Tài liệu Phân lập, xác định đặc điểm của tế bào gốc ung thư vú người việt nam và bước đầu ứng dụng điều trị thực nghiệm

9. Pham PV, Vu NB, Duong TT, Nguyen TT, Truong NH, Phan NLC, Vuong TG, Pham VQ, Nguyen HM, Nguyen KT, Nguyen NT, Nguyen KG, Khat LT, Le DV, Truong KD, Phan NK (2012) “Suppression of human breast tumors in NOD/SCID mice by CD44 shRNA gene therapy combined with doxorubicin treatment”. OncoTargets and Therapy 2012(5), pp.77-84. ! ! ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM VĂN PHÚC PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ VÚ NGƯỜI VIỆT NAM VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh lý Người và Động vật Mã số: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh năm 2012 Công trình được hoàn thành tại PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Trương Đình Kiệt TS.BS. Lê Văn Đông Phản biện 1: GS.TS. Trần Linh Thước Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Sào Trung Phản biện 3: TS. Huỳnh Nghĩa Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Trần Cát Đông Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Đăng Quân Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp cơ sở đào tạo họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM vào hồi 14 giờ 00 ngày 16 tháng 11 năm 2012. Có thể tìm hiểu luận án này tại thư viện: 1. Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM 2. Thư viện Trường Đại học KHTN, Đại học Quốc gia Tp.HCM DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 1. Phạm Văn Phúc, Lê Thành Trung, Trương Hải Nhung, Vương Gia Tuệ, Dương Thanh Thủy, Phan Kim Ngọc (2010) “Thu nhận tế bào ung thư từ khối u vú”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(4), tr.1775-1783. 2. Phạm Văn Phúc, Chi Jee Hou, Lê Văn Đông, Trương Đình Kiệt, Phan Kim Ngọc (2010) “Biệt hóa in vitro tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người thành tế bào tua”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(3B), tr.1111-1120. 3. Pham Van Phuc, Tran Thi Thanh Khuong, Le Van Dong, Truong Dinh Kiet, Tran Tung Giang and Phan Kim Ngoc (2010). “Isolation and characterization of breast cancer stem cells from malignant tumours in Vietnamese women”, Journal of Cell and Animal Biology, 4(12), pp.163–16. 4. Pham Van Phuc, Siah Chia Keng, Nguyen Thi Minh Nguyet, Duong Thanh Thuy, Phan Kim Ngoc (2010). “Isolation and comparison of tumorigenicity of different cell population in MCF-7 breast cancer cell line based on CD44 and CD24 markers”, Journal of Biotechnology, 8(4), pp.13-19. 5. Phuc PV, Lam DH, Ngoc VB, Thu DT, Nguyet NTM, Ngoc PK (2011) “Production of functional dendritic cells from menstrual blood—a new dendritic cell source for immune therapy”, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 47(5-6), pp.368-375. 6. Pham Van Phuc, Chi Jee Hou, Nguyen Thi Minh Nguyet, Duong Thanh Thuy, Le Van Dong, Truong Dinh Kiet and Phan Kim Ngoc (2011) “Effects of breast cancer stem cell extract primed dendritic cell transplantation on breast cancer tumor murine models”, Annual Review & Research in Biology, 1(1), pp.1-13. 7. Phuc PV, Nhan PLC, Nhung TH, Tam NT, Hoang NM, Tue VG, Thuy DT, Ngoc PK (2011) “Downregulation of CD44 reduces doxorubicin resistance of CD44+CD24- breast cancer cells”, OncoTargets and Therapy, 4, pp.71-7. 8. Phuc V Pham, Nhan LC Phan, Nhung T Nguyen, Nhung H Truong, Thuy T Duong, Dong V Le, Kiet D Truong and Ngoc K Phan (2011) “Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy”, Journal of Translational Medicine, 9(1), p.209. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú (UTV) là một bệnh phức tạp. Nhiều nghiên cứu đã tiến hành để tìm ra nguyên nhân và phương pháp điều trị căn bệnh này. Trong 20 năm qua, tỉ lệ tử vong do UTV đã giảm nhiều. Sự giảm này là do sự phát triển các kĩ thuật chẩn đoán sớm và các liệu pháp trị liệu hiệu quả, kể cả các liệu pháp bổ trợ. Tuy nhiên, vẫn có đến 50% khối u vú không đáp ứng thuốc, cũng như kháng với các liệu pháp này và có hơn 70% bệnh nhân sẽ tái phát sau 5 năm điều trị. Nguyên nhân của tình trạng này là sự tồn tại của tế bào gốc ung thư vú (TBGUTV) trong tất cả các khối u vú. Những TBGUTV được cho là nguồn gốc của các khối u và đóng góp vào sự di căn và tái phát trong bệnh nhân UTV. Do đó, liệu pháp tấn công vào TBGUTV được xem là liệu pháp mới và hứa hẹn. Trong 5-10 năm qua, nhiều đặc điểm của tế bào gốc ung thư (TBGUT) đã được xác định và sử dụng như đích tấn công trong một số chiến lược trị liệu. Vài đích tấn công trên TBGUTV đã được sử dụng thử nghiệm lâm sàng; trong số đó đã có một số đã được phát triển trở thành thuốc điều trị thường quy cho UTV. Tuy nhiên, vì sự phức tạp trong kiểu hình của UTV giữa các chủng tộc và vùng địa lý, mà hiệu quả điều trị UTV bằng các liệu pháp này vẫn còn thấp. Mặc dù chưa có số liệu về hiệu quả của các liệu pháp này trong điều trị UTV trên bệnh nhân Việt Nam, các nhà nghiên cứu trên nhiều quốc gia đều cho thấy có đến hơn 50% khối u không đáp ứng với các liệu pháp này cũng như kháng thuốc. Vì thế, các nghiên cứu về đặc điểm TBGUTV được phân lập từ khối u người phụ nữ Việt Nam cũng như tìm kiếm các phương pháp trị liệu mới nhằm cải thiện hiệu quả điều trị UTV ở bệnh nhân Việt Nam là cần thiết. Từ hiểu biết của mình, chúng tôi thấy rằng các liệu pháp gen và liệu pháp miễn dịch là hai hướng điều trị phù hợp có thể được sử dụng để tấn công TBGUTV. 1 Vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với tên đề tài “Phân lập, xác định đặc điểm tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam và bước đầu ứng dụng điều trị thực nghiệm” nhằm phát triển các liệu pháp mới để tấn công TBGUTV dựa vào liệu pháp gen và liệu pháp miễn dịch. Mục tiêu của nghiên cứu Mục tiêu chính của nghiên cứu này là: - Phân lập và nuôi cấy được tế bào ung thư vú (TBUTV) từ khối u vú ác tính của người Phụ nữ Việt Nam. - Phân lập và nuôi cấy TBGUTV từ các quần thể TBUTV phân lập được. - Thiết lập một số bước cơ bản trong liệu pháp gen và liệu pháp miễn dịch để tấn công TBGUTV thực nghiệm. Vấn đề chính yếu trong nghiên cứu này là thiết lập được những dòng TBGUTV đầu tiên ở Việt Nam từ khối u vú ác tính mà nó là nguyên liệu quan trọng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo để sử dụng liệu pháp gen và liệu pháp miễn dịch tấn công TBGUTV để điều trị UTV. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sự tồn tại TBGUT có thể giúp giải thích tại sao và làm thế nào sự thay đổi trong hóa mô của mô phản ánh các cấp độ ác tính của khối u. Với các đặc điểm tương tự tế bào gốc (TBG), TBGUT có thể gây xâm lấn mạnh (bởi vì tính tự làm mới) và gây dị hợp kiểu hình biệt hóa mạnh trong khối u (bởi vì khả năng biệt hóa) (Kakarala & Wicha, 2008; Shay & Wright, 2010). TBG trưởng thành thường tăng sinh chậm hơn các tế bào đã biệt hóa, do đó chúng có thể gia tăng tuổi thọ. Vì nguyên nhân này, chúng có thể tiếp xúc với nhiều tác nhân gây đột biến hơn các tế bào biệt hóa, do đó chúng có thể tích lũy nhiều đột biến hơn. Và những đột biến này có thể truyền sang các thế hệ con cháu (gọi là các tế bào tăng sinh nhanh hay các tế bào khuếch đại chuyển tạm thời) (Dontu et al., 2003). Điều này có nghĩa là các con cháu của những TBG trưởng thành bình thường có thể là các TBGUT. Nghĩa là trong cùng một khối u nếu chúng ta có thể thu nhận cả TBG bình thường và TBGUT thì các TBGUT sẽ thừa hưởng nhiều đặc điểm của TBG bình thường. Thật vậy, một số nhà nghiên cứu cho thấy rằng các TBGUT có thể chia sẻ một số con đường truyền tín hiệu với TBG cũng như một số marker. Chẳng hạn, con đường truyền tín hiệu Notch biểu hiện mạnh trong cả TBGUTV và TBG tuyến vú (Farnie and Clarke, 2007). Vấn đề chính của TBGUT là khả năng tạo ra khối u từ chỉ một vài tế bào, do đó nó có thể dễ dàng gây nên tái phát và khả năng kháng mạnh với hóa chất và xạ trị. Sự tái phát cao là bởi vì tính tự làm mới và khả năng kháng mạnh với hóa chất và tia xạ. Bởi vì đặc tính TBG của TBGUT có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau và có thể tạo ra một khối u dị hợp về kiểu hình (Campbell & Polyak, 2007). Mặc dù tế bào trưởng thành thiếu khả năng tự làm mới và tiềm năng tăng sinh thấp (Ginestier et al., 2007), cả tế bào trưởng thành và TBG đều có thể hình thành TBGUTV (Dontu et al., 2003). 3 Thật vậy, các tế bào trưởng thành hay các tế bào tiền thân cũng có thể ĐỀ NGHỊ trở thành TBG thông qua quá trình khử biệt hóa – đây là quá trình mà Nghiên cứu này có một số giới hạn. Để có thể ứng dụng liệu từ một tế bào trưởng thành có thể đạt các đặc điểm của TBG pháp gen làm giảm biểu hiện CD44 và liệu pháp tế bào tua nạp kháng (Cobaleda et al., 2007). nguyên TBGUTV trong lâm sàng, một số thí nghiệm tiếp theo cần Phát hiện đầu tiên về TBGUT trong khối u vú được báo cáo được tiến hành: vào năm 2003 bởi Al-Hajj và cs. Họ phát hiện một quần thể nhỏ các tế 1. Đánh giá tính an toàn của cấu trúc vector shRNA CD44, bào có biểu hiện marker bề mặt là CD44+CD24-/lowESA+ và Lin- nghiên cứu cải tiến để làm giảm độc tính nếu có thể hay (không biểu hiện CD2, CD3, CD10, CD16, CD18, CD31, CD64 và thay thế bằng hệ vector khác hoặc phương pháp khác để CD140b). Chỉ với 200 tế bào này, chúng có thể gây ra khối u khi tiêm điều hòa giảm biểu hiện CD44 với hiệu quả tương tự. vào chuột NOD/SCID trong khi đó 104 tế bào không biểu hiện marker 2. Đánh giá các tác động phụ của liệu pháp tế bào tua, đặc này thì không thể gây khối u (Al-Hajj et al., 2003). Khối u này có kiểu hình dị hợp, chứa một quần thể tế bào có kiểu hình TBG ban đầu CD44+CD24-/dimLin- và có thể tiếp tục gây u khi cấy vào chuột liên tục nhiều lần (Al-Hajj et al., 2003). sử dụng hiệu quả trên người. 4. Nghiên cứu các biến đổi trong nhiều con đường truyền tín Sau đó kiểu hình CD44+CD24- được sử dụng để xác định và tách TBGUT với khả năng gây u tăng cao. Thật vậy, các khối cầu (mammosphere) thu từ việc nuôi TBUTV có kiểu hình CD44+CD24/dim biệt đáp ứng miễn dịch mà có thể gây bệnh tự miễn. 3. Đánh giá liều vector lentivirut hay liều tế bào tua có thể hiệu liên quan đến sự điều hòa giảm biểu hiện CD44 trong TBGUTV. 5. Tối ưu hóa việc đánh giá hiệu quả điều trị UTV bằng tế có thể gây u mạnh khi tiêm vào chuột NOD/SCID. Tuy nhiên, chỉ bào tua trên mô hình chuột nhân hóa hệ miễn dịch; sử cần một ít tế bào CD44+CD24-/low cũng có thể hình thành nên khối cầu dụng hệ thống quét tín hiệu để đo sự di căn và kích thích (Ponti et al., 2005). Thật vậy, các dòng TBUTV chứa đến 90% khối u thay vì quan sát khối u bằng mắt thường. TBGUTV CD44+CD24-/low có khả năng gây u không cao hơn các dòng tế bào mà chỉ chứa 5% tế bào có cùng kiểu hình này (Fillmore & Kuperwasser, 2008). Điều này cho thấy rằng chỉ một quần thể nhỏ tế bào có kiểu hình CD44+CD24-/low là có khả năng tự làm mới và sinh u. Do đó liệu pháp tấn công TBGUTV được xem xét là liệu pháp tốt nhất để loại bỏ sự tái phát và kháng với hóa và xạ trị trong điều trị UTV. 4 21 doxorubicin, trọng lượng khối u giảm đáng kể đến 4,38 lần so với nhóm đối chứng. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Phân lập TBUTV từ khối u vú ác tính 4. Bước đầu thiết lập thành công liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào tua nạp kháng nguyên TBGUTV trên mô hình chuột TBUTV được phân lập từ các khối u vú của bệnh nhân đã đồng ý tự nguyện cho mẫu. Về cơ bản, các khối u sẽ được rửa sạch và Tế bào tua từ tủy xương chuột được sản xuất thành công và sử cắt thành từ mảnh nhỏ. Những mẩu mô này được nuôi trong điều kiện dụng chúng trong liệu pháp tế bào tua. Nếu chuột được điều trị vào thích hợp. Trong nghiên cứu này có hai loại môi trường nuôi được sử ngày 10 sau khi tiêm TBGUTV, có đến 60,0 ± 20% chuột không hình dụng để nuôi tế bào từ mảnh mô. Trong giai đoạn 1, chúng tôi sử dụng thành khối u sau khi tiêm tế bào tua đã nạp kháng nguyên TBGTV sau môi trường được biến đổi từ Speirs et al. (1998). Trong giai đoạn 2, 18 ngày. Trong khi đó có đến 100% chuột mang khối ở chuột đối chúng tôi sử dụng một loại môi trường khác, đó là M171 bổ sung với chứng (tiêm PBS) sau 15 ngày. Có 0,095±0,018% tế bào tua tồn tại yếu tố kích thích phát triển tế bào biểu mô tuyến vú MEGS của trong tách vào ngày 3 sau khi ghép. Lượng tế bào CD8 và CD45 trong Invitrogen Ltd. lô ghép tế bào tua tăng cao hơn so với chuột đối chứng. Các tế bào thu nhận được đánh giá biểu hiện marker CD24 bằng hóa tế bào miễn dịch và phân tích phần trăm tế bào biểu hiện CD24 và CD90 bằng kĩ thuật flow cytometry. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành loại bỏ các tế bào tạp nhiễm bằng kĩ thuật tách tế bào âm tính với marker CD90. Sau khi thu nhận được quần thể TBUTV, chúng tôi tiến hành xác định đặc điểm của tế bào này như: khả năng gây u in vivo trên mô hình chuột, sự biểu hiện gen Brca1, sự biểu hiện các gen liên quan đến sự hình thành khối u và di căn như Cyclin D1, Cyclin E2, EGFR, Mucin 1 và Myc. Cuối cùng, dòng tế bào thu nhận được được phát hiện sự nhiễm mycoplasma. 2.2. PHÂN LẬP TBGUTV TBGUTV ứng viên được phân lập bằng tách quần thể CD44+CD24-. Các TBGUTV ứng viên được nuôi cấy trong DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và 1% antibiotic-mycotic, ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Quần thể tế bào này được sử dụng để xác định đặc điểm đặc trưng của TBGUTV như xét nghiệm hình thành mammosphere, khả năng gây u in vivo trên mô hình chuột NOD/SCID, khả năng kháng thuốc chống khối u (doxorubicin và 20 5 verapamil). Cuối cùng, quần thể TBGUTV được đánh giá sự nhiễm - Trong điều kiện in vitro, các TBGUTV điều hòa giảm biểu hiện mycoplasma. CD44 biểu hiện một số đặc điểm: 2.3. ĐIỀU HÒA GIẢM BIỂU HIỆN CD44 VÀ SỰ KHÁNG + tăng sinh chậm sau khi xử lí với doxorubicin. THUỐC DOXORUBICIN CỦA TBGUTV + tăng mức apoptosis và thay đổi chu kì tế bào. Tác động gây siRNA được sử dụng để làm giảm biểu hiện CD44 trong apoptosis được quan sát rõ trong TBGUTV đã bị điều hòa giảm biểu TBGUTV. Việc chuyển nhiễm siRNA CD44 bằng bộ kit theo hướng hiện CD44 có thể đạt đến 34,19% tế bào chết khi xử lí 1,0 µg/mL dẫn của nhà sản xuất (Santa Cruz Biotechnology Inc). Sau 48h chuyển doxorubicin và đạt đến 40.2% khi xử lí doxorubicin ở nồng độ 6,0 nhiễm, tế bào được sử dụng đánh giá sự biểu hiện của CD44 bằng RT- µg/mL. PCR và hóa tế bào miễn dịch. + Thay đổi biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến Các tế bào sau khi được khẳng định điều hòa giảm biểu hiện CD44 thành công, chúng được sử dụng để đánh giá khả năng kháng tính gốc, tính kháng thuốc và di căn như Muc-1, MMP9 và Myc biểu hiện giảm, sự biểu hiện của LEF1 liên quan đến tính gốc cũng giảm. thuốc với thuốc chống khối u. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử + chu kì tế bào cũng bị tác động. Pha G2/M và pha S trong dụng doxorubicin để khảo sát ở các nồng độ 0, 1, 3 và 6 µg/mL. Tế TBGUTV bị điều hòa giảm CD44 tương tự với TBUTV. Pha G2/M bào được tiếp xúc với các nồng độ này của doxorubicin trong 48 giờ trong TBGUTV bị điều hòa giảm CD44 giảm tương tự với TBUTV và sau đó được sử dụng để đánh giá chu kì tế bào, sự tăng sinh và (24,23±0,34% so với 23,41±0,50%) trong khi đó pha S thì tăng từ apoptosis. 13,93±0,69% ở TBGUTV lên 16,98±0,95% trong TBGUTV đã điều 2.4. BIỆT HÓA TBGUTV BẰNG CÁCH LÀM GIẢM BIỂU hòa giảm biểu hiện CD44, so với 20,08±0,31% trong TBUTV. HIỆN CỦA CD44 - Trong mô hình chuột NOD/SCID, TBGUTV điều hòa giảm biểu Trong thí nghiệm này, đầu tiên chúng tôi tiến hành phân lập các quần thể tế bào, trong đó có quần thể TBGUTV đã được phân lập hiện CD44 cho thấy khả năng gây u giảm về cả tốc độ phát triển khối u và kích thước khối u hình thành so với TBGUTV. và 3 quần thể khác biểu hiện marker khác với TBGUTV là CD44- + TBGUTV gây u trên 66,67% (2/3) chuột khi bị tiêm 103 tế CD24-, CD44+CD24+, CD44-CD24+. Ba quần thể này được trộn đều bào; trong khi đó TBUTV cần đến 106 tế bào để gây u 33,33% (1/3) với tỉ lệ 1:1:1 để hình thành quần thể mới được gọi là tế bào không có chuột. Ở liều 104 tế bào, TBGUTV đã điều hòa giảm biểu hiện CD44 kiểu hình TBGUTV và được gọi là chung là TBUTV. không có khả năng gây u so với 100% chuột bị u khi tiêm TBGUTV. Tiếp theo, TBGUTV được làm giảm biểu hiện CD44 bằng + Kích thước và trọng lượng khối u có sự khác biệt đáng kể việc chuyển CD44 shRNA trên vector lentivirut. Các tế bào được giữa các nhóm điều trị theo phác đồ điều trị bằng liệu pháp điều hòa chuyển nhiễm và chọn lọc các tế bào nhận vector chuyển bằng cách giảm CD44 kết hợp doxorubicin trên mô hình chuột. So với chuột đối chọn lọc trong môi trường bổ sung puromycin dihydrochloride theo chứng, kích thước của chuột giảm đi 1,74; 3,04 và 12,47 lần tương hướng dẫn của nhà sản xuất. Sự điều hòa giảm biểu hiện của CD44 ứng trong trong nhóm Doxorubicin, CD44 shRNA, và CD44 shRNA kết hợp doxorubicin. Trong nhóm kết hợp CD44 shRNA kết hợp 6 19 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ được khẳng định bằng kĩ thuật flow cytometry và hóa tế bào miễn dịch. 4.1. KẾT KUẬN Sau khi đánh giá biểu hiện CD44, chỉ những mẫu có >90% tế 1. Tế bào ung thư vú từ 23 mẫu khối u vú đã được phân lập và bào không biểu hiện CD44 được sử dụng để tiến hành các đánh giá nuôi cấy. Đã thiết lập thành công 2 dòng tế bào ung thư vú tiếp theo. VNBRC1 và VNBRC2 từ các mẫu này. Các tế bào ung thư vú thu Trạng thái biệt hóa của TBGUTV được đánh giá dựa vào sự nhận được biểu hiện các đặc điểm chính sau: tương đồng của TBGUTV sau khi điều hòa giảm biểu hiện CD44 với - chứa 0,11% tế bào dương tính CD90, 96,45±1,76% tế bào dương TBUTV và sự khác biệt giữa TBGUTV và tế bào đã điều hòa giảm tính với CD24 biểu hiện CD44. Các đặc điểm khảo sát bao gồm khả năng sinh u trên - biểu hiện rất thấp gen Brca1, trong khi đó biểu hiện mạnh các gen mô hình chuột NOD/SCID, sự biểu hiện các gen liên quan đến tính cyclin D1, cyclin E2, EGFR và Mucin 1 so với dòng tế bào ung thư vú gốc và di căn, chu kì tế bào. thương mại MCF-7. Có 22 gen được chia thành 2 phức hợp gen được khảo sát, bao - hình thành khối u trong chuột NOD/SCID khi tiêm 2.106 tế gồm: Phức hợp 1 gồm 17 gen: Bcl-2 [Genebank:NM_000633], Fos bào/chuột. [Genebank: NM_005252], ICAM1 [Genebank:NM_000201], CCND1 - âm tính với các mycoplasma chính M. arginini, M. faucium, M. [Genebank: NM_053056], MMP7 [Genebank:NM_002423], Myc fermentans, M. hyorhinis, M. orale) và Acholeplasma laidlawii. [Genebank:NM_002467], PRKCE [Genebank:NM_005400], TP53 2. Thiết lập thành công hai dòng tế bào gốc ung thư vú (BCSC1 và [Genebank:NM_000546], VCAM1 [Genebank:NM_001078], IL4R BCSC2). Các TBGUTV biểu hiện các đặc điểm đặc trưng sau: [Genebank:NM_000418], PTCH1 [Genebank:NM_000264], HSPB1 - biểu hiện mạnh protein CD44, không biểu hiện hay biểu hiện rất yếu [Genebank: NM_001540], PTGS2 [Genebank: NM_000963], HSF1 protein CD24 trên bề mặt tế bào [Genebank:NM_005526], - có khả năng tự làm mới in vitro và hình các khối cầu trong môi [Genebank:NM_003202], and FASN [Genebank:NM_004104]; phức trường không huyết thanh hợp 2 gồm 5 gen: Muc-1 [Genebank:NM_002456], cyclin E2 - có khả năng gây u trên chuột NOD/SCID với liều 103 TBGUTV khi [Genebank:NM_004702], tiêm dưới da [Genebank:NM_002467], and cyclin D1 [Genebank:BC001501]. - kháng mạnh với verapamil ở nồng độ cao (50 µg/mL) so với tế bào 2.5. ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN KHỐI U TRÊN MÔ HÌNH ung thư vú CHUỘT BẰNG LIỆU PHÁP GEN ĐIỀU HÒA GIẢM BIỂU - âm tính với các mycoplasma chính M. arginini, M. faucium, M. HIỆN CD44 KẾT HỢP VỚI DOXORUBICIN fermentans, M. hyorhinis, M. orale) và Acholeplasma laidlawii. LEF1 [Genebank:NM_016269], EGFR [Genebank:NM_005228], TCF7 Myc Trong thí nghiệm này, chúng tôi xác định tỉ lệ xâm nhiễm cho 3. Liệu pháp gen điều hòa giảm biểu hiện CD44 được thiết lập hiệu quả nhất giữa lượng hạt virus mang shRNA CD44 và tế bào của thành công trên mô hình chuột. khối u. Các tỉ lệ được khảo sát bao gồm 2:1, 1:1 và 1:2 tương ứng với 18 7 tỉ lệ giữa TBGUTV và hạt lentivirut mang shRNA CD44 với lô đối sau 18 ngày ghép, trong khi đó có đến 100% chuột mang khối u trong chứng không bổ sung hạt lentivirut. Các tế bào được nuôi tiếp tục 5 lô đối chứng sau 15 ngày tiêm PBS. ngày sau khi nhiễm với lentivirut và sử dụng để phân tích tỉ lệ phần trăm tế bào biểu hiện CD44 bằng kĩ thuật flow cytometry. Về khả năng di cư của tế bào tua ghép đến lách, phân tích sự tồn tại tín hiệu huỳnh quang Vybrant Dil-CM đã đánh dấu trên tế bào Sau đó, chuột NOD/SCID được tiêm TBGUTV để gây tạo tua bằng kĩ thuật flow cytometry cho thấy có 0,095±0,018% tế bào tua khối u dưới da. Sau 2 tuần, khối u hình thành và đủ lớn, chúng được ghép hiện diện trong lách trong tổng số tế bào lách. Kết quả phân tích chia thành 4 nhóm. Nhóm 1 (đối chứng, 4 con), các chuột mang u mô học quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cũng cho thấy có sự không được điều trị. Nhóm 2 (Doxorubicin –Dox), chuột được tiêm tồn tại tín hiệu huỳnh quang trong lát cắt lách. vào khối u doxorubicin với liều 2mg/kg hàng tuần trong 4 tuần. Nhóm Tiếp theo việc đánh giá sự thay đổi đáp ứng miễn dịch khi 3 (shRNA), chuột được tiêm với CD44 shRNA lentivirut với liều ghép tế bào tua thông qua thành phần tế bào CD8 và CD45 trong lách được xác định trong thí nghiệm trên. Nhóm 4 (CD44 shRNA kết hợp so với chuột đối chứng và chuột bình thường cho thấy tỉ lệ tế bào CD8 với doxorubicin, shRNA+Dox), chuột được tiêm CD44 shRNA tăng cao hơn so với chuột đối chứng và chuột bình thường (tương ứng lentivirut với lượng tương đương nhóm 3 cùng với doxorubicin với là 26,33%; 9,52% và 2,61% trong chuột ghép tế bào tua, chuột bình lượng và chế độ tiêm cùng với nhóm 2. Kích thước và trọng lượng thường và chuột đối chứng). Điều này cho thấy rằng việc ghép tế bào khối u được ghi nhận. tua đã kích hoạt đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào T gây độc. Kết 2.6. TÁC ĐỘNG CỦA TẾ BÀO TUA ĐƯỢC NẠP DỊCH CHIẾT quả phân tích cũng cho thấy việc ghép tế bào tua đã làm tăng tỉ lệ tế TBGUTV LÊN MÔ HÌNH CHUỘT MANG KHỐI U VÚ bào CD45 so với chuột đối chứng (76,97% so với 48,11%). Tuy Trong thí nghiệm này, dịch chiết TBGUTV được tạo ra như sau 5.106 TBGUTV được thu nhận cho vào ống li tâm 1.5 mL. Tế bào nhiên, tỉ lệ này tương đối thấp so với chuột bình thường. Điều này là vì tác động của chất ức chế miễn dịch. được xử lí với 400µl Pro-PREP và trộn kĩ. Huyền phù này được làm lạnh nhanh trong -200C trong 10-20 phút. Dịch nổi tế bào được chuyển sang ống li tâm mới và bảo quản để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Tế bào tua được biệt hóa từ tế bào đơn nhân tủy xương chuột. Chuột mô hình u vú được tạo ra bằng cách tiêm 106 TBGUTV vào dưới da vùng mỡ vú chuột. Để ức chế sự đào thải tế bào ghép, chuột được tiêm busulfan (liều 20 mg/kg) và cyclophosphamide (liều 200 mg/kg). Chế phẩm tế bào tua sử dụng để tiêm cho chuột được tạo ra như sau 100 µl dịch chiết TBGUTV được thêm vào 1 mL tế bào tua 8 17 shRNA riêng rẽ là như nhau; nhưng khi kết hợp, chúng có thể gây tác tương ứng 106 tế bào tua. Ủ hỗn hợp này trong 24 giờ ở tủ ấm 370C. động ức chế mạnh với sự thay đổi kích thước, trọng lượng có ý nghĩa Sau khi đã nạp kháng nguyên, tế bào tua được nhuộm với chất phát thống kê so với các lô điều trị riêng rẽ. huỳnh quang Vybrant Dil-CM để theo dõi sự di cư của chúng khi tiêm So với chuột đối chứng, kích thước khối u giảm đi 1,74; 3,04 vào chuột. và 12,47 lần tương ứng trong trong nhóm Doxorubicin, CD44 shRNA, Phác đồ điều trị trên chuột: sau 10 ngày chuột được tiêm với và CD44 shRNA kết hợp doxorubicin. Trong nhóm kết hợp CD44 TBGUTV được tiêm chế phẩm tế bào tua vào tĩnh mạch với liều là shRNA và doxorubicin, trọng lượng khối u giảm đáng kể đến 4,38 lần 106 tế bào chứa trong 0,2 mL PBS; trong khi đó, chuột trong lô đối so với nhóm đối chứng. chứng chỉ được tiêm 0,2 mL PBS. Chuột được theo dõi sự hình thành Như vậy, sự biểu hiện mạnh CD44 trong TBGUTV có ý nghĩa khối u có thể nhận thấy được bằng mắt thường. Để theo dõi sự di cư quan trọng trong sự tăng sinh, sự kháng thuốc của các tế bào này. Từ của tế bào ghép, một số chuột được giết vào ngày 3 sau khi ghép, lách kết quả nghiên cứu, chúng tôi cho rằng liệu pháp kết hợp giữa điều của chuột được thu nhận để đánh giá sự tồn tại tế bào ghép. Sự kích hòa giảm biểu hiện CD44 và doxorubicin có thể ức chế mạnh sự phát hoạt hệ miễn dịch của chuột ghép tế bào tua cũng được khảo sát thông triển của khối u so với đối chứng. Kết quả này hứa hẹn cho một liệu qua sự thay đổi thành phần tế bào CD45 và tế bào lympho T CD8 pháp mới sử dụng kết hợp liệu pháp gen và hóa trị liệu để tấn công trong lách. TBGUTV trong điều trị UTV. 3.4. LIỆU PHÁP TẾ BÀO TUA LÀ LIỆU PHÁP TIỀM NĂNG TRONG ĐIỀU TRỊ UTV Trong thí nghiệm đầu tiên chúng tôi đã chuẩn bị thành công TBGUTV và tế bào tua. Các TBGUTV tăng sinh đủ số lượng để tiến hành các thí nghiệm nhưng vẫn giữ kiểu hình CD44+CD24-. Các tế bào tua được biệt hóa từ tế bào đơn nhân tủy xương chuột. So với, trước khi cảm ứng các tế bào biểu hiện một số đặc điểm kiểu hình như CD40, CD80 và CD86, trong khi đó CD14 thì không biểu hiện. Sau đó, các tế bào tua này được nạp kháng nguyên TBGUTV để hoạt hóa đáp ứng miễn dịch chuyên biệt với TBGUTV. Đáp ứng này được đánh giá thông qua 3 chỉ tiêu: hiệu quả điều trị ung thư trên chuột, sự di cư của tế bào tua ghép vào đến lách và sự thay đổi thành phần tế bào T CD8 và T CD45 trong tách. Về hiệu quả ức chế sự phát triển khối u, kết quả cho thấy trong lô thí nghiệm có khoảng 60,0 ± 20% chuột không mang khối u 16 9 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1. PHÂN LẬP THÀNH CÔNG TẾ BÀO UNG THƯ Sự thay đổi biểu hiện các gen quan trọng đã kéo theo sự thay đổi trong chu kì TBGUTV bị làm giảm biểu hiện CD44 theo kiểu của Kết quả cho thấy rằng tế bào từ mô với hai hình dạng chính: tế tế bào không phải TBGUTV. Pha S của tế bào tăng và pha G2/M lại bào giống tế bào biểu mô và tế bào giống trung mô (nguyên bào sợi, tế giảm trong TBGUTV bị làm giảm biểu hiện CD44 và tương tự ở tế bào nền). Sự khác biệt giữa hai kiểu tế bào này có thể nhận diện bằng bào không có kiểu hình TBGUTV. nhuộm với kháng thể kháng CD90 và phân tích bằng flow cytometry: Sự khác biệt chính được khảo sát tiếp theo là khả năng gây u một quần thể dương tính CD90 và một quần thể âm tính CD90. Tuy khi tiêm chúng vào chuột. Tiềm năng sinh u là tiêu chuẩn vàng để nhiên, chúng không phải là TBUTV. Thật vậy, những tế bào biểu mô đánh giá một tế bào có phải là TBGUT. Kết quả cho thấy, khi tiêm 103 bình thường cũng tồn tại trong khối u vú này. Để làm giàu và nâng cao TBGUTV có khả năng gây u trong chuột NOD/SCID, trong khi đó độ tinh sạch TBUTV, chúng tôi nuôi sơ cấp các mảnh mô trong môi TBGUTV đã bị làm giảm biểu hiện CD44 cần đến 106 tế bào để gây u, trường chuyên biệt cho TBUT biểu mô phát triển và loại bỏ các tế bào tương tự quần thể tế bào không có kiểu hình TBGUTV. nhiễm. Chúng tôi đặt tên cho dòng TBUTV ứng viên thu nhận được là Như vậy, việc điều hòa giảm biểu hiện CD44 đã gây biệt hóa VNBRC1. Để khẳng định các tế bào thu nhận được là TBUTV, các thí TBGUTV thành kiểu hình tế bào không mang tính gốc. nghiệm tiếp theo, chúng tôi đã tiến hành các phân tích biểu hiện các 3.3.3. Liệu pháp gen điều hòa giảm biểu hiện CD44 ức chế khối u gen liên quan đến sự di căn và hình thành ung thư. Kết quả cho thấy vú trên mô hình chuột NOD/SCID rằng có những khác biệt quan trọng trong sự biểu hiện những gen này Từ kết quả của các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng giữa VNBRC1 với tế bào tuyến vú bình thường nhưng lại tương tự với việc kết hợp liệu pháp biệt hóa bằng điều hòa giảm biểu hiện CD44 tế bào MCF-7, đặc biệt những gen liên quan đến UTV. So với tế bào với hóa trị liệu có thể ức chế và tiêu diệt khối u. Trong thí nghiệm này, MCF-7, VNBRC1 biểu hiện nhiều gen liên quan sự di căn mạnh hơn. chúng tôi tiến hành thử nghiệm cận lâm sàng điều trị khối u vú trên Dựa vào những kết quả này, chúng tôi khẳng định rằng các tế bào thu mô hình chuột bằng liệu pháp kết hợp giữa liệu pháp gen điều hòa nhận được là TBUTV. VNBRC1 không giống với MCF-7 bởi vì giảm CD44 và hóa trị liệu với thuốc chống khối u doxorubicin. chúng biểu hiện này gen liên quan đến di căn mạnh (Mucin 1, Cyclin E2, EGF receptor, Myc và Cyclin D1) hơn ở tế bào MCF-7. Sau 48 giờ, được tiêm với vector lentivirut CD44 shRNA, chuột được điều trị với doxorubicin. Thời điểm này được chọn dựa Một số đặc điểm khác của VNBRC1 cũng được xác định như vào các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng virut có thể xâm nhiễm và chúng biểu hiện rất thấp gen BRCA1. Gen này liên quan đến sự rủi ro ức chế sự biểu hiện gen sau 24 giờ. Doxorubicin được sử dụng ở liều hình thành UTV cũng như nhiều ung thư khác. BRCA1 là gen ức chế 2 mg/kg trọng lượng chuột. Kết quả cho thấy rằng sự khác biệt có ý khối u, duy trì sự toàn vẹn bộ gen và ngăn chặn các đột biến gây nên nghĩa thống kê về kích thước và trọng lượng của khối u giữa các lô ung thư. Do đó, sản phẩm gen này được cho là có vai trò sửa chữa chuột khác nhau. Việc điều trị bằng doxorubicin và shRNA CD44 DNA, điều hòa sự phiên mã gen cũng như nhiều chức năng khác. Gen riêng rẽ hay kết hợp đều có tác động ức chế sự phát triển khối u. Tuy này biểu hiện rất thấp trong một số ung thư, đặc biệt UTV. VNBRC1 nhiên, tác động ức chế của việc điều trị với doxorubicin hay CD44 10 15 cũng được khẳng định trong các TBUT dương tính với CD44 và biểu hiện gen này rất thấp và thấp hơn trên dòng TBUTV thương mại TBUT tuyến liệt. MCF-7. Dựa vào kết quả của nghiên cứu này, chúng tôi đã giả thuyết Tiêu chuẩn vàng để khẳng định liệu một quần thể tế bào có rằng CD44 có thể là mục tiêu để điều trị ung thư, đặc biệt UTV. Sử phải là TBUT là khả năng gây u của chúng khi tiêm vào chuột suy dụng siRNA CD44 tấn công TBGUTV với kiểu hình CD44+CD24_ có giảm miễn dịch hay chuột NOD/SCID. Trong nghiên cứu này, thể là chiến lược liệu pháp gen hiệu quả để điều trị UTV. Tuy nhiên, VNBRC1 có thể gây u trên chuột suy giảm miễn dịch và chuột ứng dụng liệu pháp gen để làm giảm biểu hiện gen CD44 vẫn đương NOD/SCID khi tiêm 2.106 tế bào với 1 lần tiêm duy nhất. đầu với các thử thách lớn bởi vì nhiều tế bào trong cơ thể dương tính Tóm lại, trong nội dung thứ nhất của nghiên cứu, chúng tôi đã với CD44. Do đó, liệu pháp gen tiêm vào khối u với thiết lập thành công hai dòng TBUTV từ khối u vú ác tính của phụ nữ polyethylenimine/siRNA CD44 có thể là lựa chọn tốt nhất trong Việt Nam. Chúng tôi đặt tên chúng là VNBRC1 và VNBRC2 (là từ trường hợp này. viết tắt của Vietnamses breast cancer cells 1 và Vietnamese breast 3.3.2. Làm giảm biểu hiện CD44 gây nên sự biệt hóa của cancer cells 2). So với các kĩ thuật khác, nghiên cứu này đã xây dựng TBGUTV kĩ thuật mới trong thiết lập dòng TBUTV với một số thuận lợi. Các kĩ Trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi xác định cơ chế tác thuật trước sử dụng kĩ thuật nuôi cấy sơ cấp và cấy chuyền liên tục để động của việc làm giảm biểu hiện của CD44 lên tính kháng thuốc điều đạt quần thể TBUTV tinh sạch. Mặc dù kĩ thuật này cũng có một số trị ung thư. Chúng tôi tiến hành làm giảm biểu hiện CD44 bằng vector lợi ích như dễ tiến hành, rẻ nhưng đương đầu với việc nhiễm các tế lentivirut shRNA và chọn lọc puromycin để tạo quần thể tế bào giảm bào khác như tế bào biểu mô bình thường, nguyên bào sợi và tốn thời biểu hiện CD44 ổn định. gian. Cải tiến kĩ thuật này, chúng tôi sử dụng kĩ thuật loại bỏ các tế Sau đó, tính gốc của 3 quần thể tế bào, bao gồm: TBGUTV, bào nhiễm bằng môi trường nuôi, cấy chuyền liên tục và chọc lọc tế TBGUTV đã làm giảm biểu hiện gen CD44 và tế bào không phải bào quan tâm bằng loại bỏ các tế bào không mong muốn bằng marker TBGUTV (tế bào không biểu hiện kiểu hình CD44+CD24- thu nhận từ bề mặt. quần thể TBUTV) được so sánh với nhau. Các chỉ tiêu so sánh bao 3.2. PHÂN LẬP THÀNH CÔNG TBGUTV TỪ DÒNG TBUTV gồm: sự biểu hiện các gen liên quan đến TBG và di căn, sự kháng VIỆT NAM thuốc, sự thay đổi chu kì tế bào, khả năng hình thành khối u in vivo trong chuột NOD/SCID. Kết quả của chúng tôi tương tự với những phát hiện của AlHajj và cs về quần thể TBGUTV trong khối u ác tính. Đó là chỉ có Kết quả cho thấy TBGUTV bị làm giảm biểu hiện gen có sự một quần thể nhỏ TBGUTV với kiểu hình CD44+CD24-/dim trong khối biểu hiện giảm rõ rệt các gen khảo sát và tương tự mức biểu hiện ở tế u vú ác tính. Tuy nhiên, kết quả của Honeth và cs (2008) cho thấy có bào không phải TBGUTV. Đặc biệt các gen liên quan đến khả năng di đến 31% tế bào có kiểu hình này trong khối u vú ác tính. Ở một căn như Muc-1, MMP9, Myc giảm biểu hiện mạnh ở TBGUTV bị nghiên cứu khác, các tác giả cho thấy có đến 59% tế bào biểu hiện điều hòa giảm CD44 và tương tự ở tế bào không có kiểu hình TBG. kiểu hình CD44+CD24- trong khối u vú. 14 11 Quần thể tế bào thu nhận được biểu hiện mạnh protein CD44, nói cách khác, điều hòa giảm biểu hiện CD44 đã làm TBGUTV nhạy nhưng không biểu hiện hay biểu hiện yếu protein CD24 trên bề mặt tế cảm với tác nhân chống ung thư. Thật vậy CD44 là một protein xuyên bào. Kết quả này được khẳng định bởi kĩ thuật flow cytometry và hóa màng được tổng hợp ở dạng nhiều isoform bởi mRNA splicing. Mặc tế bào miễn dịch. Theo kết quả của Clarke và cs (2006), cấy ghép dị dù CD44 thiếu domain quan trọng cho sự truyền tín hiệu, nó cũng loại sử dụng để tách quần thể tế bào CD44+CD24- có tiềm năng gây u được mô tả là cần thiết cho sự “trở về nhà” và chứa một số đặc điểm trong mô hình chuột NOD/SCID. Họ cho thấy rằng 200 tế bào với quan trọng cho TBGUT máu. Có một số bằng chứng rằng CD44 hỗ kiểu hình này có thể gây u khi tiêm vào chuột NOD/SCID trong khi trợ sự bám dính in vitro và sự phát triển của khối u cũng như sự di căn đó khi tiêm 20.000 tế bào không biểu hiện kiểu hình trên vẫn không trong khối u rắn. Chức năng kích thích khối u của CD44 xảy ra thông có khả năng gây u in vivo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiêm qua sự đồng kích thích với các tín hiệu bởi các thụ thể của các nhân tố 1000 TBGUTV mà chúng tôi thu nhận được thì cũng có khả năng gây tăng trưởng như EGF receptor-2 (Her 2), EGF receptor 1 (Her1) và u. yếu tố phát triển tế bào gan (Met). CD44 cũng được xem là các Trong xét nghiệm tiếp theo, chúng tôi kiểm tra đặc tính tiếp marker hữu dụng để phát hiện và làm giàu TBGUT. Các tế bào dương theo của TBGUTV là khả năng tự làm mới bằng kĩ thuật nuôi cấy tạo tính CD44 có khả năng di căn và gây u. Hơn nữa, marker CD44 được mammosphere. Kết quả cho thấy các TBGUTV thu nhận được có khả sử dụng để tách TBGUT tuyến tiền liệt, tuyến tụy và đại tràng. Một năng tạo mammosphere manh. đặc điểm quan trọng của TBGUT trong khối u là sự biểu hiện cao của Đặc tính kháng thuốc của TBGUT cũng được khảo sát trong các ABC transporter, đặc biệt ABCG2. Vì thế các TBGUT có khả nghiên cứu này. Các TBGUT với kiểu hình CD44+CD24- kháng mạnh năng kháng thuốc, ngay cả hóa trị liệu. Về lâm sàng, hóa trị liệu có thể với thuốc verapamil so với TBUTV không biểu hiện kiểu hình này. tiêu diệt hầu hết các tế bào trong khối u rắn. Tuy nhiên, một quần thể Từ nội dung này, chúng tôi đã tạo được 2 dòng TBGUTV, nhỏ các tế bào gọi là TBGUT có khả năng kháng thuốc, bởi vì sự hiện được đặt tên là BCSC1 và BCSC2. diện của các kênh ABC transporter giúp đẩy các thuốc trị ung thư ra 3.3. CD44 LÀ ĐÍCH TIỀM NĂNG TRONG ĐIỀU TRỊ TRÚNG ngoài. Sự biểu hiện gia tăng của ABC transporter trong TBGUT dẫn ĐÍCH UTV đến sự đào thải Hoechst 33342 và Rhodamine 123 mà có thể phát hiện 3.3.1. Điều hòa giảm biểu hiện CD44 làm giảm tính kháng thuốc bằng kĩ thuật flow cytometry. Những tế bào có khả năng này gọi là của TBGUTV quần thể phụ. Các TBGUTV bị điều hòa giảm biểu hiện CD44 nhạy cảm với Trong nghiên cứu này, sự làm giảm biểu hiện của CD44 làm doxorubicin hơn các TBGUTV. Ngay khi ở nồng độ cao, doxorubicin giảm tính kháng thuốc của TBGUTV. Điều này cho thấy rằng sự thất bại giết các TBGUTV CD44+CD24-, trong khi đó ở nồng độ này tương quan giữa tính kháng thuốc và sự biểu hiện của CD44 hay các doxorubicin có thể gây apoptosis ở TBGUTV bị điều hòa giảm biểu con đường truyền tín hiệu liên quan đến protein này. Sự điều hòa giảm hiện CD44. Điều này cho thấy rằng việc điều hòa giảm biểu hiện biểu hiện của CD44 có thể ức chế sự tăng sinh và gây nên apoptosis CD44 đã làm giảm khả năng kháng doxorubicin của TBGUTV. Hay 12 13