Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp để xử lý sulfide trong các nguồn nước ô nhiễm

viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc ĐỖ THỊ LIÊN NGHI£N CøU øNG DôNG VI KHUÈN TÝA QUANG HîP §Ó Xö Lý SULFIDE TRONG C¸C NGUåN N¦íC ¤ NHIÔM luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ néi - 2016 viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc ĐỖ THỊ LIÊN NGHI£N CøU øNG DôNG VI KHUÈN TÝA QUANG HîP §Ó Xö Lý SULFIDE TRONG C¸C NGUåN N¦íC ¤ NHIÔM Chuyªn ngµnh : Vi sinh vËt häc M· sè : 62 42 01 07 luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học 2. TS. Đỗ Thị Tố Uyên Viện Công nghệ sinh học Hµ néi - 2016 i Lời cảm ơn Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Đinh Duy Kháng, phòng vi sinh vật học phân tử và TS. Đỗ Thị Tố Uyên, phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là những người thầy đã dành cho tôi những ý tưởng quý báu cũng như sự hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Trương Nam Hải, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận án này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Đặng Cẩm Hà, PGS.TSKH Trần Văn Nhị đã giúp đỡ tôi giai đoạn đầu của khóa học NCS. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đồng Văn Quyền đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu tại phòng vi sinh vật học phân tử. Tôi cũng chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Hoa và tập thể cán bộ nghiên cứu phòng thí nghiệm vi sinh vật học phân tử đã giúp tôi có được những hiểu biết và kỹ thuật về sinh học phân tử. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Diệu Phương và tập thể nghiên cứu tại Trung tâm nghiên cứu đa dạng sinh học và nguồn lợi thủy sản, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh đã giúp đỡ tôi thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn tía quang hợp xử lý đáy ao nuôi cá rô phi thâm canh. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện trong suốt những năm qua. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn chị Bùi Thị Hải Hà đã giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong suốt quá trình nghiên cứu sinh và bảo vệ luận án. Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường nơi tôi đang công tác, và sự giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp những ý kiến quý báu của các anh, chị, em đồng nghiệp, nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Nghiên cứu sinh Đỗ Thị Liên ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Đỗ Thị Liên iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Một số đặc điểm sinh học cơ bản của vi khuẩn tía quang hợp 4 1.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp 4 1.1.2. Sinh thái học của vi khuẩn tía quang hợp 4 1.1.3. Hình thái và phân loại học của vi khuẩn tía quang hợp 6 1.1.4. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn tía quang hợp 8 1.2. Sulfide quinone reductase - enzyme chìa khóa của quá trình oxy hóa sulfide ở vi khuẩn tía quang hợp 24 1.2.1. Vai trò của sulfide quinone reductase trong quá trình oxy hóa sulfide 24 1.2.2. Tách dòng gen sqr từ R.capsulatus 28 1.3. Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp trên thế giới 28 1.3.1. Ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp để xử lý sulfide trong nước thải 28 1.3.2. Ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp sản xuất chế phẩm xử lý sulfide trong các đáy ao nuôi trồng thủy sản 35 1.3.3. Ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp xử lý nước thải 36 1.3.4. Một số ứng dụng khác của vi khuẩn tía quang hợp 37 1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp ở Việt Nam 39 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc 42 2.1.1. Vật liệu 42 2.1.2. Các thiết bị máy móc 43 2.1.3. Hóa chất 44 2.1.4. Thành phần môi trường nuôi cấy 44 2.1.5. Các dung dịch đã sử dụng 45 2.2. Phương pháp nghiên cứu 45 2.2.1. Phân lập vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh 45 iv 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh 2.2.3. Đánh giá sinh trưởng và nghiên cứu hình thái các vi khuẩn tía 46 quang hợp 46 2.2.4. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn tía quang hợp 47 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu hệ sắc tố của vi khuẩn tía quang hợp 47 2.2.6. Phương pháp nhuộm Gram 48 2.2.7. Tách chiết DNA genom của vi khuẩn tía quang hợp 48 2.2.8. Phương pháp PCR 48 2.2.9. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 49 2.2.10 Phản ứng nối ghép gen 49 2.2.11. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt 50 2.2.12. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 50 2.2.13. Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn 51 2.2.14. Tinh sạch phân đoạn DNA 51 2.2.11. Xác định trình tự axit nucleic 51 2.2.16 51 Phương pháp xác định các chỉ tiêu thủy hóa 2.2.17. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, muối, ánh sáng 52 2.2.18. Phương pháp cố định tế bào vi khuẩn vào chất mang 52 2.2.19. Đánh giá khả năng xử lý sulfide của chế phẩm dạng dịch trong các nguồn nước thải ô nhiễm ở qui mô phòng thí nghiệm 53 2.2.20. Thử nghiệm chế phẩm đối với nước nuôi cá rô phi ở quy mô pilot 53 2.2.21. Phương pháp khảo nghiệm trên ao 54 2.2.22. Phương pháp thử tính đối kháng của vi khuẩn tía quang hợp 55 2.2.23. Phương pháp xử lý thống kê sinh học 55 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng loại bỏ sulfide 56 3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn tía quang hợp 56 3.1.2. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn tía quang hợp có khả năng sinh trưởng và hoạt tính loại bỏ sulfide cao 58 v 3.2. Những đặc điểm sinh học cơ bản của các chủng vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh được lựa chọn 60 3.2.1. Đặc điểm hình thái 60 3.2.2. Đặc điểm sắc tố quang hợp 62 3.2.3. Khả năng sử dụng các nguồn carbon 65 3.2.4. Khả năng sử dụng sulfide của các chủng đã lựa chọn 66 3.2.5. Xác định trình tự gen 16S - rDNA của các chủng lựa chọn 68 3.2.6. Xác định trình tự gen pufM của các chủng nghiên cứu 70 3.2.7. Tách dòng gen sqr mã hóa sulfide quinone reductase của ba chủng lựa chọn 3.3. 73 Nghiên cứu một số yếu tố môi trưởng ảnh hưởng đến sinh trưởng và khả năng loại bỏ sulfide của các chủng lựa chọn nhằm ứng dụng trong xử lý sulfide 77 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 78 3.3.2. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và hoạt tính khử sulfide 79 3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sinh trưởng và hoạt tính loại bỏ sulfide 81 3.3.4. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng 82 3.4 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh 83 3.4.1. Khả năng sử dụng một số nguồn cơ chất đơn giản 83 3.4.2. Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh 85 3.4.3. Quy trình sản xuất giống vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh 86 3.4.4. Nghiên cứu lựa chọn chất mang để cố định vi khuẩn 88 3.5. Thử nghiệm chế phẩm dịch vi khuẩn tía quang hợp xử lý sulfide ở quy mô phòng thí nghiệm, pilot và điều kiện tự nhiên 3.5.1. 3.5.2. 90 Khả năng xử lý sulfide của chế phẩm dạng dịch trong các nguồn nước thải ô nhiễm ở quy mô phòng thí nghiệm 90 Thử nghiệm chế phẩm dịch đối với nước nuôi cá rô phi ở quy mô pilot 92 vi 3.5.3. Thử nghiệm chế phẩm xử lý sulfide và hữu cơ trong đáy ao nuôi thực tế 3.5.4. 94 Đánh giá vai trò của vi khuẩn tía quang hợp trong chế phẩm thông qua gen pufM và gen sqr 97 Chương 4: BÀN LUẬN 99 4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn 99 4.2. Đặc điểm sinh học của một số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh 4.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sinh trưởng và hoạt tính loại bỏ sulfide của ba chủng lựa chọn 4.4. 100 104 Khả năng xử lý sulfide trong một số nguồn nước thải và trong đáy ao nuôi cá rô phi thâm cảnh 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 114 SUMMARY 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 120 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Blast : Basic local alignment search tool Bchl : Bacteriochlorophyll BOD : Biochemical Oxygen Demand Bp : Base pair (Cặp bazơ) cs : Cộng sự DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : 2 Deoxyribonucleotide 5 triphosphate DSMZ : Doutch samlung microorganisms zentrum ED : Entner - Doudoroff EMP : Embden - Meyerhof FCC : Flavocytochrome c GOGAT : Glutamine -2- oxoglutarate aminotransferase hay glutamate synthase GS : Glutamine synthetase kb : Kilo base kDa : Kilo Dalton M : Marker OD : Optical Density (Mật độ quang) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) SQR : Sulfide quinone reductase sqr : Gen mã hóa cho enzyme sulfide quinone reductase Tag : Thermus aquaticus TCA : Tri carboxylic acid VKTQH : Vi khuẩn tía quang hợp viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. So sánh cực đại hấp thụ của các dạng bacteriochlorophyll ở vi khuẩn quang hợp (trong tế bào nguyên và trong dịch chiết ete) Bảng 1.2. 9 Các gốc R1...R7 và cực đại hấp thụ chính của các loại chlorophyll và bacteriochlorophyll 10 Bảng 1.3. Các nhóm carotenoid có mặt trong tế bào vi khuẩn quang hợp 10 Bảng 1.4. Khả năng oxy hóa các hợp chất khử lưu huỳnh của VKTQH 23 Bảng 1.5. Các nghiên cứu ứng dụng nhóm vi khuẩn quang hợp trong hệ thống xử lý nước thải chứa sulfide 34 Bảng 2.1. Các cặp mồi đã sử dụng 43 Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn VKTQH không lưu huỳnh 56 Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng (theo ∆OD800) và hàm lượng sulfide còn lại trong bình nuôi các chủng VKTQH Bảng 3.3. So sánh khả năng sử dụng một số nguồn C của các chủng lựa chọn với một số loài thuộc chi Rhodobacter Bảng 3.4. 80 Ảnh hưởng của NaCl đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính khử sulfide của các chủng chọn lựa Bảng 3.9. 79 Hàm lượng sulfide còn lại trong môi trường sau 5 ngày nuôi cấy của ba chủng VKTQH ở các pH khác nhau Bảng 3.8. 72 Hàm lượng sulfide còn lại trong môi trường sau 5 ngày nuôi cấy VKTQH ở các nhiệt độ khác nhau Bảng 3.7. 66 Kết quả so sánh trình tự gen pufM của ba chủng VKTQH với dữ liệu trên GenBank Bảng 3.6. 65 Ảnh hưởng của sulfide đến mức độ tích lũy sinh khối (∆ ∆OD800) và hoạt tính loại bỏ sulfide của các chủng chọn lựa Bảng 3.5. 59 81 Hàm lượng sulfide còn lại trong môi trường sau 5 ngày nuôi cấy của ba chủng lựa chọn ở các cường độ sáng khác nhau 83 Bảng 3.10. Mức độ tích lũy sinh khối (∆OD800) và hàm lượng sulfide còn lại các chủng lựa chọn trên các môi trường khác nhau 84 ix Bảng 3.11. Biến động mật độ tế bào VKTQH trong các loại chất mang theo thời gian bảo quản 89 Bảng 3.12. Khả năng phục hồi sinh trưởng và hoạt tính xử lý sulfide của VKTQH trong các dạng chế phẩm theo thời gian bảo quản Bảng 3.13. Mức độ ô nhiễm hữu cơ và sulfide trong các nguồn thải 89 90 Bảng 3.14. Mức độ tích lũy sinh khối (∆OD800) hàm lượng sulfide còn lại trong môi trường nuôi sau 7 ngày 91 Bảng 3.15. Hàm lượng amoni, nitrite trong nước và hàm lượng sulfide trong bùn đáy ao trong các bể nuôi cá rô phi sau 4 tháng thí nghiệm 92 Bảng 3.16. Trọng lượng và kích thước trung bình của cá rô phi ở các bể nuôi sau 4 tháng 93 Bảng 3.17. Biến động hàm lượng BOD3 trong nước ao theo thời gian nuôi 94 Bảng 3.18. Biến động hàm lượng H2S trong nước ao theo thời gian nuôi 95 Bảng 3.19. Biến động hàm lượng H2S trong bùn đáy ao theo thời gian nuôi 96 Bảng 3.20. Tăng trưởng trung bình của cá rô phi 97 x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Các loại operon pufM khác nhau của VKTQH 8 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của vòng porphyrin 9 Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của một dạng Chromotophor của vi khuẩn tía quang hợp Hình 1.4. Sơ đồ định vị của các thành phần bộ máy quang hợp sơ cấp ở VKTQH Hình 1.5. 13 Các con đường trao đổi chất trung tâm ở VKTQH không lưu huỳnh Hình 1.7. 11 Mạch truyền điện tử quang hợp ở VKTQH, VKQH xanh lục và ở vi khuẩn lam hay thực vật bậc cao Hình 1.6. 11 18 Cơ chế điều hòa trao đổi chất ở Rhodobacter capsulatus trong điều kiện quang dưỡng 19 Hình 1.8. Chu trình nguyên tố lưu huỳnh trong tự nhiên 22 Hình 1.9. Thang oxy hóa khử của vận chuyển điện tử quang dưỡng và hóa dưỡng từ sulfide ở nhóm vi khuẩn Proteobacteria Hình 1.10. 25 Vị trí của sự vận chuyển điện tử từ sulfide trong màng sinh chất của vi khuẩn Proteobacteria 26 Hình 1.11. Sự đa dạng của enzyme SQR trong các nhóm vi khuẩn 27 Hình 1.12. Sự xuất hiện của vi khuẩn tía quang hợp ở mương chứa nước thải trang trại chăn nuôi Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc (A), hình dạng tế bào dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 8000 lần (B) của chủng TH21 Hình 3.2. Hình 3.4. 61 Hình dạng khuẩn lạc (A), hình dạng tế bào dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 8000 lần (B) của chủng QN52 Hình 3.3. 32 61 Hình dạng khuẩn lạc (A), hình dạng tế bào dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 4000 lần (B) của chủng QN71 62 Phổ hấp phụ dịch huyền phù tế bào của các chủng lựa chọn 63 xi Hình 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng và oxy đến khả năng tổng hợp sắc tố của các chủng chọn lựa Hình 3.6. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S-rDNA bằng điện di trên gel agarose 1% Hình 3.7. 78 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến mức độ tích lũy sinh khối của các chủng VKTQH sau 5 ngày nuôi cấy Hình 3.14. 76 Khả năng tích lũy sinh khối của các chủng VKTQH khi được nuôi cấy ở các khoảng nhiệt độ khác nhau Hình 3.13. 75 Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzyme hạn chế XbaI và XhoI Hình 3.12. 74 Điện di trên gel agarose 1% để chọn lọc các plasmid tái tổ hợp mang gen sqr Hình 3.11. 71 Điện di đồ sản phẩm nested PCR gen sqr của ba chủng vi khuẩn TH21, QN52 và QN71 Hình 3.10. 69 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pufM của ba chủng vi khuẩn TH21, QN52 và QN71 Hình 3.9. 68 Cây phát sinh chủng loại của các chủng VKTQH chọn lựa dựa trên trình tự nucleotide gene 16S-rDNA Hình 3.8. 64 80 Mức độ tích lũy sinh khối của chủng TH21, QN52 và QN71 ở các cường độ chiếu sáng khác nhau 82 Hình 3.15. Tính đối kháng của ba chủng VKTQH 85 Hình 3.16. Mức độ tích lũy sinh khối của hỗn hợp chủng giống vi khuẩn quang hợp trong các mô hình nuôi ở điều kiện tự nhiên 86 Hình 3.17. Qui trình nhân giống cấp 1 vi khuẩn tía quang hợp 87 Hình 3.18. Một số mô hình sản xuất sinh khối ngoài tự nhiên 88 Hình 3.19. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại từ mẫu bùn ao nuôi cá rô phi 98 1 MỞ ĐẦU Sự bùng nổ dân số cùng với tốc độ đô thị hóa, công nghiệp hóa nhanh chóng đã làm cho chất lượng môi trường ngày càng bị suy giảm và môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng. Điều đó ảnh hưởng trước mắt và lâu dài đến sức khỏe con người, phá vỡ sự cân bằng sinh thái. Bảo vệ môi trường sống là mối quan tâm chung của toàn nhân loại (Idi et al., 2015). Trong đó, vấn đề ô nhiễm nguồn nước là một thực trạng đáng ngại nhất của sự hủy hoại môi trường. Nguyên nhân của tình trạng ô nhiễm này là do sự xả thải của các nguồn nước sinh hoạt, từ các nhà máy của các khu công nghiệp, nước thải chăn nuôi hay từ hoạt động nuôi trồng và chế biến thủy sản… mà không được xử lý và xả thẳng ra môi trường. Hầu hết các sông hồ ở các thành phố lớn như Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh, nơi có dân cư đông đúc và nhiều khu công nghiệp lớn này đều bị ô nhiễm. Ở khu vực Hà Nội có khoảng 600.000 m3 nước thải sinh hoạt mỗi ngày, khoảng 260.000 m3 nước thải từ các khu công nghiệp và 250 tấn rác được thải trực tiếp ra các ao, hồ, sông ngòi tại Hà Nội. Tại Thành phố Hồ Chí Minh, lượng nước thải sinh hoạt, nước thải công nghiệp xả thải mỗi ngày khoảng 1 triệu m3, trong đó hơn 90% lượng nước thải chưa qua xử lý (Nguyễn Khắc Hải, 2006). Các nguồn nước thải này có chứa nhiều các chất độc hại như các chất hữu cơ dễ và khó phân hủy, kim loại nặng, các vi sinh vật gây bệnh v.v... Nước thải thường có nồng độ oxy hòa tan thấp, tạo điều kiện cho các vi sinh vật yếm khí và kỵ khí phát triển mạnh phân hủy các hợp chất hữu cơ tạo thành lớp bùn đen chứa các sulfide kim loại và các khí độc như H2S, CH4 - là sản phẩm tạo ra từ quá trình khử sulfate và sinh metan (Nguyễn Văn Hảo et al., 2004). Sự có mặt của H2S trong các kênh mương chứa nước thải quanh khu dân cư tạo nên mùi khó chịu, gây nên hiện tượng chóng mặt, nhức đầu, có thể gây ngộ độc ở 10 mg/l, thậm chí có thể chết nếu thở lâu trong môi trường chứa khí H2S và hậu quả là ảnh hưởng rất nặng nề đến chất lượng sống của cộng đồng (Hurse et al., 2008). Bên cạnh vấn đề ô nhiễm nước thải sinh hoạt và nước thải công nghiệp thì vấn đề ô nhiễm do các hoạt động trong nuôi trồng thủy sản cũng đáng lo ngại. 2 Nguyên nhân gây ô nhiễm do các hoạt động của quá trình nuôi như: chất thải từ vật nuôi, thức ăn dư thừa, các hóa chất tích tụ ở đáy tạo thành lớp bùn ô nhiễm phân hủy thành các chất như sulfide, ammonia, khí metan…, trong đó sulfide là chất gây hại cho vật nuôi làm giảm năng suất hoặc mất mùa (Nguyễn Văn Hảo et al., 2004). Đã có nhiều công trình nghiên cứu và nhiều hệ thống xử lý đã được lắp đặt có hiệu quả để xử lý các nguồn nước thải giàu chất hữu cơ, nước thải công nghiệp chứa kim loại nặng v.v... Tuy nhiên, vấn đề xử lý sulfide còn ít được quan tâm, đặc biệt là xử lý bằng các biện pháp sinh học. Có hai nhóm vi khuẩn tự nhiên có khả năng tham gia xử lý sulfide là vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí. Vi khuẩn hiếu khí chỉ phát triển được trong môi trường có hàm lượng oxy hòa tan cao. Tuy nhiên, các hợp chất hữu cơ, các hợp chất chứa lưu huỳnh trong nguồn nước thải thường lắng đọng và tích tụ trong các lớp đáy bùn, nơi có hàm lượng oxy thấp. Do đó, để khử các hợp chất của lưu huỳnh trong điều kiện kỵ khí và yếm khí thì vai trò chủ yếu là nhờ nhóm vi khuẩn kỵ khí (Husre et al., 2008). Gần đây, nhiều nước trên thế giới như Nhật Bản, Ấn Độ, Mỹ v.v… đã chú trọng tới nhóm vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) vì chúng có khả năng loại bỏ các hợp chất hữu cơ và các hợp chất lưu huỳnh cao. Sinh khối VKTQH còn được sử dụng vào rất nhiều mục đích khác như: tách chiết các hoạt chất có giá trị, sử dụng làm thức ăn tươi sống phục vụ sản xuất giống hải sản… Ở Việt Nam, trong những năm gần đây VKTQH đã được tìm kiếm, phân lập và nghiên cứu nhằm ứng dụng trong công nghệ xử lý ô nhiễm môi trường, thu nhận các hoạt chất sinh học có giá trị, làm thức ăn tươi sống trong nuôi trồng thủy sản v.v… Để tiếp tục ứng dụng nhóm vi khuẩn này trong lĩnh vực xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường, chúng tôi đề xuất đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp để xử lý sulfide trong các nguồn nước ô nhiễm". Mục tiêu của đề tài - Có được chủng giống VKTQH phân lập ở Việt Nam có khả năng xử lý sulfide. - Có được chế phẩm xử lý môi trường ô nhiễm sulfide và các hợp chất hữu cơ từ các chủng chọn lựa, xác định được sự tồn tại và vai trò của chúng khi đưa vào môi trường tự nhiên. 3 Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn quang hợp tía có khả năng loại bỏ sulfide cao từ các nguồn nước ô nhiễm. 2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của một số chủng đã lựa chọn. 3. Phân loại một số chủng trên cơ sở các đặc điểm hình thái và sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích trình tự gene 16S- rDNA và gen pufM. 4. Tách dòng và xác định trình tự gen sqr mã hóa cho enzyme sulfide quinone reductase (enzyme chìa khóa của quá trình oxy hóa sulfide). 5. Nghiên cứu các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và khả năng loại bỏ sulfide của các chủng lựa chọn nhằm ứng dụng trong xử lý sulfide (nhiệt độ, pH, ánh sáng, nồng độ sulfide, nồng độ muối). 6. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sinh khối tạo chế phẩm ứng dụng. 7. Ứng dụng chế phẩm VKTQH để xử lý sulfide. - Trong điều kiện phòng thí nghiệm: Đánh giá khả năng xử lý sulfide trong các nguồn nước thải. - Đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm ở điều kiện pilot và ao nuôi tự nhiên: khả năng tồn tại và phát triển, đặc biệt là hoạt động chuyển hóa của VKTQH bằng các kỹ thuật truyền thống và sinh học phân tử thông qua sự có mặt của gene pufM và gene sqr và khả năng loại bỏ sulfide trong nước và bùn đáy. Những đóng góp mới của luận án 1. Đã phân lập được các VKTQH tại Việt Nam và bước đầu xử lý sulfide ở điều kiện tự nhiên trong các ao nuôi cá rô phi. 2. Lần đầu tiên sử dụng các gen pufM (mã hóa cho tiểu phần M của protein liên kết với sắc tố nằm trong tâm phản ứng quang hợp) và gen sqr (mã hóa sulfide quinone reductase) ở các chủng vi khuẩn Rhodobacter sphaeroides, Rhodovullum sulphidophilum phân lập tại Việt Nam để đánh giá sự tồn tại và vai trò xử lý sulfide của các chủng vi khuẩn tía quang hợp. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CƠ BẢN CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP 1.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp Vi khuẩn tía quang hợp thuộc nhóm vi khuẩn thủy sinh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí bằng cách quang hợp nhưng không thải oxy như những đối tượng quang dưỡng khác. Khi được chiếu sáng, rất nhiều loài trong nhóm này có khả năng sinh trưởng quang tự dưỡng với CO2 làm nguồn carbon hoặc sinh trưởng quang dị dưỡng với các chất hữu cơ làm nguồn carbon. Nhóm vi khuẩn này có các kiểu trao đổi chất rất linh hoạt tùy thuộc vào điều kiện môi trường sống nên chúng phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Nhờ có khả năng đặc biệt về trao đổi carbon, khả năng cố định nitơ phân tử, khả năng sử dụng các hợp chất khử của lưu huỳnh làm chất cho điện tử trong quang hợp mà chúng là những đối tượng được quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Chúng không những có giá trị trong nghiên cứu cơ bản như nghiên cứu cơ chế quang hợp, cơ chế cố định nitơ phân tử, cơ chế oxy hóa các hợp chất của lưu huỳnh… mà chúng còn có giá trị ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt ứng dụng trong xử lý môi trường (Imhoff, 1989, 1995; Madigan et al., 2000; Kantachote et al., 2005; Madukasi et al., 2009, 2011). Nhóm VKTQH thường có màu hồng đến đỏ tía, sắc tố quang hợp chính là bacteriochlorophyll (Bchl) và nguồn cho điện tử trong quá trình quang hợp không phải là nước (như những đối tượng quang dưỡng khác) mà là các hợp chất khác nhau như: hydro, các axit hữu cơ đơn giản, lưu huỳnh, hydro sulfide, thiosulfide và các hợp chất khử của lưu huỳnh (Brune, 1989; 1995). Theo khóa phân loại của Bergey (1989), chúng được chia thành 2 nhóm: vi khuẩn tía quang hợp lưu huỳnh - có khả năng tích lũy giọt lưu huỳnh bên trong tế bào và vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh - không có khả năng tích lũy giọt lưu huỳnh bên trong tế bào (Imhoff and Truper, 1989; 2001). 1.1.2. Sinh thái học của vi khuẩn tía quang hợp Vi khuẩn tía quang hợp phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng có mặt trong các ao hồ tù đọng, các vùng đầm nước lợ hoặc mặn như các đáy ao nuôi trồng thủy 5 sản, trong đất, trong các kênh mương chứa nước thải, trong hệ thống xử lý nước thải… (Imhoff and Truper, 1992; Kobayashi and Kobayashi, 1995; Okubo et al., 2006; Hoogewert et al., 2003; Zhu et al., 2002). Trong các đáy ao nuôi trồng thủy sản ven biển thường có hàm lượng sulfate đáng kể, nhóm vi khuẩn khử sulfate hoạt động sẽ tạo thành sulfide ở tầng đáy, sulfide khuếch tán từ tầng đáy lên trên theo cột nước bởi sự chênh lệch gradient nồng độ. Khi có mặt sulfide với hàm lượng nhất định, nhóm VKTQH có thể sinh trưởng ở vùng có ánh sáng xuyên qua (Pfennig, 1978a). Ở các độ sâu khác nhau có thể thu nhận được các loài khác nhau. Nếu sinh khối VKTQH phát triển mạnh, sẽ xuất hiện sự nở hoa của ao, hồ làm cho ao hồ có màu đỏ, tía hoặc có màu đỏ nâu. Khi sự nở hoa trong hồ xảy ra, người ta có thể phân biệt được hình thái tế bào đặc trưng của các chi của VKTQH dưới kính hiển vi. Trong các ao hồ có sự "nở hoa", có thể bắt gặp hỗn hợp các loài hoặc có thể chỉ xuất hiện một loài VKTQH (Pfennig 1978, 1989; Overmann et al., 1994, 1996, 1999). Các hồ xử lý nước thải là nơi có điều kiện phù hợp cho sự phát triển của nhóm VKTQH không lưu huỳnh sinh trưởng. Tại bang Minnesota (Mỹ), trong hồ xử lý nước thải chế biến rau quả đã quan sát thấy sự nở hoa của nhóm VKTQH không lưu huỳnh, khi có sự nở hoa này thì không còn phát hiện được các mùi hôi trong hồ, các loài VKTQH chủ yếu là: Rba. sphaeroides, Rba. capsulatus, Rps. palustris (Cooper et al., 1975). Tác giả Okubo và cộng sự (2006) đã phát hiện ra nhóm VKTQH không lưu huỳnh trong kênh chứa nước thải chăn nuôi tạo nên một tấm thảm có màu đỏ, trong đó xuất hiện các loài như Rba. sphaeroides, Rba. capsulatus, và các loài trong chi Rhodopseudomonas, đặc biệt là Rps. palustris (Okubo et al., 2006). Ngoài ra, còn có thể gặp đại diện của VKTQH trong một số thủy vực có điều kiện khắc nghiệt như: suối nước nóng, suối lưu huỳnh thủy vực kiềm hóa, thủy vực có tính acid, ở vùng biển có độ mặn cao và thậm chí ở hồ có băng bao phủ 4 -7 m ở Antarstica vẫn phát hiện sự có mặt của nhóm vi khuẩn này (Guerero et al., 1987; Madigan, 2003, Kompantseva et al., 2012). 6 1.1.3. Hình thái và phân loại học của vi khuẩn tía quang hợp * Đặc điểm hình thái Sự đa dạng về hình thái tế bào của nhóm VKTQH là đặc điểm quan trọng được sử dụng để phân loại chúng. Vi khuẩn tía quang hợp là các tế bào Gram âm, đơn bào và có các dạng hình cầu, xoắn, gậy, phẩy, cũng có thể gặp chúng ở trạng thái chuỗi trong những điều kiện môi trường đặc biệt. Kích thước của tế bào thường từ 0,3 - 6 µm. Đa số các loài đều sinh sản bằng cách nhân đôi, một số loài có tế bào dinh dưỡng dạng phân cực thường sinh sản bằng cách nảy chồi (là đặc trưng của chi Rhodopseudomonas và Rhodomicrobium). Khi sinh trưởng trong điều kiện quang hợp, dịch huyền phù tế bào thường có màu tím tía, đỏ, nâu vàng, nâu hoặc xanh (Bergey, 1989). * Phân loại của VKTQH Năm 1907, Molisch là người đầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc tố màu đỏ và có khả năng quang hợp nên ông gọi chung nhóm vi khuẩn này là Rhodobacteria. Nhóm vi khuẩn này bao gồm hai họ Thiorhodaceae (là những vi khuẩn tía có khả năng hình thành giọt "S" bên trong tế bào) và Athiorhodaceae (là những vi khuẩn tía không có khả năng hình thành giọt "S" trong tế bào (Imhoff, 2001). Nhóm VKTQH lưu huỳnh là các loài có thể chống chịu được hàm lượng sulfide trong môi trường ở mức độ cao và trong quá trình oxy hóa sulfide, "giọt" lưu huỳnh được tích lũy bên trong tế bào, trong khi đó, nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh thì có thể chống chịu sulfide ở mức độ thấp hơn và không tích lũy giọt lưu huỳnh bên trong tế bào. Đa số các loài trong nhóm này có thể sinh trưởng trên môi trường chứa sulfide và có thể oxy hóa sulfide ở các mức độ khác nhau, sản phẩm cuối cùng có thể là: S0, S4O62- hoặc SO42-. Vì vậy, khi sinh trưởng trên môi trường chứa sulfide thì có thể dễ dàng phân biệt được nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh và nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh nhờ sự quan sát giọt lưu huỳnh tích lũy trong hay ngoài tế bào dưới kính hiển vi điện tử phản pha (Imhoff and Truper, 1989; Michael et al., 2008). Theo khóa phân loại của Bergey (1989) vi khuẩn quang hợp được chia làm ba nhóm: vi khuẩn tía quang hợp, vi khuẩn xanh quang hợp và nhóm vi khuẩn hiếu khí chứa bacteriochlorophyll (nhưng không xếp vào hai nhóm trên). Riêng nhóm VKTQH được chia làm ba họ: 7 - Họ Chromatiaceae: gồm tất cả các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía có khả năng hình thành giọt lưu huỳnh bên trong tế bào. - Họ Ectothiorhodospiraceae: gồm tất cả các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía có khả năng hình thành giọt lưu huỳnh bên ngoài tế bào. - Họ Rhodospirilaceae: gồm tất cả các VKTQH hợp không tích lũy giọt lưu huỳnh. Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại của Bergey (năm 2001) dựa vào thành phần acid béo, quinone, trình tự và kích thước của cytochrome c VKTQH lại được xếp vào ba phân lớp: - Alphaproteobacteria: gồm VKTQH không lưu huỳnh và VKTQH hiếu khí. - Betaproteobacteria: cũng gồm VKTQH không lưu huỳnh. - Gammaproteobacteria: gồm hai họ Chromatiaceae và Ectothiorhodospriraceae. Gần đây, sự phân loại vi khuẩn quang hợp không chỉ dựa vào các phân tích về hình thái tế bào, đặc tính sinh lý sinh hóa mà còn dựa trên các thông tin về di truyền và nguồn gốc phát sinh. Một trong những thông tin di truyền quan trọng được sử dụng trong phân loại các vi khuẩn là thông tin về trình tự gen ADN riboxom 16S. Đây là một gen có tính bảo thủ cao trong quá trình tiến hóa của sinh vật, có kích thước đủ lớn để xác định thông tin di truyền với mức độ tin cậy cao (Luking et al., 1976). Hơn nữa, trình tự nucleotide của toàn bộ gen này ở nhiều vi khuẩn đã được xác định nên việc so sánh về quan hệ di truyền giữa chúng được tiến hành dễ dàng. Do đó, trong khóa phân loại của Bergey năm 1994 và hệ thống phân loại của Bergey năm 2001, mối quan hệ di truyền giữa các vi khuẩn đã được thiết lập dựa vào phân tích trình tự gen 16S rDNA. Nhờ có thông tin về trình tự nucleotide của gen 16S - rDNA hệ thống phân loại của VKTQH cũng đã được sắp xếp ngày một hoàn thiện hơn. Ngày nay, với sự đa dạng của nhóm VKTQH bên cạnh việc phân tích thông tin di truyền gen 16S rDNA, người ta còn phát hiện ra gen pufM có tính bảo thủ cao để phân loại và đánh giá nhanh sự có mặt của nhóm VKTQH. * Gen pufM Gen pufM thuộc operon puf (photosynthetic unit forming) được tìm thấy trong nhóm vi khuẩn quang hợp không thải oxy thuộc phân lớp Alpha-, Beta- và Gammaproteobacteria và họ Cloroflexaceae. Hiện nay, người ta phát hiện ra 5 loại operon puf khác nhau (Hình 1.1).