Tài liệu Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm cao trong tự nhiên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------o0o-------------- TRẦN THỊ NGA Tên đề tài: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO TRONG TỰ NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------o0o-------------- TRẦN THỊ NGA Tên đề tài: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO TRONG TỰ NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo :Chính quy Chuyên ngành:Công nghệ sinh học Lớp :K44 - CNSH Khoa :CNSH & CNTP Khóa học :2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Trần Văn Chí Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công nghệ Lên men, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa CNSH - CNTP, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình. Trước hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Văn Chí, giảng viên Khoa CNSH - CNTP, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này. Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Vi Đại Lâm, giảng viên Khoa CNSH CNTP, người đã hướng dẫn em các thao tác thực hành và chỉ ra cho em những sai lầm giúp em hoàn thành tốt khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khoá luận này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Sinh viên thực hiện Trần Thị Nga ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1.Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất ........................10 Bảng 2.2. Sự hiện diện của vi khuẩn Azosprillum ở một số loại hoa màu................16 Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ...................................................26 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ......................................................27 Bảng 3.3: Môi trường thạch Burk’ không đạm .........................................................27 Bảng 3.4: Môi trường thạch Ashby...........................................................................27 Bảng 3.5: Môi trường Dobereiner và cộng sự .........................................................28 Bảng 3.6: Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) ..................................................28 Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, kích thước các vi khuẩn cố định đạm phân lập được. ......................................................................................36 Bảng 4.2:Khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn đã phân lập được ............38 Bảng 4.3: Hàm lượng đạm của chủng vi khuẩn ĐT1 trong môi trường Dobereiner lỏng ..............................................................................................................39 Bảng 4.4.Kết quả đo OD của IAA chuẩn ở các nồng độ khác nhau .........................40 Bảng 4.5. kết quả đo OD của chủng ĐT1 qua thời gian ............................................41 Bảng 4.6. Đặc điểm hình thái, Gram của chủng vi khuẩn ĐT1 .................................43 Bảng 4.7. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng vi khuẩn ĐT1 .................................43 Bảng 4.8. Kết quả đo mật độ tế bào của chủng ĐT1 sau 48h ở mức sóng 660nm ....45 Bảng 4.9 Kết quả định danh sơ bộ chủng vi khuẩn cố định đạm (ĐT1) phân lập.....46 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến mật độ tế bào của chủng ĐT1 sau 0h và 48h nuôi cấy ................................................................................46 Bảng 4.11. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của chủng ĐT1 ....................................................................................................48 Bảng 4.12. ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng ĐT1 ..................49 Bảng 4.13. Kết quả đo mật độ tế bào trên các môi trường thay thế của chủng ĐT1 .....50 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1. Chủng vi khuẩn ĐT1 tuyển chọn được sau 4 ngày trên môi trường Ashby .....39 Hình 4.2. Đồ thị đường tương quan tuyến tính giữa hàm lượng IAA chuẩn và OD530nm ........................................................................................................40 Hình 4.3. Đồ thị hàm lượng IAA của chủng ĐT1 sinh ra qua thời gian ...................41 Hình 4.4. Các ống nghiệm chứa các nồng độ IAA(µg/ml) chuẩn khác nhau phản ứng với thuốc thử Salkowski .......................................................................42 Hình 4.5. Phản ứng màu IAA với thuốc thử salkowski của chủng ĐT1 nuôi cấy 5 ngày ..........................................................................................................42 Hình 4.6. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của chủng ĐT1 .........................................43 Hình 4.7. Thử nghiệm khả năng quan hệ với oxy và khả năng sinh khí của chủng ĐT1 ...............................................................................................................44 Hình 4.8. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dịch thể Dobereiner của chủng ĐT1 ....................................................................................................44 Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến chủng ĐT1...................47 Hình 4.10 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của chủng ĐT1 .48 Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn ĐT1 ....49 iv DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ATP: Adenosin Triphosphat DNA: Deoxyribonucleic acd IAA: Indole – 3 – acetic acid OD: Optical Density RNA: Ribonucleic acid v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... ii DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... iii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT .................................................................. iv MỤC LỤC ...................................................................................................................v PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích đề tài .....................................................................................................3 1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................3 1.4. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................3 1.4.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................3 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................4 2.1.Cơ sở khoa học ......................................................................................................4 2.1.1. Đạm ...................................................................................................................4 2.1.2. Auxin (IAA) ......................................................................................................8 2.1.3. Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ................................................................11 2.1.4. Một số vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp auxin .......................15 2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .........................................................20 2.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ...................................................................20 2.2.2. Nghiên cứu trong nước....................................................................................22 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...26 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................26 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................26 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ...............................................................................26 3.3.1. Hóa chất ..........................................................................................................26 3.3.2. Thiết bị sử dụng ..............................................................................................27 3.4. Môi truờng sử dụng ...........................................................................................27 3.5. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................28 3.6. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................29 vi 3.6.1. Phương pháp thu thập mẫu..............................................................................29 3.6.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn. ............................................................29 3.6.3. Phương pháp mô tả đă ̣c điể m hin ̀ h thái , đă ̣c điể m sinh ho ̣c của các chủng vi khuẩ n cố đinh ̣ đa ̣m. ...................................................................................................32 3.6.4. Nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế .......................................................35 3.6.5. Phương pháp định danh sơ bộ .........................................................................35 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................36 4.1. Kết quả nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trong tự nhiên......................................................................................36 4.1.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trong tự nhiên ..........................................................................................................................36 4.1.2. Kết quả tuyển chọn..........................................................................................38 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh IAA của chủng ĐT1 ....................................40 4.3. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn ĐT1 .................................................................................................................42 4.4. Kết quả định danh sơ bộ chủng vi khuẩn ĐT1 phân lập được ............................45 4.5. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối của chủng ĐT1 .........46 4.5.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của chủng ĐT1. ................................................................................................................46 4.5.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khố của chủng ĐT1 ............................................................................................................................48 4.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn ĐT1 ............................................................................................................................49 4.6. Kết quả nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế. .............................................50 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................51 5.1. Kết luận ..............................................................................................................51 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nitơ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng và do đó nó quyết định năng suất và chất lượng thu hoạch. Nitơ có trong thành phần của hầu hết các chất trong cây: protein, axit nucleic, các sắc tố quang hợp, các hợp chất dự trữ năng lượng: ADP, ATP, các chất điều hoà sinh trưởng ,… Như vậy nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa tham gia trong các quá trình trao đổi chất và năng lượng. Nitơ có vai trò quyết định đến toàn bộ các quá trình sinh lý của cây trồng. Nitơ trong tự nhiên tồn tại dưới 3 dạng: N hữu cơ, N vô cơ và nitơ ở dạng tự do(N2) trong khí quyển. Cây chủ yếu hút N vô cơ, còn dạng N2 trong khí quyển thì cây không đồng hóa trực tiếp mà phải nhờ sự cố định của các vi sinh vật trong đất. Dạng nitơ vô cơ mà cây đồng hóa là nitrat (NO3-) và amon (NH4+) [29]. Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu được không chỉ đối với cây trồng, mà ngay cả đối với vi sinh vật (VSV). Nguồn dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn. Người ta ước tính rằng trong bầu không khí bao trùm lên 1ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn nitơ, lượng nitơ này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng hàng chục triệu năm (nếu như cây đồng hóa được chúng). Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất chứa khoảng 10 – 25.109 tấn nitơ. Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4.1015 tỷ tấn nitơ. Nhưng tất cả nguồn nitơ trên cây trồng không thể tự đồng hóa được mà phải nhờ VSV. Thông qua hoạt động của các loài VSV nitơ nằm trong các dạng khác nhau được chuyển hóa thành các dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn nitơ. Bằng cách bón phân,con người trả lại cho đất được khoảng > 40%, lượng thiếu hụt còn lại cơ bản được bổ sung bằng nitơ do hoạt động sống của VSV cố định nitơ [31]. Người ta nhận thấy rằng muốn có thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng cần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ. Hiệu suất sử dụng phân hóa học của cây trồng 2 là vào khoảng 75%. Như vậy có nghĩa là nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ của phân hoá học thì muốn có 5 tấn hạt chúng ta phải bón vào mỗi hecta khoảng 116,6kg nitơ (tương đương với 833kg amôn sunphát). Số lượng nitơ này thật khó có thể thỏa mãn ngay cả ở nước có công nghiệp phân nitơ hóa học phát triển [10]. Vậy làm thế nào để trả lại độ phì nhiêu cho đất mà vẫn đảm bảo tiêu chuẩn về năng suất và chất lượng cho cây trồng? Đó là sử dụng sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ đa chủng từ các nguồn khác nhau, đây chính là giải pháp hay nhất hiện nay có thể giải quyết được các vấn đề trên. Tại Ấn Độ, sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ cho lúa, cao lương, bông làm tăng năng suất trung bình 11,4%, 18,2% và 6,8% hay mang lại lợi nhuận 1015 rupi, 1149 rupi và 343 rupi/ ha. Tại Liên Bang Nga, bón chế phẩm VSV cố định nitơ cho tăng năng suất khoai tây 12,8 tạ/ha, tăng năng suất cà chua 28,0 tạ/ha, tăng năng suất ngô hạt 22,4 tạ/ha, tăng năng suất cây bắp cải 72,5 tạ/ha. Ở Việt Nam các thử nghiệm sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh ở 15 tỉnh miền Bắc, miền Trung, và miền Nam trên diện tích hàng chục ngàn ha cho thấy trong cùng điều kiện sản xuất, ruộng lúa được bón phân VSV cố định nitơ đề tốt hơn so với đối chứng, biểu hiện ở bộ lá phát triển tốt hơn, tỉ lệ nhánh hữu hiệu, số bông/khóm nhiều hơn đối chứng. Năng suất hạt tăng so với đối chứng 6 – 12%, nhiều nơi đạt 15 – 20%. Những ruộng bón phân VSV cố định nitơ giảm bớt 1kg đạm ure cho mỗi sào, năng suất vẫn tăng so vớ đối chứng. Đối với rau (xà lách, rau diếp, khoai tây…) bón phân VSV cố định nitơ cũng làm tăng sản lượng thu hoạch 20- 30%. Việc bón phân VSV cố định nitơ còn làm tăng khả năng chống chịu cho cây và giảm lượng nitơ tồn dư trong rau. Hiệu quả kinh tế do sử dụng phân VSV cố định nitơ là rõ rệt. Ngoài tác dụng trên phân VSV thông qua các hoạt chất sinh học của chúng còn có tác dụng điều hòa, kích thích quá trình sinh tổng hợp của cây trồng, đồng thời nâng cao sức đề kháng của cây trồng đối với một số sâu, bệnh hại.( đã được nghiên cứu trên cây khoai tây) [31]. Do đó việc nghiên cứu phân lập các vi sinh vật cố định nitơ là rất cần thiết. 3 Hiện nay ở nước ta đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ lúa, rễ cây lạc, cây cà phê, rễ cây ngô…Tuy nhiên , những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm cho các cây lúa, lạc, đậu , chè là rất ít. Đặc biệt là chưa có nghiên cứu nào về thành phần loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm trong rễ và trong đất cây chè, lúa, đâu,lạc tại tỉnh Thái Nguyên Xuất phát từ thực tế đó em tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm cao trong tự nhiên”. 1.2. Mục đích đề tài - Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm cao trong tự nhiên 1.3. Yêu cầu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao, khảo sát khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của các chủng vi khuẩn cố định đạm trong tự nhiên. - Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được ở trên. - Nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế. - Định danh các vi khuẩn trên. 1.4. Ý nghĩa của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học. - Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này. - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao và có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong ngành công nghiệp sản xuất phân đạm vi sinh. Đem lại năng suất, chất lượng cao cho ngành nông nghiệp, đồng thời tạo ra sản phẩm thân thiện với môi trường. - Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Cơ sở khoa học 2.1.1. Đạm 2.1.1.1. Nhu cầu đạm của cây  Vai trò của đạm đối với cây trồng Đạm (Nitơ) là nguyên tố không thể thiếu đối với các cơ thể sinh vật nói chung , do đạm là thành phần cơ bản và thường chiếm 15 -17% của chất protein, mà protein là chất biểu hiện của sự sống. “Sự sống là phương thức tồn tại của protein”, không có N thì không có protein và cũng không có sự sống, vì vậy cây không có đạm thì cây sẽ chết. Đạm có nhiều trong các hợp chất hữu cơ, rất cơ bản và rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây: Diệp lục, các acid nucleic (DNA và RNA), các loại men, bazơ có đạm, một số hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Các hợp chất hữu cơ nêu trên không thể thiếu đạm trong thành phần và mỗi chất đều có những vai trò quan trọng trong đời sóng của cây. Diệp lục là cơ quan không thể thiếu của quá trình quang hợp, tổng hợp các chất hữu cơ cho toàn thể giới sinh vật. Các acid nucleic (DNA và RNA) là các chất mang thông tin di truyền chỉ huy việc tổng hợp protein của cây, khi thiếu các chất này dù trong cây có đủ các nguyên liệu thì cũng không tỏng hợp được protein. Các loại men là các chất xúc tác sinh học rất quan trọng làm cho quá trình chuyển hóa vật chất có thể thực hiện được với tốc độ lớn ngay trong điều kiện bình thường. Đạm là yếu tố cơ bản của quá trình đồng hóa carbon vì nằm trong thành phần của diệp lục, đạm có tác dụng kích thích sự phát triển của bộ rễ và việc hút các yêu tố dinh dưỡng khác của cây. Trong cây luôn tồn tại mối quan hệ chặt chẽ giữ lượng N cây hút được và việc hút các yếu tố dinh dưỡng khác của cây [17]. 5 Đối với cây trồng đạm là yếu tố chính, yếu tố quyết định sự sinh trưởng phát triển và năng suốt của cây. Điều này được thể hiện rất rõ ở cây trồng bằng các biểu hiện về hình thái và năng suất không chỉ khi cây thiếu và đủ đạm mà cả khi cây thừa đạm. Khi cây trồng được cung cấp đủ đạm lá có màu xanh lục tươi, sinh trưởng phát triển nhanh, khỏe mạnh, có nhiều chồi, búp, lá, cành (nhánh), kết quả tích lũy được nhiều chất khô và năng suất cao. Theo A.Gross (1977) tính trung bình 1 kg N cho: 15 kg hạt ngũ cốc và 25 kg rơm rạ, 10 kg đường, 70 kg khoai tây, 12 -15 lít sữa, 2 – 2,5 kg thịt hơi [17]. 2.1.1.2. Phân đạm Phân đạm là từ chung , dùng để chỉ các loại phân có chứa nitơ. Phân đạm có vai trò quan trong trong việc phát triển bộ rễ, thân, lá, chiều cao và đặc biệt quan trọng trong giai đoạn tăng trưởng mạnh của các loại rau. Hầu hết đạm hóa học được sản xuất theo quy trình Haber – Bosch, đòi hỏi một lượng lớn khí tự nhiên, than đá, hoặc dầu mỏ. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng để sản xuất 1 tấn phân đạm hóa học cần 1,3 tấn dầu, để sản xuất 80 triệu tấn phân đạm hóa học cần 100 triệu tấn dầu, bằng 1,4% số dầu sử dụng trên toàn cầu. Dầu cần cho sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, giao thông vận tải... Khai thác quá mức thì nguồn tài nguyên này cũng sẽ cạn kiệt, không còn cho các thế hệ sau [32]. Thêm vào đó việc sản xuất đạm sẽ sinh ra một lượng lớn CO2 – một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính mà cả thế giới đang tìm cách khắc phục. Hơn nữa, chỉ có khoảng 1/3 lượng phân bón vào đất mà cây trồng có thể sử dụng, lượng đạm còn thừa sẽ thất thoát ra môi trường bên ngoài gây ô nhiễm nguồn nước mặt và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Việc sử dụng quá mức lượng đạm hóa học sẽ dẫn đến sự sản sinh N2O cũng gây ra hiện tượng nóng lên toàn cầu [82]. 2.1.1.3. Tầm quan trọng của quá trình cố định đạm  Cố định đạm hóa học Trong không khí, phân tử nitơ thường tồn tại ở trạng thái liên kết hai nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ nối bà bền vững (N...N). Năng lượng cần cho sự phá vỡ liên kết này khoảng 225kcal nên cây trồng ( cũng như các loài động vật) không có khả 6 năng đồng hóa nguồn nitơ này. Vì vậy việc nghiên cứu phá vỡ các liên kết này để tạo ra dạng nitơ dễ hấp thu đối với cây xanh là hết sức cần thiết [7]. Năm 1905 lần đầu tiên con người tìm được phương pháp phá vỡ và liên kết với CaC2 để tạo ra một dạng phân đạm hóa học đầu tiên là CaCN2. Muốn thực hiện phản ứng người ta duy trì một nhiệt độ cao từ 1000 – 1100oC: Ít lâu sau các nhà khoa học Nauy lại tìm được cách liên kết N2 với O2 để tạo thành một dạng phân đạm hóa học khác (nitrate) phản ứng này cũng đòi hỏi nhiệt độ cao đến 40000C : Năm 1980 nhà khoa học Đức Ga – be đã tìm được phương pháp liên kết N2 với H2 để tạo thành NH3. Phản ứng này không những đòi hỏi nhiệt độ cao (6000C), áp suất cao (1000atm) mà còn đòi hỏi có mặt một số chất xúc tác đắt tiền. Từ đó đến nay ngành công nghiệp hóa học đã có những tiến bộ rất lớn. Người ta sản xuất rộng rãi nhiều loại phân đạm hóa học khác nhau với sản lượng ngày càng tăng. Nếu như năm 1913 toàn thế giới sản xuất được 0,51 triệu tấn phân đạm thì đến năm 1964 con số này đã tăng lên 29 lần (14,5 triệu tấn) trong khi đó phân kali chỉ tăng 8,4 lần, phân photpho tăng có 5,8 lần [7]. Dù sao thì phân đạm trên thế giới cũng bù đắp được một phần nhỏ số lượng đạm trong đất bị lấy đi hàng năm. Có một số thống kê cho biết hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 – 110 triệu tấn đạm, con số này vượt đến bảy lần so với phân đạm hóa học sản xuất ra ở các nước gộp lại hàng năm. Phân đạm có tác dụng rất lớn đến mùa màng, ví dụ: bón 1 kg đạm thu hoạch thêm được khoảng 10 – 20 kg thóc, 15 – 20 kg ngô hoặc 15 – 40 kg cỏ khô. 7 Khó khăn chủ yếu làm cản trở việc mở rộng nhanh chóng hơn nữa việc sản xuất phân hóa học là vì điều kiện để phá vỡ các liên kết trong phân tử nitơ khong phải là đơn giản (cần nhiệt độ cao, áp suất cao, chất xúc tác đắt tiền).  Cố định đạm sinh học Tương tự như quá trình cố định đạm hóa học, quá trình cố định đạm sinh học cũng là quá trình phá vỡ các liên kết trong phân tử nitơ không khí để tạo thành các dạng nitơ dễ hấp thụ cho cây trồng. Nhưng ở quá trình này việc phá vỡ các liên kết của phân tử nitơ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường. Chính vì vậy mà vai trò của quá trình cố định đạm sinh học có ý nghĩa hết sức lớn lao đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công nghiệp phân đạm chưa phát triển. Các quá trình cố định đạm sinh học trong tự nhiên xảy ra nhờ vi khuẩn cố định đạm. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 160 – 170 triệu tấn nitơ khí quyển đã được cố định và chuyển hóa thành nguồn phân đạm dưới các dạng khác nhau. Trong tự nhiên, nitơ ở dạng khí (N2) và chiếm 80% trong khí quyển. Tuy nhiên, thực vật và động vật không thể sử dụng được dưới dạng này cho sự biến dưỡng của chúng [51]. Chỉ có một số rất ít nhóm sinh vật sơ hạch và các vi khuẩn tự dưỡng đạm có khả năng sử dụng đạm ở thể khí này nhờ các hệ thống sinh hóa rất chuyên biệt. Đó chính là sự cố định đạm sinh học. 2.1.1.4. Phân đạm vi sinh Phân đạm vi sinh (phân bón vi sinh vật cố định nitơ) là sản phẩm chứa một hay nhiều dòng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng cố định nitơ từ không khí cung cấp các hợp chất chứa nitơ cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng suất và chất lượng nông sản, tăng độ màu mỡ của đất. Phân đạm vi sinh không gây ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản [11]. Vi sinh vật cố định nitơ là vi sinh vật sống cộng sinh hay hội sinh với cây trồng, hoặc vi sinh vật sống tự do trong đất, nước, không khí, có khả năng tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường nuôi cấy không chứa hợp chất nitơ (môi trường LGIP, NFb, Ashby, burk’, Dobereiner....) [14]. 8 Phân đạm vi sinh đã được sử dụng nhiều nơi trên thế giới với nhiều tên gọi khác nhau như: Rizonit (Hungary), Nitrobacterin (Anh), Estrasol (Nga), Mana (Nhật, Philipin), Tian-li-bao (Trung Quốc, Hồng Kong)... [35]. 2.1.2. Auxin (IAA) 2.1.2.1. Giới thiệu về Auxin Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là hoocmon sinh trưởng kích thích sự phát triển của thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự dãn dài tế bào, sự phân sinh mô, sự phát triển trái và hạt, chi phối sự phát triển đầu sự phát triển của cây trồng [85]. Auxin là chất thuộc nhóm điều hòa sinh trưởng thực vật đã được phát hiện sớm nhất. Vào năm 1954, các nhóm auxin đã được hội đồng các nhà sinh lý thực vật định danh. Thuật ngữ auxin có nguồn gốc từ Hy Lạp, “Auxein” nghĩa là “Grow” (mọc, sinh trưởng). Auxin phổ biến và quan trọng nhất trong thực vật là Indole-3-acetic acid (IAA) được phát hiện vào thế kỷ XIX. Ngoài ra, con người đã tự tổng hợp rất nhiều các chất có bản chất hóa học khác nhau nhưng chúng có hoạt tính sinh lý tương tự như IAA gọi là auxin tổng hợp. Các auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi trong sản xuất là IBA, α – NAA, 2,4D... [29]. Công thức hóa học của một số auxin 9 2.1.2.2. Lịch sử phát triển Năm 1980 Darwin đã phát hiện ra rằng bao lá mầm của cây họ lúa rất nhạy cảm với ánh sáng. Ông cho rằng đỉnh ngọn bao lá mầm là nơi tiếp nhận kích thích của ánh sáng. Năm 1919 Paal đã cắt đỉnh bao lá mầm và đặt trở lại trên chỗ cắt nhưng lệch sang một bên và để trong tối. Hiện tượng uốn cong xảy ra như chiếu sáng một chiều. Ông kết luận rằng đỉnh ngọn đã hình thành một chất sinh trưởng nào đấycòn ánh sáng xác định sự phân bố của chất đó về hai phía của bao lá mầm. Năm 1928 Went đã đặt đỉnh ngọn tách rời của bao lá mầm đó lên các bản agar để cho các chất sinh trưởng nào đấy khuếch tán xuống agar. Sau đó ông đặt các bản agar đó lên mặt cắt của bao lá mầm thì cũng gây nên hiện tượng sinh trưởng uốn cong như thí nghiệm của Paal với đỉnh sinh trưởng cắt rời. Rõ ràng một chất sinh trưởng nào đấy được tổng hợp trong đỉnh bao lá mầm đã khuếch tán xuống agar và gây nên sự sinh trưởng hướng động đó. Went gọi chất đó là chất sinh trưởng và hiện nay chính là auxin. Năm 1934 giáo sư hóa học Kogl (Hà Lan) và các cộng sự đã tách ra một chất từ dịch chiết nấm men có hoạt tính tương tự chất sinh trưởng và năm 1935 Thimann cũng tách được chất này từ nấm Rhysopus. Nhười ta xác định bản chất hóa học của nó, đó là β – acid – indol axetic (IAA). Sau đó người ta lần lượt tách chiết được IAA từ các thực vật bậc cao khác và đã khẳng định rằng IAA là dạng auxin chủ yếu, quan trọng nhất của tất cả các thực vật, kể cả thực vật bậc thấp và thực vật bậc cao [29],[95]. Một số loài của các giống Azospirillum, Pseudomonas và Glucoacetobacter là những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ khả năng tổng hợp auxin của chúng nên cũng được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật ( PGPR), góp phần làm tăng sản lượng cây trồng [63]. 2.1.2.3. Vai trò của Auxin do vi sinh vật sinh ra đối với cây trồng Auxin có tác dụng điều chỉnh rất nhiều quá trình sinh trưởng của tế bào, cơ quan và toàn cây. 10 Với nhiều thí nghiệm khác nhau của nhiều nhà khoa học đã chứng minh được vai trò của IAA do vi sinh vật tạo ra đối với cây trồng như kích thích sự kéo dài rễ, tăng số lượng rễ phụ, làm tăng khả năng nẩy mầm của hạt.. Bảng 2.1.Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất Vi sinh vâ ̣t Sản phẩm Tác giả Agrobacterium tumefasciens IAA Muller và ctv(1989) Bacillus cereus IAA Wilkinson và ctv(1994) Bacillus subtilis IAA Muller và ctv(1989) Pseudomonas spp. IAA Martens và Franerberger(1991) Rhizobium meliloti IAM, IAA, IpyA Garcia-Rodriguez(1981) Azotobacter sp. IAA Malmoud và ctv(1984) Azotobacter croococcum IAA Muller và ctv( 1989) Azospirillum brasilene IAA Harman và ctv(1983) Enterobacter cloacae IAA Koga(1995) (Nguồn: Phytohormone in soils (1995), W.T.Frankenberger và Muhannad Arshad) Sử dụng các vi khuẩn Azotobacter, Azospirillum, Acetobacter, Bacillus và Pseudomonas để giúp cây lúa nước phát triển tốt và gia tăng năng suất so với đối chứng và sự tổng hợp IAA của những vi khuẩn này giúp rễ lúa phát triển nhiều hơn để hấp thu nhiều nước và chất dinh dưỡng hơn [68]. Bên cạnh đó, Abbas (2007) [37] đã chứng minh rằng khi ủ rễ lúa mì trong dịch vi khuẩn Azospirillum sp. Trong 14 ngày thì rễ lúa của các cây này dài hơn, có nhiều rễ phụ hơn so với chỉ ủ trong nước cất, và trọng lượng khô của các cây lúa mì ủ với dịch vi khuẩn Azospirillum sp. là 10,63 mg trong khi các hạt chỉ xử lý với nước cất chỉ là 3,47mg. KoIb và Martin (1985) đã phun IAA có nồng độ 10-9 g/l vào rễ của cây lúa mì kết quả là rễ cây dài hơn. Một thí nghiệm khác của họ khi phun dịch vi khuẩn Azospirillum brasilense FT-326 trên rễ của củ cải đường (Beta vulgaris) làm cho rễ mọc dài hơn và phát triển cả luôn các rễ thứ cấp. 11 Có nhiều công ty phân bón sử dụng vi khuẩn rễ kích thích tăng trưởng thực vật để xử lý cây trồng phát triển tốt. Ở Việt Nam, công ty hóa hữu cơ đã đưa một vài dòng vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật từ nước ngoài vào Việt Nam để sản xuất phân bón hữu cơ [35] và trong hội chợ Khoa Học Công Nghệ năm 2003 (Tech-mart 2003) tổ chức vào tháng 10/2003 tại Hà Nội. 2.1.3. Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy đi khỏi đất khoảng 30 kg nitơ [9]. Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ [9]. Trong khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù đắp được một phần lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất, những tổn thất về nitơ được bù đắp bởi một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ do vi sinh vật thực hiện, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn đạm trong đất, có thể xếp chúng thành ba nhóm lớn: + Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật. + Nhóm vi khuẩn sống tự do. + Nhóm vi khuẩn lam 2.1.3.1 Nhóm Vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật  Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ đậu Nhà khoa học Hà Lan M.W. Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu và ông đặt tên là Bacillus radicicola, vi khuẩn này được xếp vào chi riêng Rhizodium. Trên môi trường đặc, vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, vô màu. Khi còn non tế bào của chúng có dạng hình que hoặc cầu 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3,0µm, có khả năng di động nhờ tiêu mao; khi già tế bào trở nên bất động kích thước lớn phân nhánh gọi là thể giả khuẩn [9], [24]. Đây là các loài hiếu khí, tuy nhiên vi khuẩn nốt sần vẫn có thể sử dụng được ngay cả ở trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0.01atm. đa số 12 chúng thích hợp ở pH = 6,5 – 7,5, bị cản trở khi pH= 4,5 – 5,0 hoặc lớn hơn 8.0 nhiệt độ thích hợp 24 – 26o C, ở 37o C sự phát triển của chúng bị cản trở [22];[25]. Vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi thông qua vết thương ở vỏ rễ. Người ta nhận thấy muốn xâm nhiễm tốt thì vi khuẩn nốt sần cần đạt tới 104 tế bào/gam đất. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polylacturonase phân hủy thành lông hút, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ. Hàng năm, vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây bộ đậu có thể làm giàu cho đất khoảng 50 – 600 kg nitơ/ha [9].  Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh trong một số cây không thuộc bộ đậu Ngoài những loại cây thuộc bộ đậu thì những loài cây không thuộc bộ đậu cũng có khả năng tạo nốt sần như: một số thực vật thuộc ngành hạt trần: Bowenia, Cycas...một số thực vật hai lá mầm: Coffee, Coriaria,... Ngoài ra một số thực vật còn có khả năng tạo nốt sần trên lá. Qua nghiên cứu cho thấy, ngoài vi khuẩn nốt sần một số loài xạ khuẩn thuộc chi Frankia (cộng sinh trong rễ loài Casuarina) nhiều loài nấm rễ (khuẩn căn hay mycorhiza ) cũng có khả năng cố định nitơ phân tử, tạo nốt sần. Có nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ tác dụng của nấm rễ mà đất thông Pinus radiala ở Mỹ hàng năm làm giàu thêm khoảng 50 kg nitơ/ha [9]. Ngày nay, các nhà khoa học có thể phân lập, nuôi cấy vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium để sản xuất chế phẩm Nitragin để xử lý hạt giống đậu trước khi gieo. Vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp sau đó hấp phụ vào chất mang là đất, than bùn để bảo quản và sử dụng. 2.1.3.2. Nhóm Vi khuẩn cố định nitơ tự do  Vi khuẩn cố định nitơ tự do kỵ khí Clostridium Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Tế bào Clostridium hình que có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc kẹp đôi thành chuỗi ngắn. Khi còn non có khả năng di động, khi già mất khả năng di động, bào tử nằm ở trung tâm, khuẩn lạc nhẵn và trắng có khả năng chịu được nhiệt độ cao và khô hạn [21].