ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------
Nguyễn Duy Phƣơng
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA
NHÂN T Ố PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH
CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62420116
DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2015
Công trình đƣợc hoàn thành tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Xuân Hội
2. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
Phản biện 1: .............................................
Phản biện 2: ............................................. Phản
biện 3: .............................................
Luận án sẽ đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học
Quốc gia họp tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
vào hồi......giờ......., ngày.......tháng.......năm 2015
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hạn là yếu tố môi trƣờng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản
xuất nông nghiệp, làm giảm năng suất, sản lƣợng cây trồng và dẫn tới
tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Đặc biệt, trong bối cảnh biến đổi
khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra ngày càng thƣờng xuyên
hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, nhiều lúc vƣợt quá tầm kiểm
soát của con ngƣời. Chính vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên quan
tới tính kháng hạn để tiến tới tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả
năng chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc duy trì và
tăng sản lƣợng nông nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực
quốc gia.
Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen
liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Các nhà khoa học đã chứng
minh đƣợc chức năng quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc
tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Do đó, việc nghiên cứu phân lậ
ố phiên mã liên
c đặ
quan đến chịu hạn đang trở thành xu hƣớng triển vọng và nhận đƣợc
sự quan tâm đặc biệt. Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan
đến chịu hạn đã đƣợc xác định và chuyển vào các giống cây trồng khác
nhau. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực
tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng sự biểu hiện của
chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng
khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật. Nhiều
cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã đã đƣợc chứng minh
tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen
Ở Việt Nam, cho đến nay chúng ta vẫn chƣa có một nghiên cứu cơ
bản hoàn chỉnh nào về phân lập và nghiên cứu chức năng gen liên quan
1
đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hóa
nhân tố phiên mã.
Xuất phát từ
trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án
tiến sĩ “Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên
quan đến tính chịu hạn của thực vật” với mục tiêu xác định một gen
mã hóa nhân tố phiên mã mới có liên quan tới tăng cƣờng tính chống
chịu hạn ở thực vật.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã điều
khiển tính chịu hạn từ lúa.
- Nghiên cứu một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã phân
lập đƣợc trên cây lúa chuyển gen mô hình. 3. Đối tƣợng và nội
dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu
stress hạn của lúa Oryza sativa L.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chống chịu
điều kiện bất lợi ở lúa.
- Nghiên cứu đặc điểm chức năng của protein OsNLI-IF.
- Thiết kế các hệ vector biểu hiện gen OsNLI-IF trong tế bào thực
vật.
- Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây chuyển gen mô hình.
4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện tại Bộ môn Bênh học
Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp
2
Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công
nghệ Sinh học Quốc tế (New Delhi, Ấn Độ).
5. Đóng góp mới của đề tài
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có
hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng gen OsNLIIF chƣa đƣợc xác định chức năng. Gen OsNLI-IF đƣợc chứng minh
mã hóa một nhân tố phiên mã hoạt động cảm ứng với điều kiện ngoại
cảnh bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và có khả năng tăng
cƣờng tính chịu hạn trong các cây chuyển gen mô hình (thuốc lá/ lúa).
Ngoài ra, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF đƣợc điểu khiển bởi các
promoter hoạt động liên tục (35S và Ubiquitin) và hoạt động trong điều
kiện stress (Lip9) đã đƣợc chuyển vào cây mô hình để nghiên cứu biểu
hiện gen. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu của luận án là hoàn toàn
mới, có giá trị khoa học và ý nghĩa thực tiễn trong công tác chọn tạo
giống cây trồng chuyển gen.
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên đã chứng minh vai trò
tăng cƣờng tính chịu hạn của gen OsNLI-IF trong các dòng cây chuyển
gen. Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNLIIF do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây
trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo các giống
cây chuyển gen kháng hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất
trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu.
7. Bố cục của luận án
3
Luận án gồm 179 trang bao gồm: Phần mở đầu (03 trang); Tổng
quan tài liệu (41 trang); Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (28
trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (70 trang); Kết luận (02 trang);
Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học của tác giả liên quan
đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang), 177 tài liệu gồm
2 thứ tiếng tiếng Việt (17
) và tiếng Anh (160
); Phụ lục (06 trang). Luận án có 11 bảng, 45 hình.
4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT
Hạn đối với thực vật là khái niệm đƣợc dùng để chỉ trạng thái thiếu
nƣớc do môi trƣờng gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng
giai đoạn sống, làm ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển
của thực vật. Môi trƣờng khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu
cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả
các giai đoạn phát triển. Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật sẽ
khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nƣớc, sau đó sẽ là
một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác nhau. Đáp ứng chống chịu stress
hạn của thực vật đƣợc thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất
phức tạp với sự tham gia của hàng loạt các yếu tố và có thể chia thành
3 giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu
khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu.
1.2. ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Ở
THỰC VẬT
Thực vật thích nghi với môi trƣờng sống nhờ khả năng điều hòa
nhanh biểu hiện của các gen chức năng. Quá trình điều hòa biểu hiện
gen đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với các
điều kiện stress phi sinh học, trong đó có hạn hán. Các nghiên cứu gần
đây đã chứng minh stress hạn tác động tới tất cả các bƣớc trong quá
trình điều hòa hoạt động gen của thực vật, bao gồm: điều hòa quá trình
phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa quá trình dịch mã, điều hòa
sau dịch mã, điều hòa hoạt động gen thông qua các phân tử RNA không
mã hóa và yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ nhƣ quá trình methyl hóa
DNA hay quá trình biến đổi histone).
1.3. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG
STRESS HẠN
5
Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa nhân tố phiên mã
(TF), trong số đó có rất nhiều gen liên quan đến đáp ứng chống chịu
stress. Các TF tham gia trong mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp
ứng stress hạn đã biết cho tới nay đƣợc xác định thuộc hầu hết các
nhóm TF lớn của thực vật, trong đó đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là các
nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC, bZIP hay ZF.
1.4. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA
LÚA
BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT
Việc phát triển các giống lúa chịu hạn và giảm lƣợng nƣớc tiêu
thụ trong sản xuất lúa gạo có ý nghĩa vô cùng to lớn để tăng sản lƣợng
và đảm bảo an ninh lƣơng thực. Một hƣớng nghiên cứu phổ biến và
rất đƣợc quan tâm hiện nay là tăng cƣờng biểu hiện các gen đáp ứng
hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa chuyển gen.
Do cơ chế chống chịu hạn phức tạp của thực vật, việc sử dụng các gen
điều hòa (mã hóa các protein tham gia vào mạng lƣới điều hòa đáp ứng
stress) trong nghiên cứu chuyển gen tạo giống lúa chịu hạn thƣờng
mang lại hiệu quả cao hơn so với các gen chức năng (mã hóa protein/
enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng chống chịu stress). Tuy nhiên,
cho đến nay mới chỉ có một vài nghiên cứu chứng minh khả năng chịu
hạn của các dòng lúa chuyển gen trong điều kiện thử nghiệm trên đồng
ruộng. Ở Việt Nam chƣa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào về các gen
liên quan đến đáp ứng chống chịu stress ở thực vật, đặc biệt là nhóm
gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn ở
lúa.
Chƣơng 2. VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
6
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Thƣ viện cDNA sơ cấp của lúa Oryza sativa L. xử lý điều kiện hạn
và mặn
ấp bởi Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền
Nông nghiệp. Hạt lúa PB1 và hạt thuốc lá Nicotiana tabacum (L.)
doTrung tâm Kỹ thuật Di truyền & Công nghệ sinh học Quốc tế
(Ấn Độ) cung cấp.
2.1.2. Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc mua từ hãng Fermentas (Mỹ);
chủng vi khuẩn E. coli XLOR, XL1-Blue MRF và phage “trợ giúp”
đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ); chủng vi khuẩn E.
coli Rosetta (DE3) khả biến đƣợc mua từ Công ty Merck Millipore
(Mỹ); chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 khả biến, chủng nấm
men Saccharomyces cerevisiae YM4271 và AH109 đƣợc mua từ Công
ty Clontech (Mỹ).
2.1.3. Vector và oligonucleotide
Các vector pLacZi/JRC0332, pLacZi/JRC0528, pLacZi/JRC2606,
pHISi/JRC0332, pHISi/JRC0528, pHISi/JRC2606 do nhóm nghiên
cứu của Phạm Xuân Hội thiết kế và cung cấp; vector YEpGAP,
pBILip9, pBI-Ubi do nhóm nghiên cứu của Kazuko
YamaguchiShinozaki thiết kế và cung cấp; các vector pAD-GAL4,
pGBKT7 đƣợc mua từ Công ty Clontech; vector pET28a đƣợc mua từ
hãng Novagen, vector pRT101 do nhóm nghiên cứu của Reinhard
Topfer thiết kế; vector pCAMBIA1301 đƣợc mua từ Công ty Marker
Gene Technologies; vector pGEM-T đƣợc mua của hãng Promega.
Các cặp
sử dụng làm mồi
oligonucleotide đầu dò
đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
7
- Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp của Qin (2007), Dubouzet
(2003) và Tran (2004).
- Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA
- Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T
- Thiết kế vector biểu hiện gen OsNLI-IF
Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF
Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9 và pBI-Ubi
- Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA bằng kỹ thuật lai phân tử trong tế
bào nấm men.
- Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp
- Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF
Chƣơng 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
8
3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN
ĐẾN CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI Ở LÚA
Trong nghiên cứu đƣợc công bố năm 2003, Rabbani và cộng sự đã
xác định đƣợc 72 gen biểu hiện cảm ứng với các điều kiện stress khác
nhau ở lúa. Khi phân tích trình tự promoter của các gen này, hai motif
(đoạn trình tự lặp lại) có trình tự là CCTCCTCC và CTCCAC đƣợc
tìm thấy xuất hiện lặp lại nhiều lần trong vùng promoter của nhiều gen
và đƣợc dự đoán là những yếu tố cis điều hòa biểu hiện gen trong điều
kiện stress. Chúng tôi đã sử dụng hai đoạn DNA kích thƣớc 50 bp đƣợc
tổng hợp dựa trên trình tự của hai promoter JRC0528 và JRC0332 có
chứa đồng thời cả hai motif làm “mồi câu” trong thí nghiệm sàng lọc
gen mã hoá nhân tố phiên mã từ thƣ viện cDNA bằng kỹ thuật Y1H.
Bảng 3.2: Protein liên kết với đoạn DNA đích
Protein liên kết JRC0332
Protein
Số
KL
OsNLI-IF
3
R2R3 typical-P-type
1
Protein cảm ứng lạnh
1
Nhân tố ức chế dịch mã EIF4D 1
Dehydrogenase
1
Protein liên kết RNA
1
Protein mang acyl
1
Protein liên kết RNA
Systeine synthase
Protein ƣu nhiệt
Trình tự DNA không xác định
1
1
1
5
Protein liên kết JRC0528
Protein
Số
KL
OsNLI-IF
5
Protein họ Zinc Finger
1
Protein C3HC4-type ring finger 1
Protein liên kết RNA
1
Protein ribosomal 60S
1
Protein giống methallothionein 1
Carboxylase
ribulose- 1
bisphosphate
Protein chuyển hóa lipid
1
Protein ƣu nhiệt
1
Protein liên kết axit béo
1
Trình tự DNA không xác định
4
Chúng tôi đã sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress hạn và mặn của
lúa và xác định đƣợc 37 dòng cDNA dƣơng tính, trong đó có 8 dòng
9
mã hóa cho protein NLI-IF (Bảng 3.2). Tám dòng cDNA đều có chiều
dài ~1850 bp, trong đó vùng ORF dài 1.320 bp mã hóa cho 439 axit
amin, vùng không mã hóa đầu 5’ dài 311 bp, vùng không mã hóa đầu
3’ dài 219 bp. Gen OsNLI-IF sau đó đƣợc nhân bản bằng phản ứng
PCR với cặp mồi đặc hiệu và nhân dòng vào vector pGEM-T.
3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA OsNLI-IF
3.2.1. Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện stress
Mức độ biểu hiện gen OsNLI-IF trong cây lúa đƣợc phân tích trong
các điều kiện stress giả định, bao gồm mất nƣớc, hạn, mặn, lạnh, nhiệt
độ cao và hormone ABA.
Hình 3.14: Biểu hiện của OsNLI-IF trong điều kiện bất lợi. Ghi
chú: (Hình trên) OsNLI-IF mRNA được phát hiện bằng đầu dò gắn phóng xạ
P32; rRNA 18S được điện di trên gel agarose. (Hình dưới) Mức độ biểu hiện
OsNLI-IF được xác định bằng Real-time RT-PCR với khuôn là mẫu RNA tách
chiết từ mô thân & lá (cột màu xám) và mô rễ (cột màu đen); mức độ biểu
hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress có giá trị bằng 1; gen actin được sử
10
dụng làm gen nội chuẩn; giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của
3 lần thí nghiệm.
Kết quả phân tích bằng kỹ thuật lai RNA và Real-time RT-PCR
cho thấy OsNLI-IF tăng cƣờng biểu hiện bởi các yếu tố stress mặn,
hạn, mất nƣớc, lạnh, nhiệt độ cao trong mô rễ và không cảm ứng biểu
hiện với ABA (Hình 3.14).
3.2.2. Hoạt tính liên kết đặc hiệu DNA đích của OsNLI-IF
Để chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu DNA của protein
OsNLI-IF, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Y1H với hai đoạn DNA đích
JRC0528 và JRC0332 đột biến (Hình 3.17A). Đoạn gen OsNLI-IF
đƣợc ghép nối với trình tự mã hoá domain hoạt hoá phiên mã ADGAL4
trên vector biểu hiện pAD-GAL4 và biến nạp vào tế bào nấm men chỉ
thị YM4271.
Hình 3.17: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF
Ghi chú: (A) Trình tự các đoạn DNA đích nguyên bản (WT) và đột biến (MU).
(B) Biểu hiện của gen chỉ thị trong tế bào nấm men: (i) sơ đồ bố trí thí nghiệm
các chủng nấm men mang các cấu trúc khác nhau, (ĐC+): đối chứng dương,
(ĐC-): đối chứng âm, (JRC0332-WT, JRC0528-WT, JRC0332-MU,
JRC0528-MU): chủng nấm men chỉ thị mang các đoạn DNA đích JRC0332
hay JRC0528 được biến nạp vector pAD/OsNLI-IF; (ii) môi trường YPD; (iii)
môi trường SD/-Leu/-Ura/-His; (iv) môi trường SD/-Leu/Ura/-His có 3-AT 30
mM; (v) hoạt tính biến đổi cơ chất X-Gal của βgalactosidase.
11
Kết quả đánh giá biểu hiện của gen chỉ thị HIS3 và lacZ cho thấy
chỉ có tế bào nấm men tái tổ hợp mang một trong hai đoạn DNA đích
nguyên bản có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc và thể
hiện hoạt tính β-galactosidase (Hình 3.17B). Kết quả này chứng tỏ
protein dung hợp AD-OsNLI-IF đã liên kết đặc hiệu với đoạn DNA
chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC và hoạt hoá quá trình phiên
mã của gen chỉ thị.
3.2.3. Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF
Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF đƣợc phân tích bằng
kỹ thuật Y1H. Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vector biểu hiện
YEpGAP và biến nạp vào chủng tế bào nấm men chỉ thị YM4271.
Hình 3.20: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF
Ghi chú: (A) Sơ đồ bố trí thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc
khác nhau. (B) Môi trường YPD. (C) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His. (D) Môi
trường SD/-Leu/-Ura/-His có 3-AT 30 mM. (E) Hoạt tính biến đổi cơ chất XGal của β-galactosidase. (ĐC+): đối chứng dương; (YM4271-WT): nấm men
YM4271 nguyên bản; (OsNLI-IF): nấm men mang YEpGAP/OsNLI-IF;
(JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332; (Vector +
JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 + YepGAP;
(OsNLI-IF + JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 +
YepGAP/OsNLI-IF.
Kết quả thu đƣợc cho thấy chỉ có chủng nấm men mang đồng thời
YEpGAP/OsNLI-IF và vector chỉ thị chứa đoạn DNA đích JRC0332
trong vùng điều khiển của gen HIS3 và lacZ có thể sinh trƣởng trên
12
môi trƣờng chọn lọc và biến đổi cơ chất X-Gal để tạo thành màu xanh
(Hình 3.20D & E). Kết quả này chứng tỏ protein
OsNLI-IF đã tƣơng tác với đoạn DNA đích JRC0332 và hoạt động
nhƣ một nhân tố hoạt hoá quá trình phiên mã.
3.2.4. Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF
Protein tƣơng tác với OsNLI-IF đƣợc sàng lọc từ thƣ viện cDNA
xử lý stress hạn và mặn của lúa, sử dụng kỹ thuật Y2H. Đoạn gen
OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự mã hoá domain liên kết DNA
BD-GAL4 trên vector biểu hiện pGBKT7 và biến nạp đồng thời cùng
thƣ viện cDNA vào tế bào nấm men AH109 để thực hiện thí nghiệm
sàng lọc gen. Sau khi sàng lọc các thể biến nạp, chúng tôi đã thu đƣợc
tám dòng cDNA dƣơng tính, trong đó có hai dòng mã hóa cho protein
ubiquitin, cho thấy có thể quá trình ubiquitin hóa là một trong những
bƣớc biến đổi sau phiên mã của protein OsNLI-IF (Bảng 3.4). Bảng
3.4: Protein tƣơng tác OsNLI-IF sàng lọc từ thƣ viện
Protein tƣơng tác OsNLI-IF
Polyubiquitin
Số khuẩn lạc
2
Protein kép chứa domain phosphatase
1
Protein liên kết kẽm, nhóm Alcohol dehydrogenase
Protein chƣa đƣợc nghiên cứu
1
1
Protein liên kết chlorophyll a/b nhóm I, tiền chất của
Cyclophilin 2 1
1 chloroplast
U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase
1
Nhƣ vậy, các thí nghiệm in vivo đã cho thấy OsNLI-IF là một nhân
tố phiên mã đƣợc biểu hiện ở rễ dƣới điều kiện stress hạn, mặn, lạnh,
nhiệt độ cao, mất nƣớc, có thể tƣơng tác với các vùng promoter chứa
13
hai motif CCTCCTCC và CTCCAC, điều hòa quá trình phiên mã của
gen đích và có thể liên quan tới quá trình ubiquitin hóa.
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG TẾ BÀO THỰC
VẬT 3.3.1. Thiết kế hệ vector chuyển gen pCAMBIA1301
Vector pCAMBIA1301 mang cấu trúc biểu hiện gen
35S:OsNLIIF:Nos đƣợc thiết kế theo sơ đồ trong hình 2.2, sử dụng
vector pGEM/OsNLI-IF và vector trung gian pRT101 mang promoter
35S.
Hình 3.28: Kiểm tra pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS
Ghi chú: (A) Vector pCAM/OsNLI-IF-S; (B) Vector pCAM/OsNLI-IF-AS.
Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: PCR với cặp mồi EcoRINLIFw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2: PCR với cặp mồi 35S-Fw/GUS-Rv; giếng
3(A):
PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 3(B): PCR với cặp mồi
35SFw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 4: đối chứng âm (không có DNA khuôn); giếng
5: sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII; giếng 6: vector nguyên bản; giếng 7:
sản phẩm cắt giới hạn bằng EcoRI.
Để khẳng định kết quả thu đƣợc, plasmid tái tổ hợp đƣợc tinh sạch
từ các khuẩn lạc dƣơng tính và kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi đặc
hiệu khác nhau và bằng enzyme cắt giới hạn HindIII và EcoRI. Kết quả
điện di sản phẩm PCR và cắt giới hạn cho thấy các băng DNA thu đƣợc
phù hợp với kich thƣớc tính toán lý thuyết (Hình 3.28), chứng tỏ chúng
tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pCAMBIA1301 mang trình
14
tự có nghĩa (sense) hay đối nghĩa (antisense) của gen OsNLI-IF, đặt
dƣới sự điều khiển của promoter 35S.
3.3.2. Thiết kế hệ vector chuyển gen pBI101
Để thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101, gen OsNLI-IF đƣợc nhân
bản bằng phản ứng PCR và ghép nối lần lƣợt vào hai vector pBI-Lip9
và pBI-Ubi đã đƣợc xử lý bằng enzyme cắt đầu bằng SmaI (Hình 2.3).
Hình 3.31: Kiểm tra pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF
Ghi chú: (A) Giếng 1 – 3: khuôn là pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng 4 – 6: khuôn là
pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Fw; giếng
2 & 5: PCR với cặp mồi SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 3: PCR với cặp
mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/ SmaI-NLIFw; giếng 6: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/SmaI-NLI-Rv. (B) Giếng 1 & 2: pBIUbi/OsNLI-IF; giếng 3 & 4: pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1 & 3: sản phẩm cắt
giới hạn bằng SmaI; giếng 2 & 4: vector nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn
DNA 1 kb.
Để khẳng định kết quả thu đƣợc, plasmid tái tổ hợp cũng đƣợc tinh
sạch từ các khuẩn lạc dƣơng tính và kiểm tra lần lƣợt bằng PCR với
các cặp mồi đặc hiệu khác nhau, cắt giới hạn bằng enzyme SmaI và giải
trình tự gen. Kết quả kiểm tra cho thấy trình tự mã hóa cho nhân tố
phiên mã OsNLI-IF đã đƣợc ghép nối thành công vào hệ vector biểu
hiện pBI101, đặt dƣới sự điều khiển của 2 promoter Lip9 và Ubiquitin
(Hình 3.31).
15
3.4. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN
3.4.1. Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây thuốc lá
Thí nghiệm biến nạp cấu trúc 35S:OsNLI-IF và vector
pCAMBIA1301 không mang gen đích vào cây thuốc lá đã đƣợc tiến
hành dựa trên phƣơng pháp chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Dựa vào kết quả phân tích các dòng thuốc lá T1 bằng
phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng có hygromycin và phƣơng
pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu của cấu trúc biểu hiện gen, năm dòng
(TL1, TL3, TL4, TL7, TL8) mang cấu trúc 35S:OsNLI-IF và bốn dòng
(ĐC2, ĐC3, ĐC8, ĐC9) mang cấu trúc pCAMBIA1301 đã đƣợc chọn
để tiếp tục phân tích (Bảng 3.7).
Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dòng thuốc lá T1.
Dòng Số cây
Số cây có kết quả PCR dƣơng tính
cây kiểm tra Mồi Actin Mồi Hygromycin Mồi GUS Mồi OsNLI-IF
TL1
20
20/20
18/20
18/20
18/20
TL3
20
20/20
15/20
15/20
15/20
TL4
20
20/20
20/20
20/20
20/20
TL7
20
20/20
17/20
17/20
17/20
TL8
20
20/20
12/20
12/20
12/20
TL10
20
20/20
18/20
18/20
18/20
ĐC2
10
10/10
8/10
8/10
0/10
ĐC3
10
10/10
6/10
6/10
0/10
ĐC8
10
10/10
8/10
8/10
0/10
ĐC9
10
10/10
10/10
10/10
0/10
TL: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF.
ĐC: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301.
Sự có mặt của protein OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển
gen T1 đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch, sử dụng
kháng thể đa dòng của chuột kháng OsNLI-IF (tạo từ protein OsNLIIF
16
tái tổ hợp). Kết quả thu đƣợc cho thấy dòng TL1 và TL8 biểu hiện
OsNLI-IF mạnh nhất; dòng TL3 và TL7 biểu hiện vừa phải, dòng TL10
biểu hiện thấp nhất, dòng TL4 và các dòng thuốc lá đối chứng hoàn
toàn không biểu hiện protein đích (Hình 3.39). Nhƣ vậy, chúng tôi đã
chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào thuốc lá và thu đƣợc
các dòng cây T1 có biểu hiện protein đích OsNLI-IF.
Ba dòng thuốc lá TL1, TL4 và TL10 đại diện cho ba mức độ biểu
hiện gen đích OsNLI-IF đƣợc chọn để phân tích khả năng sinh
trƣởng và chống chịu stress hạn. Kết quả quan sát các cây thuốc lá ở
giai đoạn bốn tuần tuổi cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về
hình thái và tốc độ sinh trƣởng giữa các cây thuốc lá đối chứng và
cây thuốc lá chuyển gen đích, tuy nhiên tốc độ sinh trƣởng của cây
chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu hiện của gen OsNLI-IF
(Hình 3.40).
Hình 3.39: Biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc lá T1
Ghi chú: (A) Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1 – 3 & 5 – 7: dịch chiết
protein tổng số của các dòng thuốc lá TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10; giếng
4: protein OsNLI-IF tái tổ hợp (P); giếng 8: dịch chiết protein tổng số của
dòng thuốc lá ĐC8 (V); giếng 9: dịch chiết protein tổng số của cây thuốc lá
không chuyển gen (WT). (B) Đồ thị so sánh hàm lượng protein
OsNLI-IF tương quan giữa các dòng cây; hàm lượng OsNLI-IF trong dịch
chiết protein tổng số của dòng TL10 có giá trị bằng 1.
17
- Xem thêm -