tƣơng. Theo đó cần tƣới nƣớc khi sự suy kiệt nƣớc trong đất đạt tới 80% ở giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng, 45% ở giai đoạn ra hoa, 30% ở giai đoạn cuối ra hoa, làm quả và 80% ở giai đoạn quả chín. Nhƣ vậy, không nên để cây thiếu nƣớc ở giai đoạn cây ra hoa, tạo quả mà tƣới nƣớc là rất cần thiết ở giai đoạn này. 1.3. Ảnh hƣởng của áp suất thẩm thấu đến khả năng nảy mầm của hạt ASTT là lực gây ra sự chuyển dịch của dung môi vào tế bào qua màng sinh chất. Nó không phụ thuộc vào bản chất của chất tan, mà phụ thuộc vào nồng độ phân tử chất tan, nhiệt độ, sự phân li của dung dịch. ASTT bao gồm ASTT bên trong (ASTT thấu nội bào) và bên ngoài (ASTT môi trƣờng). ASTT bên trong: Dịch tế bào có chứa hàm lƣợng lớn các chất hữu cơ là sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Các chất này trong dịch tế bào đã tạo nên ASTT cao, giúp cho quá trình xâm nhập của nƣớc vào trong tế bào bằng con đƣờng thẩm thấu. ASTT bên ngoài chủ yếu do tính mặn của môi trƣờng gây nên. Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng muối cao, đặc biệt là NaCl. Điều đó đã hạn chế khả năng hút nƣớc, dẫn đến khó khăn trong việc hút chất dinh dƣỡng [11]. Nếu cây sinh trƣởng trong môi trƣờng không có muối, thì nƣớc sẽ dễ dàng thấm qua màng bán thấm để đi vào tế bào chất nhờ hiện tƣợng thẩm thấu. Đất bị nhiễm mặn sẽ gây nên 2 tác hại đối với thực vật: Tác hại thứ nhất, gây ra hiện tƣợng hạn sinh lí. Hàm lƣợng muối cao trong đất làm cho ASTT môi trƣờng lớn. Nếu ASTT nội bào không thắng nổi áp suất của môi trƣờng, cây sẽ bị khô héo do nƣớc từ trong tế bào đi ra ngoài. Thiếu nƣớc nhẹ thì làm giảm tốc độ sinh trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng quá trình già hoá tế bào. Khi bị 10 khô kiệt nƣớc, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thƣơng và chết. Tác hại thứ hai, liên quan đến tính gây độc của các ion đối với thực vật. Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng cao các ion, đặc biệt Na+ và Cl-, ngoài ra còn có các ion khác: SO42-, HCO3-, Li+,... Hàm lƣợng cao các ion này đều gây hại cho sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Nƣớc là điều kiện quan trọng cho sự nảy mầm. Nƣớc tham gia vào quá trình trao đổi chất, các phản ứng sinh hoá trong tế bào, là nguồn nguyên liệu của nhiều phản ứng. Nƣớc đảm bảo cho cây tồn tại và phát triển. Hạt khô có hàm lƣợng nƣớc từ 10 - 14% thì không nảy mầm. Nhờ lực hút trƣơng nƣớc của keo nguyên sinh mà hạt hút đƣợc nƣớc và khi hàm lƣợng nƣớc bằng 50 - 70% khối lƣợng hạt thì các hoạt động sống tăng lên mạnh mẽ và phôi phát động sinh trƣởng hay nảy mầm. Sự thiếu nƣớc ở thực vật chủ yếu do hạn hán và ASTT môi trƣờng gây nên. Khi thiếu nƣớc thƣờng làm cho tế bào mất sức căng, đỉnh sinh trƣởng bị héo và các quá trình sinh lý diễn ra không bình thƣờng. Hoạt động của enzym thuỷ phân thƣờng diễn ra nhanh hơn là enzym tổng hợp dẫn đến tế bào mất chất dinh dƣỡng. Đồng thời cũng gây ảnh hƣởng trầm trọng đến quá trình hô hấp. Khi thiếu nƣớc cƣờng độ hô hấp tăng nhƣng hiệu quả năng lƣợng bị giảm sút. Thiếu nƣớc gây ảnh hƣởng xấu đến sinh trƣởng và phát triển của cây, cuối cùng ảnh hƣởng đến năng suất và phẩm chất của chúng. Thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng sống trong điều kiện thiếu nƣớc có khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nƣớc bằng những biến đổi hình thái hoặc những phản ứng hoá sinh phù hợp. Biến đổi hình thái đƣợc chú ý nhiều là ở bộ rễ. Bên cạnh đó là sự giảm diện tích lá của đậu tƣơng khi gặp hạn, nhằm giảm sự thoát hơi nƣớc của lá. 11 Các thay đổi hoá sinh thƣờng liên quan đến cơ chế chống mất nƣớc do sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nƣớc. Điều chỉnh ASTT nội bào thông qua tích luỹ các chất tan, các protein và axit amin nhờ enzym thuỷ phân là cơ chế giúp tế bào duy trì lƣợng nƣớc tối thiểu. Trong điều kiện thiếu nƣớc, các phản ứng hoá sinh diễn ra nhằm khử độc các sản phẩm đƣợc tạo nên trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử hoặc xúc tiến phục hồi các cấu trúc bị tổn thƣơng. Về khả năng chịu mặn của thực vật, trƣớc hết phải nói đến cơ chế tích luỹ và duy trì nồng độ cao các chất hoà tan trong tế bào nhằm đảm bảo cạnh tranh nƣớc với môi trƣờng nhiễm muối và chống lại hiện tƣợng hạn sinh lí. Hàm lƣợng NaCl cao trong đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống thƣờng xuyên trên đất này phải có khả năng thu nhận và tích trữ Na+, Cl- cao hơn nhiều thực vật vốn có khả năng chịu mặn. Ngoài ra còn có những thay đổi về các phản ứng sinh lí nhƣ: hô hấp, quang hợp, thoát hơi nƣớc của lá cho phù hợp với điều kiện thiếu nƣớc của cây. Đã có một số công trình nghiên cứu sự ảnh hƣởng của ASTT trên các đối tƣợng động vật (lƣỡng cƣ, bò sát… ). Trên thực vật, các nhà khoa học cũng đã đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của ASTT đối với khả năng hút nƣớc, sinh trƣởng của rễ, thân và lá. Trong nuôi cấy mô, ảnh hƣởng của manitol đến tích lũy prolin và glucose liên quan đến khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus cà chua [7]. Đã có một số công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của ASTT trên đối tƣợng đậu tƣơng, nhƣng nghiên cứu mới chỉ dừng lại việc đánh giá sự ảnh hƣởng của một ASTT nhất định (7 hoặc 9 atm). Hiện nay vẫn chƣa có một công trình nghiên cứu nào đƣợc công bố việc đánh giá tổng thể ảnh hƣởng của các mức ASTT khác nhau từ thấp đến cao. 12 1.4. Prolin và vai trò của prolin đối với khả năng chịu hạn của cây 1.4.1. Cấu tạo prolin COOH H2N C H2C CH2 H CH2 Công thức cấu tạo Prolin hay - pirolidin cacboxylic là một Cấu trúc không gian - iminoaxit ƣa nƣớc có công thức phân tử C5H9NO2, có mạch bên là hidrocacbua khác với các axit amin khác ở chỗ, nhóm amin bậc 1 ở Cα liên kết với cacbon của mạch bên tạo thành vòng pirolidin. 1.4.2. Vai trò của prolin Prolin đƣợc tổng hợp từ L-glutamat bởi enzym chìa khoá -pyrrolin- cacboxilat-synthetaza (P5CS), enzym này đƣợc điều hoà bởi prolin thông qua cơ chế ức chế ngƣợc. Ở thực vật chịu stress nƣớc, sự điều hoà ngƣợc này đã biến mất và đây có thể là nguyên nhân làm tăng sự tích luỹ prolin dƣới các điều kiện stress. Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu. Chúng có khối lƣợng phân tử nhỏ, các hợp chất này có chung tính chất không tích điện ở pH trung tính (nhƣ các ion vô cơ) và có khả năng hòa tan tốt trong nƣớc, không độc khi tập trung với nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc của các phân tử protein, giúp thành tế bào chống lại ảnh hƣởng làm biến tính của sự tập trung muối cao và các chất tan khác có hại cho tế bào [49]. Prolin tự do trong khi stress có hiệu ứng sinh học đa năng, không chỉ trong chức năng điều chỉnh ASTT mà còn có tác động bảo vệ hàng loạt enzym trong điều kiện biến tính (nhiệt 13 độ cao, nồng độ muối cao…) [3]. Bên cạnh đó prolin còn thể hiện khả năng bảo vệ gián tiếp protein và màng khỏi tổn thƣơng. Prolin còn đƣợc xem nhƣ một dạng dự trữ nitơ. Khi gặp stress, nó dễ đƣợc sử dụng ở giai đoạn khử nhƣ thành phần của hệ thống giữ gìn pH của tế bào và điều chỉnh thế khử của tế bào. Prolin còn là nguồn cung cấp năng lƣợng và đƣơng lƣợng khử [30]. Phân tử prolin có cấu trúc vòng (pirolidin). Cấu trúc này tạo cho prolin một hình dáng vững chắc hơn so với các axit amin khác. Nhƣ vậy, vai trò của prolin trong chống chịu stress nƣớc ở thực vật thể hiện: prolin tham gia điều chỉnh ASTT của nội bào, tham gia vào cấu trúc bảo vệ màng và protein, dự trữ nitơ và năng lƣợng. Sự tích lũy prolin là một phản ứng chuyển hóa thông thƣờng ở thực vật trong điều kiện thiếu hụt nƣớc và stress muối. Đây là chủ đề đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu hơn 20 năm qua (Stewart and Larher, Thompson, Stewart, Hanson and Hizt, Rhodes, Delauney and Verma, Samaras, Taylor, Rhodes) [50]. Đã có nhiều công trình trên thế giới nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng thực vật và cây trồng khác nhau, nhằm tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyển hoá prolin,… liên quan đến vai trò của prolin đối với tính chịu hạn của thực vật. Trong dòng tế bào thuốc lá đƣợc nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428 mM NaCl, prolin chiếm trên 80% axit amin tự do (Rhodes and Handa, 1989) [50]. Ngƣời ta thừa nhận rằng, có sự phân bố đồng đều prolin trong toàn bộ thể tích nƣớc của nội bào, kết quả xác định axit amin tại thời điểm này vƣợt quá 129 mM. Tuy nhiên, nếu chỉ hạn chế trong nội bào thì sự tích lũy prolin có thể vƣợt quá nồng độ 200 mM trong các tế bào này vì thế nó góp phần căn bản vào việc điều chỉnh thẩm thấu nội bào (Binzel et al, 1987) [33]. Tƣơng tự nhƣ vậy, sự tích lũy prolin nội bào ở các tế bào Distichlis spicata trong điều kiện stress muối (xử lí ở nồng độ 200 mM NaCl) ƣớc tính trên 230 mM (Ketchum et al, 1991) [43]. Kishor P.B.K và cộng sự (1995) [44] nghiên cứu 14 cây thuốc lá đƣợc chuyển gen (gen liên quan đến sinh tổng hợp prolin – P5CS) trong điều kiện hạn nƣớc, hạn muối. Kết quả cho thấy hàm lƣợng prolin tăng khoảng từ 10 - 18 lần so với đối chứng. Thực vật đƣợc chuyển gen (gen P5CS) cũng đƣợc nghiên cứu trên đối tƣợng là cây đậu tƣơng (J.A.de Ronde; R.N. Laurie; T.Caetano; M.M. Greyling; I.Kerepesi 2004) [41]. Kết quả so sánh tính chịu hạn giữa dòng đậu tƣơng chuyển gen P5CS và dòng đối chứng (không chuyển gen) cho thấy dòng chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn. Ngoài ra, còn có nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng: dƣa hấu, cà chua, lúa mỳ, củ cải đƣờng, khoai tây,... [34], [36], [38], [39], [40], ... cũng cho kết quả tƣơng tự. Theo Delauney AJ, Verma DPS (1993) [35] con đƣờng tổng hợp prolin trong thực vật nhƣ sau: P5CS: -pyrrolin-5-cacboxilat synthetaza P5CR: -pyrrolin-5-cacboxilat reductaza Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu vai trò của prolin đối với khả năng chịu hạn của nhiều loại cây trồng. Theo Nguyễn Hữu Cƣờng (2003) [3]: bằng việc xử lí lạnh, mặn, hạn trên các giống lúa đã cho thấy có mối tƣơng quan thuận giữa tính chống chịu của cây với hàm lƣợng 15 prolin gia tăng của các giống lúa nghiên cứu. Tác giả Đinh Thị Phòng (2001) [27] cho biết: khi xử lí hạn, hàm lƣợng prolin đều tăng lên, mức độ tăng lên khác nhau ở mỗi giống. Những giống chịu hạn tốt hàm lƣợng prolin tăng 9 lần sau khi xử lí hạn 8 ngày. Nhƣ vậy, prolin có ảnh hƣởng lớn tới tính chịu hạn ở thực vật và cây trồng nói riêng. Sự tổng hợp axit amin prolin ở thực vật hay cây trồng diễn ra khi chúng sống trong điều kiện thiếu nƣớc, stress muối. Những nghiên cứu về prolin trên đối tƣợng lúa, đậu xanh, cà chua, cây thuốc lá… cho thấy sự tƣơng quan thuận giữa gia tăng hàm lƣợng prolin với tính chống chịu sự thiếu nƣớc, stress muối của chúng [3], [11], [34], [39]... Do đó, có thể xem axit amin này nhƣ một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật hay sự tích lũy prolin là biểu hiện của phản ứng thích nghi của thực vật với điều kiện cung cấp nƣớc khó khăn. 1.5. Một số enzym trong hạt nảy mầm Trong hạt nảy mầm xuất hiện một số enzym để thuỷ phân các chất có trong hạt, xúc tác cho sự nảy mầm của hạt. Một số enzym có vai trò quan trọng đối với sự nảy mầm của hạt đậu tƣơng là enzym proteaza, lipaza, -amylaza... Enzym có bản chất là protein. Đến nay đã biết và phân loại đƣợc hơn 3500 enzym. Nhiều enzym đƣợc sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau nhƣ: nghiên cứu cấu trúc phân tử, định lƣợng các chất trong công nghiệp, nông nghiệp, y học... Ở đậu tƣơng đang nảy mầm, diễn ra quá trình phân giải các chất hữu cơ cung cấp năng lƣợng cho cây sinh trƣởng và phát triển. Enzym hoạt động chủ yếu trong giai đoạn này là enzym thuỷ phân thuộc nhóm hiđrolaza (các enzym xúc tác cho phản ứng thuỷ phân) nhƣ: proteaza, lipaza, -amilaza,... 16 Proteaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptit, tạo thành peptit phân tử thấp và các axit amin. Proteaza đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sống, nhất là thời kỳ nảy mầm của hạt. Thời kỳ này protein bắt đầu đƣợc phân giải thành axit amin dƣới tác dụng của enzym proteaza. Proteaza không chỉ tham gia vào phân giải protein dự trữ trong hạt mà chúng còn tham gia vào quá trình vi xử lý phân tử protein, phân giải các protein lạ hoặc bị biến tính khi gặp điều kiện cực đoan (lạnh, mặn, hạn, tác động cơ học...) [17]. Trần Thị Phƣơng Liên (1999) khi nghiên cứu so sánh phổ điện di hoạt tính proteaza của các giống đậu tƣơng chịu nóng, chịu hạn khác nhau đã nhận xét rằng: proteaza trong quá trình nảy mầm của hạt ở tất cả các giống đậu tƣơng nghiên cứu rất đa dạng, có hoạt tính cao, có khả năng phân giải hoàn toàn chất dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho cơ thể mới [17]. Có nhiều loại proteaza trong hạt đậu tƣơng, chúng có kích thƣớc phân tử, nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu là 5 (gần với pH của tế bào). Các axit amin là nguồn nguyên liệu cho quá trình tổng hợp mới các chất đồng thời góp phần tăng ASTT của tế bào thực vật. Proteaza còn tham gia trong nhiều lĩnh vực quan trọng của đời sống nhƣ công nghiệp chất tẩy rửa, công nghiệp hoá chất, y học và nhiều ngành công nghiệp khác. Lipaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân triaxilglixerol tạo thành các axit béo tự do và glixerol. Lipaza xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lƣợt từng este trong phân tử chứ không cắt đứt cả 3 liên kết este cùng lúc. Axit béo và glixerol là nguyên liệu cho hô hấp giải phóng năng lƣợng và kiến tạo các thành phần của tế bào. Chuẩn độ lƣợng axit béo sinh ra bằng kiềm từ đó xác định hoạt độ lipaza. -amilaza: phân giải liên kết 1,4-glucozit ở giữa chuỗi mạch polisacarit tạo các đextrin phân tử thấp. Dƣới tác dụng của enzym này dung dịch tinh bột nhanh chóng mất khả năng tạo màu với dung dịch iot và bị giảm nhanh độ nhớt. Do đó, để xác định hoạt độ của enzym -amilaza ngƣời ta thƣờng dựa vào sự biến đổi màu của iot khi cho tác dụng với enzym này. 17 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên 2 giống đậu tƣơng AK02 và giống DT96. - AK02: giống đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp chọn lọc cá thể từ giống đậu tƣơng vàng Mƣờng Khƣơng và đƣợc công nhận giống chính thức năm 1987 [9]. Giống đƣợc trồng 3 vụ trong năm. Vùng đất gieo trồng thích hợp: đồng bằng, trung du và miền núi phía Bắc. Một số đặc tính chủ yếu nhƣ chiều cao cây từ 30-40 cm, ít phân cành, thuộc nhóm ngắn ngày. Thời gian sinh trƣởng (TGST) từ 75-85 ngày. Hạt có dạng bầu dục hơi tròn, màu hạt vàng nhạt. Khối lƣợng 1000 hạt đạt khoảng 100-120g. Năng suất trung bình đạt khoảng 10-12 tạ/ha. Khả năng chống chịu sâu bệnh và rét trung bình [9]. - DT96 do Viện Di truyền nông nghiệp (DTNN) cung cấp. Sau 7 năm khảo nghiệm liên tục (1998-2004) tại nhiều vùng sinh thái khác nhau, Viện DTNN đã sản xuất thành công giống đậu tƣơng chịu hạn DT96. Giống mới đƣợc Bộ NN&PTNT công nhận chính thức là giống Quốc gia vào tháng 72004. Giống đƣợc tạo bằng phƣơng pháp lai hữu tính giữa 2 giống phổ biến trong sản xuất là DT90 và DT84. DT96 kết hợp đƣợc nhiều đặc tính tốt của 2 giống, chịu nóng tốt nhƣ DT84 và chịu lạnh nhƣ DT90. Ngoài ra còn một số đặc điểm ƣu việt hơn DT84 và DT90 nhƣ chất lƣợng hạt thƣơng phẩm, tính kháng sâu bệnh [29]. DT96 có TGST ngắn (90 - 98 ngày), phù hợp trồng thuần. Cây cao 45 - 58cm, thân có 12 - 15 đốt, sinh trƣởng hữu hạn, phân cành vừa phải, lá hình tim nhọn, màu xanh sáng, lông nâu. Hạt màu vàng sáng, rốn hạt màu trắng, hạt to, khối lƣợng 1000 hạt đạt 190 - 220g, tỉ lệ protein 42,86%, lypit 18,34% [5]. 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xác định áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu (P) đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Schardakov & Grodzinsk (1981), tính giá trị bằng phƣơng trình Van– Hoff: P = i×C×R×T Trong đó: P: Áp suất thẩm thấu (atm) C: Nồng độ mol/l của dung dịch (M) R: Hằng số khí (R=0,0821) T: Nhiệt độ tuyệt đối (K) i: Hệ số điều chỉnh sự phân ly (Đối với dung dịch saccarôzơ i= 1) 2.2.2. Lập đường chuẩn prolin * Xây dựng đường chuẩn prolin Cân 10 mg prolin tinh khiết hoà tan trong 100ml nƣớc, ta đƣợc dung dịch gốc (gọi là dung dịch B) nồng độ 0,1 mg/ml (hoặc 100 g/ml). Lấy 5 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 đến 5, cho các chất tham gia phản ứng nhƣ sau. Pha 10ml dung dịch A có nồng độ lần lƣợt là 20, 40, 60, 80, 100 ( g/ml) nhƣ sau: 1 10 ml dung dịch A ( g/ml) 20 V nƣớc (ml) 8 VB (ml) 2 0,45 2 40 6 4 0,81 3 60 4 6 1,17 4 80 2 8 1,52 5 100 0 10 1,88 STT OD 19 Sau đó đo OD các dãy dung dịch prolin chuẩn ở bƣớc sóng 520nm trên máy UV- Visible Spectrophotometer, UV- 2450 do h·ng SHIMADZU- Mü s¶n xuÊt. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê, sau đó lập đƣờng chuẩn bằng phần mềm Excel, thu đƣợc đƣờng chuẩn sau: Mật độ OD520 2 y = 0.0179x + 0.095 2 R = 0,99 1.5 1 0.5 0 0 20 40 60 Đường chuẩn prolin 80 100 120 Nồng độ prolin (ug/ml) Sau khi xây dựng đƣờng chuẩn để tính prolin là: Y= 0,0179X + 0,095 (R2=0,99) Trong đó: Y: Hàm lƣợng prolin ( g/ml) X: Giá trị mật độ quang học đo đƣợc ở bƣớc sóng 520nm R2: Hệ số tƣơng quan 2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao công nghệ - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, hạt đƣợc gieo trong dung dịch đƣờng theo phƣơng pháp xác định khả năng chịu hạn của Volcova: