Tài liệu Tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm của một số chất kháng sinh và kháng ung thư từ xạ khuẩn biển việt nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM THANH HUYỀN SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA MỘT SỐ CHẤT KHÁNG SINH VÀ KHÁNG UNG THƯ TỪ XẠ KHUẨN BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2016 1 Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Gia Hy Viện Công nghệ sinh học 2. TS. Phí Quyết Tiến Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại Viện Công nghệ sinh học Vào hồi …h … , ngày … tháng … năm 2016 Có thể tìm thấy luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Công nghệ sinh học - Trang web của Bộ GD&ĐT 2 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, chất kháng sinh và kháng ung thư vẫn được xem là nhóm thuốc thiết yếu trong y học, có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh hoặc ức chế tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh không theo chỉ định dẫn đến sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các kháng sinh mới làm cho con người đang phải đối mặt với “thời kỳ hậu kháng sinh”. Việt Nam và nhiều nước trên thế giới đang phải đối mặt với các loại bệnh nhiễm khuẩn mới và bệnh do tác nhân kháng thuốc do sử dụng thuốc kháng sinh một cách tùy tiện. Bên cạnh đó, môi trường sống của con người đang bị ô nhiễm nghiêm trọng nên gia tăng các loại bệnh ung thư. Vì vậy, việc tìm kiếm các loại kháng sinh mới và các thuốc kháng tế bào ung thư được các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm, đặc biệt là các loại được sản xuất từ các chủng xạ khuẩn biển. Trong mục tiêu chung là phát hiện và phát triển các sản phẩm có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển nhằm ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người, chúng tôi tiến hành đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm của một số chất kháng sinh và kháng ung thư từ xạ khuẩn biển Việt Nam” với các mục đích và nội dung chính sau đây: 1. Mục đích - Sàng lọc được tập hợp các chủng xạ khuẩn biển Việt Nam có khả năng sinh chất kháng sinh và kháng ung thư. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn biển được lựa chọn, xác định tính chất hóa lý, cấu trúc hóa học và khả năng ứng dụng của các các hợp chất kháng sinh và kháng ung thư tổng hợp bởi xạ khuẩn. 2. Nội dung nghiên cứu - Sàng lọc các chủng xạ khuẩn từ các vùng biển có khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và kháng tế bào ung thư. - Xác định đặc điểm sinh học, đặc điểm phân loại của các chủng xạ khuẩn lựa chọn. - Nghiên cứu điều kiện lên men và thu nhận chất kháng sinh từ các chủng đã được tuyển chọn trong. 3 - Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch, tính chất hóa lý và khả năng kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư của chất kháng sinh. - Bước đầu nghiên cứu cấu trúc của chất kháng sinh thu nhận được. 3. Những đóng góp mới của luận án - Luận án thu nhận được tập hợp 70 chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư phục vụ cho sàng lọc các chất kháng sinh và góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển của Việt Nam. - Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về chủng xạ khuẩn biển Streptomyces variabilis HP411 phân lập ở Việt Nam (phân loại, lên men, tách chiết, tinh sạch chất kháng sinh; dự đoán cấu trúc kháng sinh; đánh giá khả năng kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư của chất kháng sinh thu được). 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 156 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (24 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp (17 trang); Chương 3: Kết quả (41 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu (15 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình công bố (2 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang gồm 9 tài liệu tiếng Việt, 138 tài liệu tiếng Anh và 02 tài liệu trên các trang mạng); Summary (11 trang); Phụ lục (25 trang). CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về vi sinh vật biển 1.2. Xạ khuẩn biển và các chất có hoạt tính dược học từ xạ khuẩn biển 1.2.1. Xạ khuẩn biển 1.2.2. Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển 1.3. Đặc tính của các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển 1.3.1. Nghiên cứu thu nhận các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 1.3.2. Nghiên cứu tách chiết và xác định đặc trưng của chất kháng sinh và kháng ung thư 1.3.3. Nghiên cứu phân tích cấu trúc chất kháng sinh 4 1.3.4. Nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng sinh và kháng ung thư từ vi sinh vật biển CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu nước và bùn được thu thập từ các vùng ven biển Việt Nam; Các chủng vi sinh vật kiểm định nhận từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học; Các dòng tế bào ung thư được cung cấp từ Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Khoa Molecular Oncology thuộc Viện Ung thư Chennai, Ấn Độ. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 1. Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu (Egorov, 1976). 2. Xác định hoạt tính kháng sinh: sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch của Barry (Barry và Thornsberry, 1985); phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sự tăng trưởng thấp nhất của kháng sinh với vi sinh vật (Jennifer, 2006) và nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MBC) của chất kháng sinh (Jennifer, 2006). 3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào phương pháp MTT (Van và Vlietlinck, 1991) và phương pháp SRB (Likhiwitayawuid et al., 1993) với nguyên lý đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào thử nghiệm in vitro. Các dòng tế bào được nuôi cấy theo phương pháp của Skehan và cs (1991). 4. Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn theo Waskman (1962); Tresner và Backus (1963) và định tên xạ khuẩn theo Sổ tay phân loại vi sinh vật của Bergey (Stanley et al., 1989) và Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) (Shirling và Gottlieb, 1966). 5. Phân loại vi sinh vật bằng phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA theo Sambrook và cộng sự (1989); So sánh độ tương đồng bằng phần mềm CLUSTL_X (Thompson et al., 1997); xác định khoảng cách di truyền theo Kimura (1980), phương pháp Neighbor-joining (Saitou và Nei, 1987), 5 phân tích Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với 1000 mẫu thử (Felsenstein, 1985). 6. Nghiên cứu điều kiện lên men kháng sinh thích hợp cho các chủng xạ khuẩn theo Cornick và McGuire (1962); Yu (2008); Gao (2009); Krishnaraj và Mathivanan (2009). Tối ưu hóa môi trường theo phương pháp RSM với thiết kế phức hợp tại tâm (CCD-Central Composit design) (www.DX7.com). 7. Tách chiết chất kháng sinh bằng dung môi ethyl acetate (Liu et al, 1986). 8. Xác định tính chất hóa lý các chất có hoạt tính kháng khuẩn từ dịch lên men xạ khuẩn theo các phương pháp sắt ký, phân tích cấu trúc bằng các phổ IR, LC-MS, ESI-MS, HPLC và NMR theo Nguyễn Đình Triệu (2001). CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Sàng lọc xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh 3.1.1. Sàng lọc xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh Từ 97 chủng xạ khuẩn phân lập được có 70 chủng có hoạt kháng khuẩn chiếm 72,16%, trong đó ức chế vi khuẩn B. subtilis ATCC 6633 cao nhất chiếm 47%, sau đó vi khuẩn E. coli ATCC 11105 chiếm 44,3% và nấm men C. albicans 10231 chiếm 17,5% số chủng. Trong đó, lựa chọn 16 chủng có hoạt tính mạnh và kháng từ 2 chủng vi sinh vật kiểm định trở lên dùng cho nghiên cứu tiếp theo với định hướng sàng lọc được các hoạt chất sinh học mới ứng dụng trong y dược. 3.1.2. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh cao Trong các chủng có khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật kiểm định, 16 chủng có hoạt tính mạnh và kháng từ 2 chủng vi sinh vật kiểm định trở lên được lựa chọn nghiên cứu tiếp theo với định hướng sàng lọc được các hoạt chất sinh học ứng dụng trong y dược 3.2. Đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn biển 3.2.1. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn 6 Dựa trên quan sát màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, sắc tố tan trên 7 môi trường ISP và hình thái cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử để phân loại đã nghiên cứu đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy của 16 chủng xạ khuẩn được lựa chọn. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 16 chủng xạ khuẩn như khả năng sử dụng nguồn carbon, khả năng sử dụng nguồn nitơ, ảnh hưởng của nhiệt độ và pH, ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl của 16 chủng xạ khuẩn. 3.2.2. Phân loại các chủng xạ khuẩn biển a. Phân loại theo đặc điểm sinh học Đặc điểm sinh học của 16 chủng xạ khuẩn lựa chọn được so sánh các chỉ tiêu phân loại theo các Khóa định tên loài xạ khuẩn của Nomomura (1976), Khoá phân loại Gause (1983) và Bergey’s (1989) cho thấy, các chủng nghiên cứu phần lớn thuộc chi Streptomyces (15 chủng) và 1 chủng thuộc chi Nocardiopsis. Kết quả định tên loài các chủng xạ khuẩn biển như sau: (1) Chủng HLĐ3.16 có đặc điểm giống loài S. autotrophicus, dạng chủng aa-1-1; ISP 5011 nhóm A-2; (2) Chủng NA1132 giống loài S. rutgersensis dạng chủng là IMRU 3350, ký hiệu ISP 5077, nhóm A- 9; (3) Chủng NA1134 giống loài S. finlaryi, ký hiệu ISP 5218, nhóm B-12; (4) Chủng NA113 giống loài S. scabies dạng chủng là IMRU 3018, ký hiệu ISP 5058, nhóm B-4; (5) Chủng NA115 giống loài S. tendae dạng chủng ETH 11313, ký hiệu ISP 5101, nhóm A-10; (6) Chủng NA116 giống loài S. galbus, ký hiệu ISP 5089, nhóm B-5; (7) Chủng HP112 gần giống với chủng chuẩn S. litmocidini ISP 5164, dạng chủng 1823155, thuộc nhóm A-8; (8) Chủng HP411 gần giống với chủng chuẩn S. variabilis ISP 5179 thuộc nhóm A-5; (9) Chủng HPN11 gần giống với chủng chuẩn S. griseoincanatus ký hiệu ISP 5274, nhóm B12; (10) Chủng HPX12 giống loài S. griseorubens dạng chủng P-638, ISP 5160; (11) Chủng VD111 gần giống với chủng chuẩn S. albogriseolus ISP 5003, nhóm A-2; (12) Chủng VD112 gần giống với cả 2 chi Streptomyces và Nocardiopsis, do đó cần xác định trình tự gen của chủng để có thể định tên đến chi, loài cụ thể; (13) Chủng VD114 giống với loài S. achromogenes, dạng chủng Z-4-1, ký hiệu ISP 5014 nhóm A-1; 7 (14) Chủng VD115 giống với loài S. eurythermus, ký hiệu ISP 5028 nhóm A-1; (15) Chủng C141 giống loài S. matensis, ký hiệu ISP 5188, nhóm A13 và (16) Chủng TB5.3 mang nhiều đặc điểm giống với chủng chuẩn S. viridodiastaticus ISP 5249, thuộc nhóm A-5. b. Phân loại theo phân tích trình tự gen 16S rDNA Kết quả phân loại phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, trong số các chủng nghiên cứu có 7 chủng có độ tương đồng <90% và 8 chủng có độ tương đồng >98% đến loài thuộc chi Streptomyces và 1 chủng thuộc chi Nocardiopsis. Như vậy, kết hợp cả đặc điểm sinh học và phân tích trình tự gen đã cho kết quả định tên đến loài được 9 chủng xạ khuẩn như sau: (1) chủng NA113 được định tên là Streptomyces scabiei NA113, (2) chủng NA115 định tên là S. tendae NA115, (3) chủng NA116 định tên là S. coelicoflavus NA116, (4) chủng HP411 định tên là S. variabilis HP411; (5) chủng HPN11 định tên là S. griseoincarnatus HPN11, (6) chủng HPX12 định tên là S. griseorubens HPX12, (7) chủng VD11 định tên là S. albogriseolus VD111, (8) chủng TB5.3 định tên là S. viridodiastaticus TB5.3 và (9) chủng VD112 đinh tên là Nocardiopsis sp. VD112. Các chủng này được sử dụng nghiên cứu tiếp. 3.3. Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 3.3.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp Các môi trường lên men sinh tổng hợp kháng sinh được lựa chọn cho các chủng như sau: - MT7 (g/l): Glucose 5, tinh bột tan 10 và peptone 4, thích hợp cho chủng NA113. - A4H (g/l): Glucose 10 và bột đậu tương 15, thích hợp cho các chủng NA115 và C141. - M1ASW(g/l): Tinh bột tan 10, cao men 4, và pepton 4, thích hợp cho các chủng HP411, HPN11, HPX12, VD111 và TB5.3. Các chủng được nhân giống trong môi trường M1ASW và ISP2, tỷ lệ tiếp giống 5% ở 48 giờ nuôi, lên men trong bình với 20% môi trường lên men so với thể tích bình trên máy lắc 220 v/phút trong 120 giờ. 8 3.3.2. Thu nhận chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn Dịch lên men các chủng xạ khuẩn được chiết trong dung môi ethyl acetate có khả năng chiết được chất kháng khuẩn cao nhất với tỷ lệ dung môi ethyl acetate và dịch lên men là 2:1. 3.3.3. Hoạt tính sinh học của các chất kháng sinh sau khi tách chiết a. Hoạt tính kháng vi sinh vật Kết quả xác định hoạt tính kháng sinh của các chất kháng sinh thô (Bảng 3.13) cho thấy, ngoài chủng C141, các chủng khác đều có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế cả vi khuẩn kháng kháng sinh và nấm Candida albicans. Bảng 3.13. Hoạt tính kháng sinh của chất thô các chủng xạ khuẩn với vi sinh vật kiểm định VSV kiểm định Vòng kháng khuẩn (mm) NA 113 NA 115 HP 411 25 24 40 20 20 21,9 0 43,4 22,7 17,4 31,2 0 32,6 Salmonella typhy ATCC 14028 9 0 0 0 0 0 0 0 Salmonella typhy IFO 14193 15 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B. subtilis ATCC 6633 Enterococcus faecalis ATCC 29212 E. aerogenes ATCC 13048 Alcaligenes faecallis 13,6 13,2 23,1 0 S. lutea M5 HPN HPX 11 12 VD C1 111 41 TB 5.3 17,5 18 24,6 12 0 0 0 10 14 0 0 17,6 15 24,3 B. cereus ATCC 11778 20,7 21 40 0 19,5 17,2 13 17,2 S. typhimurium ATCC 14028 21,5 0 40 0 14,8 20,8 0 24,5 E. coli ATCC 25922 16,4 17 45,3 24 19 17,7 9 22,7 A. baumannii ATCC 19606 23,7 0 40,2 19,8 20,8 16,8 0 29,1 K. pneumoniae ATCC 13883 22,4 0 44,7 18,6 20,5 19,3 0 28,6 S. aureus ATCC 29213 11,4 0 40,1 13,6 14,8 20,8 0 24,5 S. aureus (MRSA) 50,1 21,5 50,1 18,7 20,8 24,2 S. epidermidis ATCC 12228 26 22 21 20 18 19 0 28,5 9 21 9 S. epidermidis (MRSE) 17,5 0 49,5 16,3 18,2 23,8 0 21,6 Aeromonas hydrophila THWQJ 23,6 0 54,3 21,7 22,1 29,4 0 30,1 C. albicans ATCC 10231 21,9 16 17,4 16,8 0 16,8 15 44 b. Khả năng gây độc tế bào Nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các chất kháng sinh thô (Bảng 3.15) cho thấy, 5 chất của các chủng HP411, HPN11, HPX12, VD111 và TB5.3 không gây độc với dòng tế bào lành tính Hek ở giá trị 40µg/ml. Ở hàm lượng này chất thô của 2 chủng VD111 và TB5.3 có khả năng gây độc với dòng tế bào ung thư M14 và HeLa với khả năng sống sót của tế bào lần lượt là 45,05 và 22,1%; 39,40 và 38,56%. Bảng 3.15. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào giá trị IC50 từ chất kháng sinh của các chủng Ký hiệu mẫu µg/ml) Giá trị IC50 trên các dòng tế bào (µ HepG2 MCF7 RD FL Hek293 M14 HeLa NCIH 460 Chứng (+) 0,19 0,15 0,22 0,18 1,3 0,4 1,2 2,1 NA113 4,55 36,45 1,39 2,1 34,71 14,10 >40 - NA 115 4,15 >40 2,68 5,67 - - - - HP411 13,73 >40 4,41 12,6 - - >40 - HPN11 - 34,25 - - - - - - HPX12 6,01 25,08 5,53 8,83 - - - 3,93 VD111 3,72 27,99 17,94 10,97 - 26,04 14,59 - C141 2,74 30,16 21,01 20,50 TB5.3 - - - 29,56 29,93 - - - Chất kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn HPX12 có khả năng diệt tế bào hơn 90% ở nồng độ 40µg/ml, còn chủng NA113 có khả năng diệt cả tế bào lành Hek293 với khả năng sống sót 45,05% và tế bào ung thư M14 là 17,05% ở cùng nồng độ 40µg/ml. 3.3.4. Một số đặc trưng của các chất kháng sinh a. Hệ số di chuyển Rf trên sắc ký giấy 10 Rf trên sắc ký giấy của các chất kháng sinh được trình bày trên bảng 3.19 cho thấy, các chất kháng sinh có hệ số di chuyển Rf khác nhau, các chất này có thể khác nhau. Bảng 3.19. Giá trị Rf của các chất kháng sinh trên sắc ký giấy Tên chủng Giá trị Rf Sai số Tên chủng Giá trị Rf Sai số NA113 0,765 0,005 HPX12 0,85 0,02 NA115 0,825 0,005 VD111 0,78 0,01 HP411 0,92 0,01 C141 0,75 0,01 HPN11 0,86 0,01 TB5.3 0,90 0,01 b. Phân tích bằng phổ IR Kết quả đo phổ IR các chất kháng sinh với mục tiêu dự đoán cấu trúc phân tử và xác định các nhóm chức đặc trưng có mặt trong các chất thô như sau: Trong chất kháng sinh của HP411 có mặt 2 liên kết –NH và CN, chất kháng sinh của NA113 có liên kết keton, C=O, NR2, =C-H và =CH2; chất kháng sinh của VD115 có C=N, vòng benzen có nhóm halogen; HPX12 có nhóm amin vòng 5 và C-H; chất kháng sinh của VD111 có nhóm ketone, liên kết R-N=O và cis-RCH=CHR; chất kháng sinh của NA115 có liên kết C-H mạch thẳng, có nhóm aldehyde C-H và cisRCH=CHR; chất kháng sinh của C141 và HPN11 có liên kết của nhóm ketone và cấu trúc nhóm nitro. c. Tinh sạch chất kháng khuẩn trên cột trao đổi ion Kết quả đối với chủng NA113 cho thấy khả năng hấp phụ trên cột Dowex 50 H+ ở phân đoạn 8-12. Chất kháng khuẩn của HP411 có khả năng hấp phụ cao nhất ở phân đoạn 2 và 3 của cột H+, các phân đoạn sau có hoạt tính nhưng thấp. Trên cột Cl- mẫu cũng có khả năng cố định, hoạt tính ở phân đoạn 1- 5 là cao nhất, trên 23 mm. Kết quả đối với chất kháng khuẩn của chủng HPX12 cho thấy trên cột H+ phân đoạn 1-4 có hoạt tính kháng khuẩn cao >22 mm. c. Phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) Kết quả nghiên cứu phân tích bằng sắc ký lớp mỏng trên 5 hệ dung môi khác nhau thì hệ dung môi Isopropanol : Acid acetic : Nước ( 3 : 1 : 1) và 2- Butanol : Acid acetic : Nước (4 : 1: 2) phân tách rõ ràng nhất. 11 Kết quả phân tích các chất có phản ứng với các chất hiện mầu trên TLC cho thấy, trong cấu trúc của các chất tách từ các chủng xạ khuẩn HP411, HPX12, NA113 và TB5.3 có mặt các nhóm chức khác nhau như: benzophenon, antracen và thiol... (Bảng 3.24) với các giá trị Rf khác nhau trên cùng hệ dung môi theo http://www.reachdevices.com/TLC_stains.html. Bảng 3.24. Dự đoán sơ bộ các nhóm chất có mặt trong chất kháng sinh thô của 4 chủng xạ khuẩn Dự đoán nhóm liên kết qua phản ứng màu Chất thô của các chủng xạ khuẩn NA113 UV: Benzoph enone, Antrace ne + KMnO4 + (alcohol, ether, ester, alkene, alkyne, ketone, alkyl aromatic, carboxylic acid, amine, amide): màu nâu- nhóm chất 1 KMnO4 + (thiols, phosphines): không màu Iodine (chuyển màu nâu) Nynhydrin + R2CH-NH2= Màu + R2C=O Cả 2 nhóm chất Nhóm R-SH Nhóm -NH2, có nhóm glutamin, có -COOH Nhóm –NH, có vòng benzen, COOH HP411 + Cả 2 nhóm chất Nhóm R-SH HPX12 + Nhóm chất 1 Nhóm R-SH Có liên kết threonine + Nhóm chất thiols hoặc phosphines Nhóm R-SH Có nhóm lysine (-NH2, -COOH, -NH2) TB5.3 Tổng hợp các nghiên cứu trên cho thấy, trong chất kháng sinh thô của các chủng xạ khuẩn có nhiều hơn một chất. Với các ưu điểm của HP411 trong tách chiết cũng như hiệu quả diệt vi sinh vật gây bệnh và gây độc các dòng tế bào ung thư nên được lựa chọn nghiên cứu tiếp. 3.4. Nghiên cứu lên men thu nhận chất kháng sinh của chủng HP411 3.4.1. Tối ưu hóa môi trường lên men 12 Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, chọn miền khảo sát được trình bày như trong bảng 3.25 để tối ưu môi trường lên men chủng HP411. Bảng 3.25. Các yếu tố biến đổi của thành phần môi trường lên men Biến ảnh hưởng Nồng độ tinh bột tan Nồng độ cao nấm men Nồng độ pepton Ký hiệu X1 Đơn vị g/l -α 8,32 X2 g/l X3 g/l -1 9 Mức 0 10 +1 11 +α 11,68 2,32 3 4 5 5,68 3,32 4 5 6 6,68 Sau khi nhập số liệu thí nghiệm vào phần mềm tối ưu DX7, thu được kết quả phân tích số liệu, thiết lập được phương trình tối ưu với giá trị tính hoạt tính kháng khuẩn là Y như sau: Y = 33,32 + 0,11*A + 1,52*B – 0,24*C + 0,31*A*B + 0,39*A*C – 2,20*A2 – 1,51*B2 – 0,78*C2 Hình 3.11. Bề mặt đáp ứng có hàm lượng chất kháng khuẩn (khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định) tương quan với các biến. A. Sự tương tác giữa tinh bột tan và pepton; B. Peptone và cao nấm men; C. giữa cao nấm men và tinh bột tan. Như vậy, kết quả thực nghiệm cho thấy giá trị “Model-F-value” là 10,15 và mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,94% (p=0,0006), mô hình hoàn toàn tương thích với thực nghiệm (p= 0,5708). Khảo sát tác động cho thấy nồng độ cao nấm men có tác động rất lớn tới hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn HP411. Kết quả phân tích ANOVA cho thấy giá trị R2 là 0,9013 gần bằng 1, chứng tỏ giá trị hoạt tính kháng sinh thu được từ thực nghiệm gần với giá trị dự đoán của mô hình. 13 Hoạt tính kháng khuẩn (mm) Phương án tối ưu nhất là số 32 trong 39 phương án, hoạt tính kháng sinh đạt được theo mô hình tối ưu là 33,70 mm, với thành phần môi trường (g/l) là: Tinh bột tan 10,01; cao nấm men 4,61 và peptone 4,65. Kết quả này đã được kiểm chứng với hoạt tính đạt được là 34,6mm. 3.4.2. Động thái quá trình lên men Kết quả nghiên cứu động thái quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh chất kháng sinh của chủng HP411 trên môi trường M1ASW-32 đã được tối ưu (Hình 3.15 và 3.16) cho thấy, sinh khối đạt cao nhất ở 84 giờ và hoạt tính kháng sinh cao nhất ở 96 giờ lên men. 40 35 30 25 20 15 10 5 0 25 20 15 10 5 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108120132 Thời gian lên men (h) VKK (mm) Sinh khối (mg/ml) pH Hình 3.15. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng HP411. Hình 3.16. Khả năng ức chế vi sinh vật của chất kháng sinh chủng HP411. 3.5. Phân tích cấu trúc chất kháng sinh của chủng HP411 3.5.1. Phân tích cấu trúc chất kháng sinh Sơ đồ quy trình phân tích chất kháng sinh thô của chủng HP411 được trình bày trên hình 3.22. 14 Hình 3.22. Quy trình phân lập từ cặn chiết tổng và tinh chế hợp chất HPE 2.4. Kết quả phân tích các phân đoạn tách chiết như sau: - Phân đoạn HPE1.6 thu được một chất acid béo. - Phân đoạn HPE 1.9 được xác định là có hoạt tính kháng sinh nên phân đoạn này được chọn để tiếp tục phân tách trên cột sắc ký pha thường với hệ dung môi rửa giải Hexan-Aceton có tỷ lệ thể tích là 5/1. Trên phân đoạn HPE1.9 được tách rồi tinh chế lại trên cột sắc ký pha thường với hệ dung môi rửa giải Hexan-Diclometan-Aceton có tỷ lệ thể tích là 15/15/1 thu được 5 phân đoạn chất có ký hiệu HPE2.1- 2.5. Trong đó thu được các chất sạch là HPE2.4 có khối lượng 16mg. Chất HPE2.4 được sử dụng để xác định cấu trúc NMR. - Phân đoạn HPE1.10 phân lập được một chất là HPE3.4 có khối lượng 2 mg. Lượng chất sạch của HPE3.4 ít nên không đủ để xác định cấu trúc. 15 - Hợp chất HPE 2.4 có dạng bột màu vàng. Trên phổ khối lượng xuất hiện tín hiệu [M + H]+ tại m/z 225.1 cho phép dự đoán công thức phân tử là C13H8N2O2 (Hình 3.16). Hình 3.16. Phổ ESI-MS của HPE 2.4. Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của HPE 2.4. 16 Hình 3.18. Phổ 1H-NMR giãn rộng của HPE 2.4. Hình 3.26. Phổ 13C-NMR của HPE 2.4. Hình 3.27. Phổ DEPT90, DEPT135 và 13C NMR của HPE 2.4. 17 Bảng 3.30. Dữ liệu phổ của hợp chất HPE2.4 được so sánh với chất Tubermycin B *δ δC, ppm δC, ppm δH, ppm 124.9,C 124.93, C 1 137.4, CH 137.41, CH 9.0; dd; J= 1.0, 8.5Hz 2 130.3, CH 130.27, CH 8.06; m 3 135.1, CH 135.09, CH 8.54; dd; J= 1.0, 8.5Hz 4 143.4, C 143.36, C 4a 139.8, C 139.83, C 5 128.0, CH 127.96, CH 8.29; dd; J= 1.0, 8.5Hz 6 133.2, CH 133.21, CH 8.03; m 7 131.7, CH 131.73, CH 7.99; m 8 130.1, CH 130.27, CH 8.36; dd; J= 1.0, 8.5Hz 9 144.1, C 144.07, C 9a 140.1, C 140.04, C 10 165.9, C 165.91, C COOH Ghi chú: *δC là độ dịch chuyển hóa học của chất Tubermycin B đã được công bố. Vị trí Dựa vào các dữ kiện trên, so sánh với số liệu đã công bố trước đây (Samina et al., 2013), có thể thấy chất HPE 2.4 có cấu trúc gần giống với cấu trúc của Tubermycin B (hay 1-Phenazinecarboxylic acid). Hình 3.28. Tương tác HMBC của HPE2.4. Hình 3.29. Cấu trúc của HPE2.4. 3.5.2. Kiểm tra hoạt tính sinh học của chất kháng sinh Chất kháng sinh HPE2.4 được kiểm tra hoạt tính kháng sinh với 3 chủng vi sinh vật gây bệnh (Bảng 3.31) và hoạt tính gây độc với 5 dòng tế bào (Bảng 3.32). 18 Bảng 3.31. Khả năng diệt khuẩn của HPE2.4 với các chủng vi khuẩn gây bệnh Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của HPE2.4 (µg/ml) S. aureus MRSA ATCC 25923 S. epidermidis A. hydrophila C. albican MRSE ATCC 35984 THWQJ ATCC 10231 71,25 ± 0,12 20,83 ± 0,01 51,61 ± 0,05 2,96 ± 0,08 Bảng 3.32. Khả năng gây độc với các dòng tế bào của HPE2.4 Giá trị IC50 trên các dòng tế bào (µ µg/ml) Ký hiệu mẫu Hek MCF7 A549 Hela Đối chứng (+) 0,11± 0,05 1,5± 0,12 1,93±0,03 5,28 ±0,13 HPE2.4 Hep-G2 3,66 ± 0,1 35,2± 0,21 6,15±0,04 6,91±0,12 6,84± 0,15 9,28±0, 07 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Sàng lọc vi sinh vật biển có hoạt tính kháng sinh Kết quả nghiên cứu này cho thấy, số lượng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng với vi sinh vật gây bệnh chiếm khoảng 67,9%. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của các chất có hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn biển trong y dược (Berdy, 2005; Das et al., 2006; Lam, 2006). Trong số các chủng nghiên cứu đã lựa chọn được 16 chủng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng cao để nghiên cứu sàng lọc các hoạt chất ứng dụng trong y dược. 4.2. Đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn biển Theo các tài liệu đã nghiên cứu về xạ khuẩn, việc xác định đặc điểm sinh học là cần thiết để phân loại và định tên các chủng xạ khuẩn (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1998; Lê Gia Hy, 1994, 2010; Rajeswari et al., 2014). Trong nghiên cứu này, 16 chủng xạ khuẩn đã được phân loại đến loài, trong đó 15 chủng thuộc chi Streptomyces và 1 chủng thuộc chi Nocadiopsis. Điều này cũng phù hợp với các công bố trên thế giới, các chất có hoạt tính dược học thu được phần lớn do chi Streptomyces sản sinh 19 ra, chi này được coi như một nguồn cung cấp chính để phát triển các loại thuốc mới hiện nay (Shin et al., 2008, 2010). 4.3. Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển Trong nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển cho thấy, cần phải nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho lên men sinh chất kháng sinh (Jensen et al., 2005; Rath et al., 2005; Ilic et al., 2007; Han et al., 2009). Dung môi cho chiết tách sử dụng là ethyl acetate (Gailliot, 1998; Wanner, 2009; Rofiq và Bambang 2010; Ravikumar et al., 2012; Rajeswari et al., 2014). Ưu điểm của việc sử dụng ethyl acetate có thể được loại bỏ khi cô ở nhiệt độ dưới 60oC. Các chất kháng sinh thô được kiểm tra khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh cho thấy, phần lớn chúng có hoạt phổ kháng khuẩn rộng, ức chế mạnh các vi sinh vật gây bệnh như: Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, Sarcina lutea M5, K. pneumoniae ATCC 13883, Bacillus cereus ATCC 11778, Enterobacter aerogenes ATCC 13048; Acinetobacter baumannii ATCC 19606; Staphylococcus aureus ATCC 29213; Aeromonas hydrophila THWQJ; Candida albicans ATCC 10231, đặc biệt là khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc MRSA ATCC 25923 và MRSE ATCC 35984. Quá trình tìm kiếm và phát triển các hợp chất mới có tiềm năng trong điều trị bệnh ung thư từ các chủng xạ khuẩn biển sẽ gia tăng cơ hội để phát triển các loại thuốc mới cho y dược (Li et al., 2006; Kwon et al., 2006; Shin et al., 2008, 2010). Trong nghiên cứu của luận án cho thấy, chất của chủng TB5.3 không có khả năng gây độc với 4 dòng tế bào ung thư là Hep-G2, MCF7, RD và FL. Chất thô của chủng HPN11 chỉ có khả năng gây độc với dòng tế bào MCF7 với lượng tế bào sống sót là 43,64%. Chất thô thu được từ chủng HP411 và NA115 có hoạt tính gây độc với 3 dòng tế bào Hep-G2, RD và FL và không gây độc dòng tế bào MCF7. Tuy nhiên, chất thô của chủng HP411 lại không có khả năng gây độc với dòng tế bào M14 và NCIH460. Trên các nghiên cứu phân tích phổ IR cũng như kết quả sắc đồ trên bản mỏng (TLC) cho thấy có sự xuất hiện của nhiều chất khác nhau. Trong chất thô của các chủng xạ khuẩn cho thấy đây là các sản phẩm thứ cấp, do 20