Tài liệu Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống cây hoa cúc (trắng tuyết, mai vàng, lan tím, chi đỏ và đỏ cờ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Header Page 1 of 161. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ------------------------ NGUYỄN THỊ CHUNG ANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH NĂM GIỐNG CÚC (TRẮNG TUYẾT, MAI VÀNG, LAN TÍM, CHI ĐỎ VÀ ĐỎ CỜ) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI, 2016 Footer Page 1 of 161. Header Page 2 of 161. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ------------------------ NGUYỄN THỊ CHUNG ANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH NĂM GIỐNG CÚC (TRẮNG TUYẾT, MAI VÀNG, LAN TÍM, CHI ĐỎ VÀ ĐỎ CỜ) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học TS. La Việt Hồng HÀ NỘI, 2016 Footer Page 2 of 161. Header Page 3 of 161. LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: TS. La Việt Hồng, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 là người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài và hoàn thành khoá luận này. Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. Ngoài ra, để hoàn thành đề tài này tôi cũng đã nhận được những sự chỉ bảo cả về kiến thức chuyên ngành cũng như phương pháp tiến hành thí nghiệm từ tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, khoa sinhKTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Tôi xin được cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi giúp tôi có thể vượt qua những khó khăn để hoàn thành được đề tài này. Hà nội, ngày…..tháng 5 năm 2016 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Chung Anh Footer Page 3 of 161. Header Page 4 of 161. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: tài “Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống cây hoa cúc (Trắng tuyết, Mai vàng, Lan tím, Chi đỏ và Đỏ cờ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La Việt Hồng hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả của các tác giả khác. Hà nội, ngày…..tháng 5 năm 2016 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Chung Anh Footer Page 4 of 161. Header Page 5 of 161. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Footer Page 5 of 161. Agar Thạch BAP 6 - Benzyl amino purin IAA Beta - Indole - acetic acid IBA Indode - 3 - Butyric acid MS Murashige and Skoog, 1962 NAA Naphthalene acetic acid Header Page 6 of 161. DANH MUC BẢNG Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh của giống cúc Trắng tuyết ................................................. 15 Bảng 3.1.2. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi của giống cúc Mai vàng ............................................ 18 Bảng 3.1.3. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh của giống cúc Lan tím ....................................................... 21 Bảng 3.1.4. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi của giống cúc Chi đỏ ................................................. 24 Bảng 3.1.5. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh của giống cúc Đỏ cờ .......................................................... 27 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA 0,3 mg/l đến sự ra rễ của các giống cúc Lan tím, Trắng tuyết, Đỏ cờ, Mai vàng, Chi đỏ ................................... 31 Footer Page 6 of 161. Header Page 7 of 161. DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của Trắng tuyết ............................. 14 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh của Mai vàng ..................................................... 17 Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh của Lan tím ........................................................ 20 Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh của Chi đỏ.......................................................... 23 Hình 3.5. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa và NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh của Đỏ cờ........................................................... 26 Hình 3.6. Chiều dài rễ của Trắng tuyết sau 7 ngày nuôi cấy ............ 32 Hình 3.7. Rèn luyện cây cúc in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên ........................................................................................................... 33 Footer Page 7 of 161. Header Page 8 of 161. MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 3.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro .......................................................... 2 3.2. Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh ............................................................... 2 3.3. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên........................... 3 4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3 NỘI DUNG ....................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4 1. Giới thiệu về cây hoa cúc .............................................................................. 4 1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc .............................................................................. 4 1.2. Vị trí phân loại ........................................................................................... 4 1.3. Đặc điểm thực vật học cây hoa cúc............................................................ 4 1.4. Đặc điểm sinh thái học của cây hoa cúc: ................................................... 5 1.5. Giá trị kinh tế của cây hoa cúc ................................................................... 5 2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam ........................... 6 2.1. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới ............................................. 6 2.2. Tình hình sản xuất hoa cúc tại Việt Nam ................................................... 6 3. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam trong lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào ..................................................................................... 7 3.1.Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới .......................................... 7 3.2. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc ở Việt Nam ......................................... 9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 11 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ................................................................. 11 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................... 11 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 11 2.1.3. Trang thiết bị và dụng cụ ...................................................................... 11 2.1.4. Môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật........... 11 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 12 Footer Page 8 of 161. Header Page 9 of 161. 2.2.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 12 2.2.2. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm ......................... 13 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 14 3.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của năm giống cúc ....................... 14 3.2. Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh ............................................................. 31 3.3. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên......................... 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36 Footer Page 9 of 161. Header Page 10 of 161. MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ở Việt Nam hiện nay, cơ cấu cây trồng nông nghiệp chuyển đổi nhanh chóng trong cơ cấu thị trường theo hướng phát triển trồng và xuất khẩu hoa cây cảnh, đây là một hướng đi mới và mang lại hiệu quả kinh tế lớn. Trong các loài hoa cắt cành hiện nay thì hoa cúc là một loài hoa được ưa chuộng và trồng phổ biến ở nước ta chỉ đứng sau hoa hồng (Linh Xuan Nguyen, 1998) [25]. Hoa cúc có nhiều loại với nhiều màu khác nhau, cúc trắng, cúc đỏ, cúc tím, cúc nâu…Là loại cây trồng đa dạng về loài, màu sắc, dễ trồng, dễ sản xuất, vận chuyển và tiêu thụ nên nó được nhiều nhà vườn lựa chọn đưa vào sản xuất. Ngoài tác dụng làm cảnh, trang trí hoa cúc còn rất có lợi cho sức khỏe. Nó được coi là một loại thảo dược có tác dụng rất tốt trong việc chữa bệnh. Theo Đông y, hoa cúc có vị ngọt, hơi đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, giải cảm, giáng hỏa, mát gan, làm sáng mắt… Thực tế việc trồng hoa cúc ở nước ta đã được thực hiện trên quy mô lớn tại các làng hoa đặc biệt là ở các vùng như Đà Lạt, Mê Linh…. với diện tích lên tới hàng nghìn ha. Ví dụ như: Diện tích trồng hoa của Hà Nội năm 1995 là 500 ha, tăng 12,8 lần so với năm 1990 [3], đến năm 2001, đạt tới 867 ha [15]. không chỉ cung cấp nhu cầu về hoa trong nước mà còn xuất khẩu sang các nước khác. Giải quyết công ăn việc làm cho rất nhiều nhân công, góp phần tích cực vào việc xóa đói giảm nghèo. Trong tương lai nhu cầu về hoa cúc sẽ còn tiếp tục tăng đồng nghĩa với việc quy mô sản xuất cây hoa cúc sẽ ngày càng được mở rộng. Kéo theo đó là nhu cầu giống cây có chất lượng với một số lượng lớn. Tuy nhiên việc tạo giống ngoài tự nhiên bằng các phương pháp thủ công như gieo hạt (chỉ áp dụng được với những giống cúc trồng bằng hạt), tách cây con từ rễ, giâm cành mang lại hiệu quả thấp, phụ thuộc nhiều vào điều kiện tự Footer Page 10 of 161. 1 Header Page 11 of 161. nhiên dẫn đến không đáp ứng đủ nhu cầu về giống cây. Trong khi đó phương pháp nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (in vitro) cho hiệu quả cao hơn hẳn. Đây là phương pháp kỹ thuật khoa học nhằm tạo ra các giống cây con sạch bệnh với số lượng lớn trong một thời gian ngắn ở điều kiện vô trùng, tuy chi phí đầu tư khá cao nhưng nếu sản xuất với quy mô và số lượng giống lớn thì giá thành sản phẩm lại phù hợp với khả năng chi trả của người trồng hoa. Xét về hiệu quả kinh tế thì đây là một phương pháp tối ưu. Nó có thể giải quyết được các mặt hạn chế mà các phương pháp thủ công gặp phải. Ở Việt Nam hiện nay, phương pháp này cũng đã được áp dụng trên đối tượng cúc và cho hiệu quả tốt. Một vài giống cúc đã được nhân giống in vitro thành công và thích nghi tốt với điều kiện ngoài đồng ruộng. Từ những lý do trên chúng tôi quyết định tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống cúc (Trắng tuyết, Mai vàng, Lan tím, Chi đỏ và Đỏ cờ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật” 2. Mục đích nghiên cứu Tiến hành các thí nghiệm hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro của một số giống cúc. 3. Mục tiêu nghiên cứu 3.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro Ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi. Ảnh hưởng của BAP kết hợp nước dừa đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi. Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi. 3.2. Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ ở cây invitro Footer Page 11 of 161. 2 Header Page 12 of 161. 3.3. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Ý nghĩa lý luận Cung cấp tư liệu khoa học cho nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô các giống cúc Trắng tuyết, Mai vàng, Lan tím, Chi đỏ và Đỏ cờ. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tìm ra môi trường tối ưu để nhân nhanh một số giống cúc (Trắng tuyết, Mai vàng, Lan tím, Chi đỏ và Đỏ cờ) phục vụ cho việc nhân giống đáp ứng nhu cầu trên thị trường. Footer Page 12 of 161. 3 Header Page 13 of 161. NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về cây hoa cúc 1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc Tên khoa học (Chrysanthenum sp.) cây hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và một số nước Châu Âu (nó được người Trung Quốc, Nhật Bản và các cụ ta xưa rất quý trọng, coi nó những người bạn tâm tình, một thứ hoa quân tứ, dáng hoa đẹp, mùi thơm dịu và kín đáo. Chrysanthemum được trồng đầu tiên tại Trung Quốc để làm thảo dược từ thế kỷ 15 trước Công nguyên. Ban đầu cây có hoa nhỏ và màu vàng. Sau nhiều thế kỷ gieo trồng, số lượng giống tăng đáng kể. Sách viết về hoa cúc thời nhà Tống ghi chép được 35 giống, đến thời nhà nhà Nguyên đã tăng lên thành 136 giống. Sách Bản thảo cương mục của Lý Thời Trân thời nhà Minh liệt kê hơn 900 giống cúc. Ngày nay có hơn 3.000 giống ở Trung Quốc. Ngày nay, hoa Cúc được trồng rộng rãi trên thế giới như: Đức, Pháp, Nhật bản, Mỹ, Nga, singapore, Isaren…[1], [13]. Ở Việt Nam đến đầu thế kỷ XIX, hoa cúc đã được trồng thành các vùng chuyên canh. Hiện nay Đà Lạt có diện tích trồng hoa cúc lên tới 5000 ha; Hà Nội đã hình thành các vùng chuyên canh như Tây Tựu (Từ Liêm) diện tích xấp xỉ 200 ha, quận Tây hồ diện tích 70 ha, đảm bảo cung cấp hoa cho người tiêu dùng. 1.2. Vị trí phân loại Hoa cúc được xếp vào: ngành: Angiospermatophyta, lớp: Dicotyledones, bộ: Asterales, họ: asteraceae, chi: chrysanthemum sp. 1.3. Đặc điểm thực vật học cây hoa cúc - Rễ: rễ chùm, mọc cạn, theo chiều ngang, đâm sâu khoảng 10-20 cm. Có 2 loại rễ là rễ mầm và rễ thứ sinh. Footer Page 13 of 161. 4 Header Page 14 of 161. - Thân: dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhưng thân gỗ thấp bé. - Lá: lá đơn, không có lá kèm, mọc so le. Bản lá có xẻ thùy hình răng cưa to, sâu. Phiến lá mỏng, to, màu xanh đậm, gân lá hình mạng. - Hoa: có màu vàng đậm, thích nghi với thụ phấn nhờ côn trùng. - Quả: quả đóng (quả khô không mở), 1 hạt (phát triển từ 1 lá noãn). Hạt có nội nhũ tế bào. 1.4. Đặc điểm sinh thái học của cây hoa cúc: - Nhiệt độ: thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là 150C - 20°C . Ở thời kì cây con và thời kì ra hoa cây có yêu cầu nhiệt cao hơn [13]. - Ánh sáng: ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến sự ra hoa và phân hóa mầm hoa của cây cúc. Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm hoa sớm, cây ngắn, chất lượng hoa kém [13]. - Ẩm độ: độ ẩm đạt từ 60 - 70 % và độ ẩm không khí từ 55 - 65% là thuận lợi cho cây sinh trưởng và phát triển. Nếu độ ẩm trên dưới 80% thì cây sinh trưởng mạnh, nhưng dễ phát sinh sâu bệnh làm ảnh hưởng đến chất lượng hoa [13]. - Đất và dinh dưỡng: + Đất cung cấp nước, dinh dưỡng cho sự sống của cây. Đất phải có hàm lượng mùn lớn hơn 5%, độ pH khoảng 6 - 6,5. + Dinh dưỡng: các loại phân hữu cơ (phân chuồng, phân vi sinh, than bùn), phân vô cơ (đạm, lân, kali) … có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của hoa cúc [13]. 1.5. Giá trị kinh tế của cây hoa cúc Cúc luôn là một loại cây cảnh quan trọng nhất thế giới [19]. Từ lâu, hoa cúc được xem như một loài thảo dược có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con người. Ăn hoa cúc lâu ngày sẽ giúp làm đẹp nhan sắc, kéo dài tuổi thọ… Cả Footer Page 14 of 161. 5 Header Page 15 of 161. hoa cúc khô và tươi đều được dùng để chế biến thành các loại trà. Các thành phần hoạt chất trong tinh dầu hoa cúc là Bisabolol được coi là có tác dụng chống kích ứng, chống viêm và chống vi khuẩn. Sản xuất và kinh doanh hoa cúc đã đem lại cho người trồng hoa lợi nhuận cao. Trên mỗi sào (Bắc Bộ) đất trồng trọt với mật độ trung bình 50 cây/m2, người trồng có thể thu được từ 5 - 6 triệu đồng (giá trung bình 300 đ/bông); chi phí cho làm đất, chăm sóc, giống và các vật tư khác thì hết 1,8 2 triệu đồng. Trong khi đó trồng lúa thì thu nhập chỉ đạt 350.000 - 400.000 đ/sào [4], [7]. Ngoài ra nếu hoa được dùng xuất khẩu thì lợi nhuận còn lớn hơn nhiều. 2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam 2.1. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới Trên thế giới xuất khẩu hoa cúc đang trở thành mũi nhọn và mang lại nguồn ngoại tệ lớn cho nhiều quốc gia. Hàng năm kim ngạch giao lưu buôn bán về hoa cúc trên thế giới ước đạt tới 1,5 tỉ USD [11]. Một số nước nhập và xuất khẩu hoa cúc trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Hà Lan, Pháp, Đức, Nga, Mỹ, Xingapore, Isaren… .Trong đó dẫn đầu là Hà Lan phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm 80 nước trên thế giới với diện tích trồng cúc chiếm tới 30% tổng diện tích trồng hoa tươi. Bốn nước sản xuất chính là Hà Lan 80 triệu cành cúc mỗi năm, Colombia 600 triệu cành cúc mỗi năm, tiếp theo là Ý 500 triệu cành, và Mỹ 300 triệu cành [13]. 2.2. Tình hình sản xuất hoa cúc tại Việt Nam Ở Việt Nam diện tích trồng hoa cúc còn khá khiêm tốn, khoảng 3500 ha, tập chung chủ yếu ở các vùng trồng hoa như Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt… chủ yếu là các giống cúc nhập nội. Nhiều nhất là Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh hàng năm xuất khẩu hàng chục triệu cành hoa cúc cắt cành, cúc chậu phục vụ cho nhu cầu trong nước. Ở Hải Phòng, cúc là cây quan trọng thứ hai Footer Page 15 of 161. 6 Header Page 16 of 161. trong cơ cấu sản xuất hoa tươi. Ở các tỉnh phía nam như Đà Lạt, Huế là nơi có diện tích trồng cúc lớn nhất. Đà Lạt là vùng có khí hậu lý tưởng cho nhiều giống cúc phát triển. Hiện nay ở Việt Nam, việc nhân giống hoa cúc chủ yếu bằng phương pháp vô tính gồm hai biện pháp nhân giống bằng dâm cành và bằng nuôi cấy in vitro. 3. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam trong lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào 3.1. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới Năm 1974, Asjes và cộng sự (Hà Lan) đã chứng minh rằng có thể sử dụng nhiều bộ phận của cây hoa cúc để làm vật liệu nuôi cấy mô. Ông đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo ra các giống cúc sạch bệnh. Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện thành công bởi Fukai, Goi và Tanaka (1991) [17]. Các tác giả đã nghiên cứu phương pháp tối ưu để tạo mẫu vô trùng có tỷ lệ sống và tái sinh chồi cao nhất. Kết quả cho thấy bảo vệ chồi đỉnh cúc trước nuôi cấy 2 ngày trong điều kiện lạnh dần cứ 0,20C/phút đến -400C với 10% dimethyl sufoide và 3% glucose cho tỷ lệ sống và tái sinh chồi rất cao, có loài lên tới 100%. Năm 2007, Zhen Liu và Shanlin Gao [31] đã tiến hành nghiên cứu sự hình thành rễ cuả các giống cúc trong môi trường MS cơ bản bổ sung BAP và NAA, kết quả thu được như sau: Cảm ứng rễ và có thể quan sát rễ trong vòng 15 ngày sau khi nuôi cấy trong môi trường ½ MS bổ sung 0,2 mg/l IAA. Khi nghiên cứu tác dụng của axit gibberellic (GA3) và malein hydrazyt (MH) sau khi trồng 30 và 60 ngày đến sự phát triển hoa và năng suất của hoa cúc được trồng trong điều kiện nhà lưới, S.R. Dalal và cs (2009) [26] đã cho thấy GA3 ở nồng độ 200 ppm làm tăng chiều cao cây tối đa, thúc đẩy nhanh Footer Page 16 of 161. 7 Header Page 17 of 161. sự ra hoa, tăng đường kính của hoa, chiều dài của cuống hoa và năng suất giống hoa cúc thí nghiệm. Phun MH ở nồng độ 750 ppm làm tăng số nhánh trên cây và đường kính bông hoa. Ksenija Karlovie và cs (2004) [21] đã nghiên cứu các nồng độ khác nhau của Daminozide (B9) và Chlormequat (CCC) là những chất ức chế sinh trưởng đến sự sinh trưởng của cây hoa cúc ‘Revert’. Kết quả cho thấy Daminozide ở nồng độ 2.000 ppm có tác dụng làm giảm chiều cao cây hoa tốt nhất, số lượng chồi hoa cũng giảm đi và hiệu quả cao hơn so với việc sử dụng chất Chlormequat. Prohexadione Calcium (Pro-Ca) là chất có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp gibberellin làm giảm chiều dài tế bào của đốt thân, chiều cao cây, chậm quá trình sinh trưởng của cây và được sử dụng cho cây trồng chậu, trồng thảm… Yoon Ha Kim và cs (2010) [29] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của Prohexadione Calcium (Pro-Ca) và Daminozide (B9) đến sự sinh trưởng, phát triển của giống Cúc (MorifoliumR. cv Monalisa White) 3 tuần tuổi, phun 3 lần (mỗi lần cách nhau 7 ngày). Kết quả cho thấy ở nồng độ 400ppm Pro -Ca làm giảm chiều cao cây 30,7%, tăng đường kính thân cây, khối lượng cây và số lượng hoa không bị ảnh hưởng. Hiệu quả sử dụng của Pro-Ca cao hơn B9 và ít độc hại hơn với sức khỏe con người. Năm 2011, Kashif waseem [27] đã tiến hành nghên cứu và tìm ra môi trường có ảnh hưởng tích cực đến sự tái tạo của các giống cúc đó là môi trường MS cơ bản bổ sung IAA ở nồng độ thấp (0,1 và 0,2 mg/l) kết hợp với BAP ở nồng độ trung bình (1,0 và 2,0 mg/l). Đồng thời ông cũng tìm ra môi trường phù hợp cho sự ra rễ của chồi cúc đó là môi trường ½ MS cơ bản bổ sung với NAA ở các nồng độ (0,1; 0,2; và 0,5 mg/l) và ½ MS cơ bản bổ sung IAA ở các nồng độ tương tự. Footer Page 17 of 161. 8 Header Page 18 of 161. Năm 2012, Snjezana Keresa [28] đã tiến hành nghiên cứu sự hình thành, phát triển phôi, sự phát sinh chồi nách và sự ra rễ chồi in vitro của giống cúc Dendranthema grandiflora (Ramat.) Kitamura cv. Palisade trắng bằng việc bổ sung vào môi trường MS cơ bản benzyl aminopurine (IBA) và axit gibberellic (GA3) hoặc kinetin (Kin) và axit indole-3-acetic (IAA). Kết quả nghiên cứu cho thấy IBA và NAA được dùng để kích thích sự tạo rễ. Số lượng rễ mỗi chồi ở công thức IBA 0,1mg/l kết hợp với GA3 0,5 mg/l đã cao hơn sử dụng IBA 0,5 mg/l, nhưng IAA 2 mg/l thúc đẩy rễ dài hơn. Năm 2015, Manu Pant et al [24] đã nghiên cứu trên đối tượng cúc Mâm sôi đã đưa ra kết luận: Môi trường ½ MS cơ bản có chứa IBA phù hợp cho sự tạo rễ của chồi in vitro. 3.2. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc ở Việt Nam Ở Việt Nam, mặc dù cây hoa cúc đã được nhập nội vào nước ta từ lâu nhưng sự hiểu biết cũng như kết quả nghiên cứu về cây hoa này còn chưa nhiều. Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu thường tập trung vào việc tập hợp các kinh nghiệm trồng hoa và các phương pháp nhân giống. Từ năm 1992, Trung tâm nghiên cứu và Phát triển Hoa – Cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp Bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Tiến hành thu thập, khảo sát và đánh giá một số giống cúc mới, kết quả là từ 2/1993 đến tháng 2/1999, giống cúc CN93 và CN98 đã được Hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp cho phép khu vực hóa, đến tháng 4/1996 và 9/2000 lần lược 2 giống cúc CN93 và CN98 đã được công nhận là giống cúc quốc gia. Năm 1998, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự [12] đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống cúc đang Footer Page 18 of 161. 9 Header Page 19 of 161. được trồng phổ biến ở miền Bắc nước ta như CN93, vàng Đài Loan, đỏ Hà Lan. Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1998) [12] để nâng cao tỷ lệ sống và ra rễ của cành giâm trong nhân giống vô tính có thể sư dụng IBA hoặc α – NAA với nồng độ 1000 ppm bằng cách nhúng phần gốc của cành khoảng 0,5 – 1 cm vào dung dịch thuốc từ 3 - 5 giây rồi cắm vào đất hoặc cát. Nguyễn Thị Diệu Hương, Dương Tấn Nhựt (2004) [5] khi nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống cây hoa cúc (Chrysanthemum indicum L.) sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong môi trường ½ MS đã bổ sung BAP kết hợp với NAA, IAA, IBA theo sự biến thiên của các chất kích thích sinh trưởng. Kết quả cho thấy trong môi trường ½ MS có bổ sung NAA (0,2 - 0,5 mg/l), IBA (0,2 - 0,5 mg/l) đều tạo rễ cho chồi cây hoa cúc tốt hơn trong môi trường ½ MS có bổ sung IAA (0,2 - 0,5 mg/l). Để nâng cao chất lượng của các cây giống hoa cúc nuôi cấy in vitro thông qua nuôi cấy thoáng khí, Dương Tấn Nhựt và cs (2005) [9] tiến hành thí nghiệm nuôi cấy cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) trong các hộp nhựa tròn có đục lỗ và hộp không đục lỗ. Kết quả cho thấy trọng lượng tươi và chiều cao cây trong hộp 1 lỗ thoáng khí cao hơn rõ ràng so với cây được cấy trong hộp không thoáng khí, có tỉ lệ sống cao, sinh trưởng, phát triển tốt khi ra vườn ươm. Năm 2007, Trần Thị Thu Hiền và cs [6] đã nghiên cứu phương pháp nhân giống hoa cúc CN97 bằng nuôi cấy mô tế bào đã đưa ra kết luận : Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA là môi trường ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh phù hợp nhất cho chồi cúc in vi tro. Năm 2015, Đặng Thị Tố Nga [10] đã nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật phát triển hoa cúc tại thành phố Thái Nguyên kết quả thu được như sau: phun GA3 100ppm + phân bón lá Yogen No.2 2500ppm có tác dụng tăngchiều cao cây và một số cành cấp 1, tăng khả năng chống chịu sâu bệnh cho giống cúc Vàng Thược Dược trong vụ Đông Xuân. Footer Page 19 of 161. 10 Header Page 20 of 161. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Chồi đỉnh năm giống cúc Trắng tuyết, Mai vàng, Lan tím, Chi đỏ và Đỏ cờ thu từ làng hoa Mê Linh- Hà Nội. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, Khoa Sinh- KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 2.1.3. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: Cân kĩ thuật, tủ lạnh sâu, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, máy cất nước 2 lần, buồng cấy vô trùng, máy khuấy từ ra nhiệt, cân phân tích, tủ ấm, Micropipet Jinson. Dụng cụ: Cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50ml), giấy báo, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo… 2.1.4. Môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật - Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962) [30] gồm các khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin…thường được sử dụng trong nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật (phụ lục). - Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng: BAP (6 - Benzyl amino purin); NAA (Naphthalene acetic acid) của hãng Dulchefa, Hà Lan. - Nước dừa. - Các thành phần khác: +Đường Saccarose: 30 g/l của công ty TNHH Đức Lộc cung cấp. +Agar: 7 g/l của công ty Long Hải cung cấp. Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và HCl 1N) trước khi khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 1170C, 1 atm trong 15 phút. Footer Page 20 of 161. 11