Tài liệu Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ LẠC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2014 Công trình này được hoàn thành tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. NGUYỄN THÙY CHÂU 2. PGS. TS. NGUYỄN THN XUÂN SÂM Phản biện 1: PGS. TS. LÊ LƯƠNG TỀ Phản biện 2: PGS. TS. NGUYỄN THN HOÀI TRÂM Phản biện 3: GS. TS. NGUYỄN VĂN TUẤT Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …. giờ…. ngày….. tháng…… năm……….. Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 2. Thư Viện Quốc gia NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 1. Lê Thiên Minh, Nguyễn Tiến Nam, Nguyễn Thùy Châu. (2010). Hiệu quả của chế ph m Aspergillus flavus (AF) không sinh aflatoxin để phòng chống afltoxin trên lạc. Tạp chí Nông nghiệp và Phát Triển Nông thôn, (5/2010). pp (81-85). 2. Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu. (2010). Tác dụng của chủng A.flavus DA2 không sinh và phòng chống aflatoxin trên ngô ở giai đoạn ngoài đồng và trong quá trình bảo quản. Tạp Chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, (6/2010). pp (3034) 3. Lê Thiên Minh, Nguyễn Hồng Hà, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Nguyễn Thùy Châu. (2011). Nghiên cứu sản xuất chế ph m Aspergillus flavus không sinh aflatoxin để phòng chống aflatoxin. Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Cơ điện Nông nghiệp và Bảo quản Chế biến Nông sản, Thực phNm. NXB Khoa học và Kỹ thuật. (1/2011). pp.213-219. MỞ ĐẦU Aflatoxin là những chất chuyển hóa có độc tính cao, được sinh tổng hợp chủ yếu bới các loài nấm mốc Aspergillus. Các độc tố này tồn tại trong nông sản thực phNm, không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực phNm mà còn là một trong những nguyên nhân gây nên những căn bệnh nguy hiểm cho người và động vật như viêm gan cấp tính, ung thư gan, suy dinh dưỡng ở trẻ em. Việc kiểm soát hàm lượng aflatoxin có mặt trong nông sản thực phNm đã được nghiên cứu từ rất lâu với nhiều biện pháp khác nhau, mỗi biện pháp đều có những ưu nhược điểm nhất định nhưng chưa có biện pháp nào đạt được hiệu quả như mong đợi. Những năm gần đây, xu hướng sử dụng chính những chủng nấm đối kháng Aspergillus flavus không sinh độc tố có tính cạnh tranh cao làm tác nhân kiểm soát đang được phát triển và tỏ ra khá hiệu quả. Chế phNm nấm Aspergillus flavus đối kháng đã được nghiên cứu, ứng dụng và cấp bằng sáng chế, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp ở một số quốc gia như Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc... Việt Nam nằm trong miền khí hậu nhiệt đới nóng, Nm là điều kiện rất thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm vào cây trồng ngay từ giai đoạn canh tác, trong suốt quá trình bảo quản và chế biến nếu không có biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt. Do đó, việc tạo lập một chế phNm nấm A. flavus đối kháng từ những chủng phân lập được trên các nguồn tự nhiên bản địa chắc chắn sẽ mang lại hiệu quả giảm thiểu sự nhiễm aflatoxin. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đối kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc”, với các mục đích và nội dung nghiên cứu chính sau đây: Mục đích nghiên cứu Kiểm soát sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng chế phNm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin có khả năng cạnh tranh cao và ổn định với các chủng A. flavus sinh aflatoxin. 2. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và tạo chế phNm bào tử từ chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin. 3. Nghiên cứu ứng dụng chế phNm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin 1 nhằm giảm thiểu sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở quy mô phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng. Những đóng góp mới của luận án 1. Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng cơ chế cạnh tranh sinh học bằng chủng A. flavus không sinh aflatoxin trong kiểm soát aflatoxin nhiễm trên ngô và lạc. 2. Luận án nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để làm sáng tỏ bản chất sinh học phân tử của chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin phân lập từ ngô (Việt Nam). Chủng A. flavus DA2 không mang 3 gen (ver, aflR và nor) trong cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin. 3. Luận án đã nghiên cứu tạo được công nghệ nuôi cấy bề mặt cho sản xuất chế phNm bào tử chủng A. flavus DA2 đạt sản lượng cao (109CFU/g) với công nghệ đơn giản, giá thành rẻ. Chế phNm có tác dụng giảm sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên ngô, lạc ở giai đoạn đồng ruộng và trong quá trình bảo quản từ 86,55% đến 97%, đảm bảo tính khả thi cao khi đưa ra ứng dụng ở quy mô lớn. Bố cục luận án Luận án gồm 124 trang, 35 bảng và 26 hình; Mục lục 3 trang; Mở đầu: 2 trang; Chương 1. Tổng quan tài liệu: 27 trang; Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 11 trang; chương 3. Kết quả và thảo luận: 51 trang; Kết luận và kiến nghị: 1 trang; Tài liệu tham khảo: 12 trang ( Bao gồm 11 tài liệu tiếng Việt, 129 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục: 15 trang. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN Aflatoxin là nhóm các hợp chất có nhân difuranocumarin, là sản phNm trao đổi chất chủ yếu của hai loài nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin là các chất có khả năng gây ung thư, gây đột biến gen, là tác nhân làm giảm khả năng miễn dịch. Người có thể bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị nhiễm hoặc ăn thịt các động vật được nuôi bằng ngũ cốc bị nhiễm aflatoxin. Các nghiên cứu ở những vùng có tỷ lệ ung thư cao trên thế giới đều cho thấy nhiễm độc aflatoxin là nguy cơ chính gây ung thư gan. 2 1.2 PHÒNG CHỐNG SỰ NHIỄM AFLATOXIN Trên thực tế, đã có một số biện pháp kiểm soát aflatoxin được ứng dụng như: biện pháp canh tác nông nghiệp, biện pháp sau thu hoạch, phương pháp sinh học, sử dụng vi sinh vật đối kháng… Việc sử dụng các chủng vi sinh vật đối kháng không có hại cho con người và thực phNm mà lại có khả năng giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Các nghiên cứu của Dorner cho thấy, lạc đã bị nhiễm Aspergillus flavus và aflatoxin từ giai đoạn trước thu hoạch. Vì vậy, nhiều Quốc gia như Mỹ, Ấn Độ, Thái Lan, Nigeria đã có chiến lược phòng chống nhằm giảm tổn thất do aflatoxin gây nên trên lạc ở giai đoạn trước và sau thu hoạch. Việc sử dụng chủng A. flavus không sinh độc tố để ức chế các chủng A. flavus sinh độc tố nhiễm trong đất trồng lạc theo cơ chế loại trừ cạnh tranh đã được thực hiện ở các nước này. Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ đã cho phép đưa vào danh mục chủng Aspergillus flavus AF36 như là tác nhân sinh học an toàn để phòng chống aflatoxin trên ngô, lạc và bông. Chế phNm AF36 sản xuất từ chủng A. flavus AF36 được công nhận là thuốc bảo vệ thực vật tích cực để giảm các aflatoxin trên ngô, lạc và bông bằng việc cạnh tranh và thay thế chủng A. flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên trên đất trồng ngô, lạc và bông. Chủng A. flavus AF36 chứa các gen mã hoá cho sự tạo aflatoxin bị đột biến và không thể hiện sự trao đổi vật chất di truyền với các chủng sinh aflatoxin. Sử dụng chủng nấm A.flavus không sinh độc tố phân lập được để kiểm soát aflatoxin là dự án quan trọng của Bộ Nông nghiệp Mỹ. Cách tiếp cận này đã được chấp nhận ở Châu Phi và trở thành một hợp phần của dự án “đánh giá mức độ nhiễm aflatoxin và can thiệp bằng cách sử dụng các biện pháp kiểm soát sinh học” được tài trợ bởi cơ quan phát triển Đức (BMZ). CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU - 55 mẫu ngô, 45 mẫu lạc và 140 mẫu đất được thu thập tại các tỉnh Nghệ An, Đắc Nông, Vĩnh Phúc và Hà Nội - Chuột nhắt trắng giống Swiss do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp - Mẫu ngô sạch của Viện Nghiên cứu ngô đã được kiểm tra không bị nhiễm độc tố aflatoxin. 3 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân lập phân loại A.flavus không sinh độc tố theo Rapper Fennel; Sàng lọc và xác định khả năng cạnh tranh các chủng A.flavus không sinh aflatoxin theo phương pháp của Tanaka và công sự; Xác định sự có mặt của một số gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin theo phương pháp của Criseo và cộng sự; Xác định hàm lượng aflatoxin bằng TLC theo phương pháp của OAOC, phương pháp sắc ký lỏng cao áp theo tiêu chuNn Việt Nam TCVN 6953:2001. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG A.FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN LÀM CHỦNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AF 3.1.1 Phân lập các chủng Aspergillus flavus trên ngô, lạc Từ 100 mẫu ngô, lạc lấy ở một số địa điểm khác nhau, chúng tôi đã phân lập được 85 chủng nấm mốc có hình thái giống loài A. flavus. Trong đó, ở Yên Thành, Nghệ An số chủng nấm mốc phân lập được trên số mẫu là 27/30, chiếm 90%. Ở Cư’Mgar, Đắc Nông số lượng chủng nấm mốc A. flavus phân lập được trên số mẫu là 24/30, chiếm 80% và ở Yên Lạc, Vĩnh Phúc số lượng chủng nấm mốc A. flavus phân lập được trên số mẫu là 21/25, chiếm 84%. Tỷ lệ nhiễm mốc ở 15 mẫu ngô Đông Anh, Hà Nội là 86% và tỷ lệ nấm mốc A. flavus phân lập /tổng số mẫu trung bình là 85%. Kết quả trên cho thấy, các mẫu ngô, lạc ở các tỉnh được khảo sát đã bị nhiễm A. flavus với tần suất cao (80-90%) và không có sự chênh lệch đáng kể giữa các vùng. Như vậy, có thể nói rằng A. flavus là loài nấm mốc nhiễm chính trên ngô và lạc ở Việt Nam. 3.1.2 Sàng lọc các chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin Theo một số tài liệu đã công bố không phải tất cả các chủng A. flavus đều sinh aflatoxin. Do vậy, để sàng lọc các chủng không sinh aflatoxin, từ 85 chủng A. flavus phân lập được ở trên tiến hành nuôi cấy trên môi trường ngô theo phương pháp của Tanaka và cộng sự. Sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu được tách chiết và xác định hàm lượng aflatoxin B1 tạo thành bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng (TLC) Từ 85 chủng A. flavus phân lập đã sàng lọc được 21 chủng A. flavus không sinh aflatoxin sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau. Kết quả phân tích cũng chỉ 4 ra rằng 70,5% số chủng phân lập được có khả năng tạo aflatoxin dao động từ 80-600 ppb. Dựa trên khả năng sinh aflatoxin và mức độ phát triển của các chủng A.flavus phân lập, 05 chủng A. flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 và AL23) không sinh aflatoxin và 01 chủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin đã được chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.3 Khả năng cạnh tranh các chủng A.flavus không sinh aflatoxin Theo kết quả thu được ở trên, 05 chủng A. flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 và AL23) sau khi được phân loại, sàng lọc bằng các khóa phân loại và xác định không sinh aflatoxin được đánh giá khả năng cạnh tranh với chủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin thông qua sự giảm hàm lượng aflatoxin trên môi trường ngô. Chủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin được nuôi hỗn hợp với từng chủng A. flavus không sinh aflatoxin đã tuyển chọn theo tỉ lệ 1:1 (số bào tử của mỗi chủng là 1,5 x 105CFU/g) trên cơ chất ngô sạch không có aflatoxin ở nhiệt độ 28oC, độ Nm 25% trong thời gian 7 ngày. Sau đó chiết xuất và phân tích hàm lượng aflatoxin được tạo thành. Hình 3.1 Sắc ký đồ thể hiện hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A. flavus nuôi cấy trên môi trường ngô Hình 3.1 chỉ ra rằng, khi nuôi riêng chủng A. flavus AF14, sau 7 ngày nuôi cấy hàm lượng aflatoxin B1 là 600 ppb. Kết quả phân tích cũng cho thấy, các chủng A. flavus không sinh aflatoxin khảo sát đều thể hiện khả năng canh tranh làm giảm hàm lượng aflatoxin B1 của chủng AF14 với mức độ khác nhau, dao động từ 42-85%. Hiệu quả giảm khác nhau là do các chủng A. flavus DA2, A. flavus DA1, A. flavus AL21, A. flavus AL22, A. flavus AL23 có khả năng cạnh tranh khác nhau đối với chủng A. flavus A14. Khi nuôi hỗn hợp chủng A. flavus 5 A14 và chủng A. flavus DA2 hàm lượng aflatoxin trong môi trường ngô giảm nhiều nhất, chỉ còn 90 ppb, hiệu quả giảm aflatoxin B1 là 85%. 3.1.4 Sự có mặt một số gen thuộc cụm gen mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin của chủng A.flavus DA2 Chủng A. flavus DA2 được xác định là không sinh aflatoxin dựa trên các phương pháp nuôi cấy, phân tích bằng TLC, sắc ký lỏng cao áp HPLC và có khả năng cạnh tranh cao với chủng A. flavus AF14 sinh độc tố. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu, các chủng A. flavus không sinh aflatoxin có thể do thiếu một số gen mã hóa cho các enzym trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin hoặc vẫn có đầy đủ các gen mã hóa cho quá trình sinh tổng hợp aflatoxin nhưng không sinh độc tố do chúng bị đột biến gen. Để hiểu bản chất không sinh aflatoxin của chủng A. flavus DA2 phân lập được ở mức độ gen, kỹ thuật multiplex PCR đã được sử dụng để xác định sự thiếu hụt của 4 gen trong cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin, đó là: aflR, nor, omt và ver. Kết quả hình 3.2 cho thấy, trong khi chủng sinh độc tố A. flavus AF14 có đầy đủ cả 4 gen cần thiết cho sự tạo aflatoxin thì chủng A. flavus DA2 chỉ có gen omt. Ba gen mục tiêu aflR, ver và nor là các gen quan trọng mã hóa cho quá trình hình thành các sản phNm trung gian trong con đường sinh tổng hợp aflatoxin hoàn toàn không có. Trong đó, gen aflR là gen điều khiển và là nhân tố phiên mã quan trọng cho hầu hết các gen cấu trúc, kiểm soát quá trình sinh tổng hợp aflatoxin. Theo Criseo chủng này không có khả năng tạo aflatoxin vì không có đầy đủ 4 gen aflR, nor, omt và ver là cụm gen đã được chứng minh là các gen chìa khóa cho sự tạo aflatoxin. 1 AflR Omt Ver Nor 2 3 1650 bp 1000 bp 850 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 1034 bp 795 bp 537 bp 399 bp Hình 3.2 Sản ph m multiplex PCR của chủng A. flavus DA2 và AF14 Chú thích: Line 1: A. flavus DA2; Line 2: A. flavus AF14; Line 3: Marker 6 3.1.5 Tính ổn định liên quan đến khả năng không sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 Chủng A.flavus DA2 được nuôi trên môi trường ngô qua 15 thế hệ, sau mỗi 5 thế hệ khả năng sinh aflatoxin đã được phân tích bằng TLC. Bên cạnh đó, sau mỗi 5 thế hệ, chủng A. flavus DA2 được chiết tách ADN và sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để kiểm tra sự có mặt của các gen aflR, ver, omt và nor thuộc cụm gen mã hóa cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin. Sau 15 thế hệ không hề có vết của aflatoxin trên bản sắc ký. Kết quả PCR (hình 3.4) cũng chỉ ra rằng, sau khi cấy chuyền qua 15 thế hệ 3 gen mục tiêu aflR, verb và nor là các gen quan trọng mã hóa cho quá trình hình thành các sản phNm trung gian trong con đường sinh tổng hợp aflatoxin vẫn vắng mặt. Vì vậy, có thể khẳng định rằng chủng A. flavus DA2 ổn định về mặt di truyền. Hình 3.3 Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 và 15 thế hệ Chú thích: Chu n B1: Aflatoxin B1 chuNn; Mẫu 1: A.flavus DA2 thế hệ thứ 5; Mẫu 2: A.flavus DA2 thế hệ thứ 10; Mẫu 3: A.flavus DA2 thế hệ thứ 15. 1 2 3 1650 bp 1000 bp 850 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 4 5 795 bp Hình 3.4 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A. flavus DA2 sau 5, 10 và 15 thế hệ 7 Chú thích: Line 1: Marker; Line 2: chủng A. flavus DA2 gốc; Line 3: Chủng A. flavus DA2 sau cấy chuyền 5 thế hệ; Line 4: Chủng A. flavus DA2 sau cấy chuyền 10 thế hệ; Line 5: Chủng A. flavus DA2 sau cấy chuyền 15 thế hệ. 3.1.6 Tính an toàn của chủng A.flavus DA2 thử nghiệm trên động vật Chủng A.flavus DA2 được thử độc tính trên chuột Swiss trắng có kết quả như sau: cho chuột uống hỗn dịch bột thuốc pha trong hồ tinh bột, với mức liều từ 10,0g – 30,0g mẫu thử/kg/ngày không nhận thấy biểu hiện gì khác thường, không nhận thấy biểu hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Tất cả chuột đều ăn uống, hoạt động bình thường. Không xác đinh được liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) vì không tìm được liều gây chết chuột. Chuột ở nhóm chứng và nhóm thử tăng trọng lượng cơ thể đều như nhau trong thời gian theo dõi. 3.2 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM A.FLAVUS DA2 3.2.1 Xác định đường cong sinh trưởng Thời gian nhân nuôi thích hợp cho thu hồi sinh khối chủng A. flavus DA2 là 48h, vì khi tiếp tục kéo dài thời gian nhân nuôi sẽ xảy ra hiện tượng thiếu dinh dưỡng và có bào tử trên thành bình nuôi cấy, sinh khối nấm mốc giảm. 3.2.2 Sản xuất bào tử chủng A.flavus DA2 bằng công nghệ nuôi cấy bề mặt 3.2.2.1 Lựa chọn môi trường thích hợp Môi trường thích hợp cho sự phát triển và sự tạo bào tử của chủng A. flavus DA2 là môi trường MT1 (môi trường cám trấu). Ở môi trường này mật độ bào tử đạt 7,1x107CFU/g. Book và cộng sự đã nghiên cứu công nghệ sản xuất bào tử chủng Aspergillus flavus không sinh độc tố trên môi trường hạt lúa mì, sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 310C sản lượng bào tử đạt 4,9x109 CFU/g. Như vậy môi trường cám trấu cho mật độ bào tử thấp hơn môi trường hạt lúa mì nhưng môi trường cám trấu có giá thành rẻ hơn nhiều so với môi trường hạt lúa mì và là nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt nam. Tận dụng được nguồn phế phụ phNm nông nghiệp khi ứng dụng sản xuất bào tử chủng A. flavus DA2 ở quy mô pilot. Vì vậy, môi trường này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Chủng A. flavus DA2 có khả năng tạo bào tử cao nhất là 7,1x107CFU/g tại 300C sau 7 ngày nuôi cấy. Theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, nhiệt độ thích 8 hợp với đa số nấm mốc là 30-32oC. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Book và Cotty khi nuôi cấy A.flavus AF36 ở nhiệt độ 310C mật độ bào tử đạt 4,9x109CFU/g sau 7 ngày nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy, nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy chủng A.flavus DA2 cho sự tạo bào tử là 300C. 3.2.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm của môi trường. Khi tăng độ Nm môi trường nuôi từ 55% đến 65%, khả năng tạo bào tử của chủng A. flavus DA2 tăng dần và đạt giá trị cực đại là 7,1x107CFU/g khi độ Nm môi trường cám trấu là 65%. Ở các giá trị độ Nm môi trường cám trấu cao hơn, khả năng tạo bào tử của chủng A.flavus DA2 giảm dần. Kết quả này phù hợp với đặc điểm sinh lý chung của nấm mốc thường sinh trưởng và có hoạt tính sinh học tốt trên môi trường rắn có độ Nm từ 60 – 65%. 3.2.2.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy. Mật độ bào tử chủng A.flavus DA2 nuôi cấy trên môi trường cám trấu tăng nhanh trong khoảng thời gian từ 4-8 ngày. Ngày thứ 9 mật độ bào tử đạt 2,0x109CFU/g và đạt cao nhất ở ngày thứ 10, là 2,2x109 CFU/g. Như vậy, thời gian nuôi cấy phù hợp cho sự tạo bào tử chủng A.flavus DA2 là 9 ngày. Nếu kéo dài thời gian nuôi cấy đến ngày thứ 10 thì sẽ làm tăng chi phí trong sản xuất, trong khi sản lượng bào tử A.flavus DA2 tăng lên không nhiều. 3.2.2 Sản xuất bào tử chủng A.flavus DA2 ở quy mô pilot 3.2.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến sản lượng bào tử chủng A. flavus DA2 Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nấm mốc/nguyên liệu càng cao thì lượng bào tử tạo thành nhiều hơn ở giai đoạn sớm của quá trình nuôi. Với tỷ lệ mốc ban đầu là 10% thì thu được lượng bào tử khi kết thúc quá trình nuôi đạt 2,1x109 CFU/g. Tỷ lệ giống ban đầu là 5% mật độ bào tử thu được thấp hơn, chỉ đạt 7,5x108 CFU/g. Do vậy, tỷ lệ tiếp giống khi nuôi cấy bề mặt chủng A.flavus DA2 cho sản lượng bào tử cao là 10%. 3.2.2.2 Ảnh hưởng của độ dày khối ủ đến sản lượng bào tử của chủng A. flavus DA2 Kết quả nghiên cứu cho thấy, khối ủ có độ dày 6,0 cm cho mật độ bào tử lớn nhất đạt 2,1x109cfu/g, các mẫu có độ dày khối ủ là 8 cm và10 cm có hệ sợi phát triển yếu hơn hẳn, chủ yếu chỉ mọc trên bề mặt khối môi trường. Do đó, độ dày khối ủ khi nuôi cấy bề mặt chủng A. flavus DA2 là 6 cm. 9 3.2.3 Hoàn thiện chế phẩm AF từ chủng A.flavus DA2 3.2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn chất mang Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 hầu như không giảm sau 6 tháng bảo quản và chỉ giảm nhẹ đối với các chất bảo quản là canxi alginate và than bùn, từ 1x109CFU/g xuống còn 7x108CFU/g và từ 1x109CFU/g xuống còn 8x108CFU/g, theo thứ tự sau 12 tháng bảo quản. Mật độ bào tử giảm mạnh ở chất mang là cám gạo, từ 1x109CFU/g, xuống còn 1x107CFU/g sau 6 tháng bảo quản và còn 1x 105 CFU/g sau 12 tháng bảo quản. Do giá thành chất mang canxi alginat đắt hơn than bùn nên chúng tôi chọn than bùn để làm chất bảo quản bào tử chủng A. flavus DA2. 3.2.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm A.flavus DA2 quy mô pilot Từ các kết quả nghiên cứu thu nhận được, quy trình công nghệ nhân nuôi, thu hồi và tạo chế phNm A.flavus DA2 được đưa ra như sau: Chủng A.flavus DA2 Trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng PDA Nhân giống cấp 1 trên bình tam giác 500ml Nhân giống cấp 2 trên hệ thống tăng lên men chìm sục khí 100 lít/mẻ Nuôi cấy bề mặt Thu hồi sinh khối bào tử nấm Phối trộn chất mang Đóng gói Chế phẩm AF 10 Thuyết minh quy trình: + Giữ giống Chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin được giữ giống ở ống thạch nghiêng có môi trường PDA sau đó được cấy sang môi trường khoai tây lỏng trong bình tam giác 500ml. Thành phần môi trường khoai tây lỏng: Glucoza 20g/l, dịch chiết khoai tây 1000ml, pH điều chỉnh đến 5,5. + Nhân giống cấp 1 Nuôi cấy lắc chủng A.flavus DA2 ở bình tam giác có môi trường PDA lỏng trên máy lắc điều chỉnh nhiệt độ Sanyo (Nhật Bản), vận tốc 200 v/ph, nhiệt độ 300C trong thời gian 48h. + Nhân giống cấp 2 Sinh khối chủng A.flavus DA2 được chuyển sang hệ thống tăng lên men chìm sục khí 100 lít/mẻ chứa môi trường PDA (pH 5,5) đã được khử trùng và làm nguội đến nhiệt độ 300C (điều kiện khử trùng là 1atm, trong thời gian 30 phút). Tỷ lệ tiếp giống 10%, nuôi cấy trong thời gian 48h, vận tốc khuấy 200 v/ph, nhiệt độ nuôi cấy 300C. + Nuôi cấy bề mặt ChuNn bị môi trường cám trấu: cám trấu được trộn đều theo tỷ lệ 4:1. Bổ sung 1 lượng nước để đạt được độ Nm 65% là độ Nm thích hợp để nuôi cấy chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin. Cho nguyên liệu cám trấu vào túi nilong hoặc bao PP dệt, mỗi túi chứa 5kg cám trấu, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 1 giờ. Để nguyên liệu cám trấu nguội đến 300C rồi đổ vào các khay có kích thước 80cmx50cmx15cm, độ dày cám trấu 6cm/khay, mỗi khay có 5kg môi trường. Tiếp giống với tỷ lệ 10% vào môi trường cám trấu, trộn thật đều hỗn dịch chủng giống A.flavus DA2 không sinh aflatoxin và cám trấu. Nuôi cấy chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin ở nhiệt độ 300C trong 9 ngày. Các khay nuôi cấy được đặt trên các dàn sắt có kích thước dài 1,2m, rộng 0,6m, cao 1,5m. + Thu hồi các bào tử tạo chế ph m AF từ chủng A.flavus DA2 Sau khi kết thúc nuôi cấy, sấy khô sinh khối ở nhiệt độ 450C trong 48h. Phối trộn lượng sinh khối thu được sau khi sấy với than bùn tỉ lệ sinh khối chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin và than bùn là 1:1. Đóng gói chế phNm AF vào túi polyetylen và bảo quản chế phNm nơi khô mát. 11 3.3 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM AF TRÊN NGÔ VÀ LẠC 3.3.1 Nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm 3.3.1.1 Nghiên cứu tỷ lệ giữa chủng sinh aflatoxin và chủng không sinh aflatoxin A. flavus DA2 + Khả năng cạnh tranh của chế ph m A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau Hình 3.5 Sắc ký đồ thể hiện khả năng cạnh tranh của chế ph m A. flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau Chú thích: Chu n: ChuNn aflatoxin; Mẫu M1: Tỷ lệ AF14/DA2 = 3/1; Mẫu M2: Tỷ lệ AF14/DA2 = 2/1; Mẫu M3: Tỷ lệ AF14/DA2 = 1/1; Mẫu M4: Tỷ lệ AF14/DA2 =1/2. Chủng sinh độc tố A.flavus AF14 được tiến hành nuôi cấy đồng thời với chế phNm chứa chủng không sinh độc tố A. flavus DA2 trên môi trường ngô hạt đã thanh trùng với tỷ lệ (chủng AF14/DA2): 3/1, 2/1, 1/1 và 1/2 sao cho mật độ bào tử tổng số đạt 1,5x105 CFU/g ngô. Sau 9 ngày nuôi cấy tiến hành tách chiết độc tố và xác định hàm lượng aflatoxin bằng sắc ký TLC. Kết quả phân tích cho thấy khả năng ức chế sự tạo aflatoxin là không cao nếu như tỉ lệ chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin được sử dụng thấp hơn chủng AF14 sinh aflatoxin. Vết aflatoxin chỉ hoàn toàn mất đi ở các mẫu ngô khi tỉ lệ A. flavus DA2 cao hơn A.flavus AF14 sinh aflatoxin. + Khả năng cạnh tranh của chế ph m A. flavus DA2 trên đất trồng ngô, lạc ở quy mô phòng thí nghiệm Tiến hành nhiễm đồng thời chủng A.flavus AF14 sinh độc tố và A. flavus DA2 trên đất trồng ngô, lạc đã tiệt trùng với mật độ tổng số 2x105 CFU/g. Kết quả nghiên cứu khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin trong đất trồng ngô, lạc ở các tỷ lệ khác nhau được trình bày ở bảng 3.1. 12 Bảng 3.1 Khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2 khi bón vào đất ở các tỷ lệ khác nhau Tỷ lệ chủng AF14/DA2 khi nhiễm vào đất (%) Tỷ lệ chủng AF14/DA2 sau khi nhiễm vào đất 01 tháng (%) AF14 DA2 AF14 DA2 100 0 100 0 60 40 25,13 74,87 50 50 0 100 40 60 0 100 20 80 0 100 Chủng A.flavus DA2 đã thể hiện tính cạnh tranh cao đối với chủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin. Sau khi nhiễm vào đất trồng ngô, lạc 1 tháng, tỷ lệ chủng A. flavus AF14:DA2 từ 60:40; 50:50; 40:60 và 20:80 đã chuyển thành 25,13: 74,87; 0:100; 0:100; 0:100, theo thứ tự. Với tỉ lệ 1/1 chủng A. flavus DA2 đã có thể ức chế hoàn toàn chủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin, cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Brown và cộng sự khi nuôi cấy hỗn hợp hai chủng sinh và không sinh độc tố với cùng tỷ lệ 1/1 (giảm aflatoxin trên ngô là 78%). Kết quả 3.1 chỉ ra rằng, để đạt được hiệu quả cạnh tranh cao cần bổ sung chế phNm DA2 vào môi trường với mật độ bằng hoặc lớn hơn chủng A. flavus sinh độc trong tự nhiên. 3.3.1.2 Ảnh hưởng của thời điểm sử dụng đến khả năng cạnh tranh của chế phẩm A. flavus DA2 Chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin và chủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin được cấy đồng thời hoặc cấy cách nhau 24 giờ lên môi trường ngô hạt đã được thanh trùng (tỉ lệ 1/1 ở mật độ tổng 1,5.105 CFU/g ngô). Sau 7 ngày nuôi ở 28oC, tiến hành tách chiết độc tố và kiểm tra hàm lượng aflatoxin trong môi trường nuôi cấy bằng sắc kí bản mỏng để xác định được thời điểm sử dụng chế phNm hợp lí cho hiệu quả cạnh tranh cao. 13 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 Chu n Hình 3.6 Sắc ký TLC thể hiện khả năng đối kháng của chế ph m A. flavus DA2 ở các thời điểm cấy khác nhau Chú thích: ChuNn: ChuNn aflatoxin B1; Mẫu 4: Chủng A. flavus DA2 cấy trước chủng A. flavus AF14 24h; Mẫu 5: Cấy đồng thời 2 chủng A. flavus DA2 và A. flavus AF14; Mẫu 6: Chủng A. flavus AF14 cấy trước chủng A.flavus DA2 24h. Kết quả phân tích aflatoxin ở hình 3.6 cho thấy, ở mẫu ngô cấy chế phNm A.flavus DA2 trước AF14 24h, không phát hiện được aflatoxin. Ở mẫu ngô cấy đồng thời A.flavus DA2 và AF14 cho hiệu quả giảm nhiễm aflatoxin cao, vết aflatoxin mờ đi so với mẫu cấy chủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin trước chế phNm A.flavus DA2. Hiệu quả giảm nhiễm aflatoxin đạt được trong 2 trường hợp chủng A.flavus DA2 cấy trước và cấy đồng thời với chủng AF14 là khá cao. Do đó, có thể khẳng định, khi triển khai trên đồng ruộng nên sử dụng chế phNm A.flavus ngay từ đầu vụ trước khi gieo trồng để tạo ưu thế cạnh tranh. Sử dụng một lượng lớn chế phNm A.flavus DA2 thì hiệu quả cạnh tranh vẫn khá cao cho dù trong đất đã bị nhiễm A.flavus sinh độc tố từ trước đó. 3.3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến sinh trưởng, phát triển và khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2 + Ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến khả năng phát triển của chủng A.flavus DA2 Thuốc bảo vệ thực vật được người dân sử dụng phổ biến để diệt sâu và trừ cỏ trên ngô, lạc là thuốc trừ sâu Sumithion 50EC (chứa 95% hoạt chất Fenitrothion do công ty Sumitomo Chem. Co.,Ltd Nhật Bản sản xuất) và thuốc diệt cỏ Saicoba 800EC (chứa 80% hoạt chất Acetochlor do công ty Cổ phần Bảo vệ Thực vật Sài Gòn sản xuất) đã được chọn để sử dụng trong thí nghiệm này. 14 Kết quả nghiên cứu cho thấy, thuốc trừ sâu Sumithion 50EC và thuốc trừ cỏ Saicoba 800EC đều không ảnh hưởng đến sự phát triển sinh khối của A.flavus DA2 trong điều kiện phòng thí nghiệm. Khi tăng lượng thuốc bảo vệ thực vật gấp 6 lần nồng độ sử dụng ngoài thực tế vẫn không thấy có sự ảnh hưởng nào đến sự phát triển sinh khối của A. flavus DA2. (Nồng độ khuyến cáo sử dụng của Sumithion 50EC là 2,5ml/l, Saicoba 800EC là 1,5ml/l). + Ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến khả năng cạnh tranh của chế ph m A.flavus DA2 Chủng A.flavus DA2 và chủng sinh độc tố A.flavus AF14 được nuôi cấy đồng thời trong môi trường PDA lỏng (tỉ lệ 1:1, với mật độ tổng 1,5x105 CFU/ml), lắc 200 vòng/phút ở 300C để nghiên cứu sự ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu Sumithion 50EC và thuốc trừ cỏ Saicoba 800EC đến khả năng cạnh tranh của chế phNm AF đối với A.flavus AF14. Các loại thuốc trên được bổ sung vào các mẫu thí nghiệm với nồng độ thông thường được khuyến cáo sử dụng (thuốc trừ sâu 2,5 ml/l, thuốc diệt cỏ 1,5 ml/l). Sau 9 ngày nuôi, tiến hành thu dịch nuôi, tách chiết và xác định hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng TLC. 1 2 3 4 5 6 7 Hình 3.7 Khả năng đối kháng của chủng A. flavus DA2 khi có mặt của thuốc bảo vệ thực vật bằng TLC Chú thích: 1: Aflavus DA2 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ cỏ; 2: Aflatoxin B1 chuNn; 3: Aflavus AF14 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ cỏ; 4: Hỗn hợp DA2 và AF14 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ cỏ; 5: Aflavus DA2 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ sâu; 6: Hỗn hợp DA2 và AF14 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ sâu; 7: Aflavus AF14 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ sâu; Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, thuốc diệt cỏ Saicoba 800EC và thuốc trừ sâu Sumithion 50EC không làm giảm khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2. Khi nuôi cấy hỗn hợp chủng DA2 và AF14 trên môi trường khoai tây lỏng có 15 bổ sung 2 loại thuốc hóa học này vết aflatoxin trên bản mỏng mờ đi, chứng tỏ hiệu quả giảm nhiễm aflatoxin đạt được vẫn khá cao. 3.3.2 Nghiên cứu ở quy mô đồng ruộng 3.3.2.1 Đánh giá mức độ nhiễm A. flavus trên đất trồng ngô, lạc Một vấn đề quan trọng được nhiều nhà khoa học quan tâm là sự có mặt của loài nấm gây hại A. flavus trên đất trồng của một số tỉnh ở Việt Nam. Mật độ của nó có ảnh hưởng lớn đến chất lượng nông sản nói chung trong giai đoạn sau thu hoạch. Các chủng nấm mốc A. flavus nhiễm trong đất trồng ngô, lạc tại các tỉnh Vĩnh Phúc, Nghệ An, Đắc Nông được phân lập theo phương pháp của Raper và Fennel. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, mật độ nhiễm A. flavus trong đất trồng ngô, lạc ở Việt Nam là rất cao (>104CFU/g đất), do đó cần có biện pháp phòng chống nấm mốc và độc tố của chúng ngay từ giai đoạn đồng ruộng. Những kết quả về điều tra khảo sát mức độ nhiễm các loài A. flavus sinh aflatoxin trong đất trồng ngô, lạc ở các tỉnh là cơ sở quan trọng trong việc xây dựng được liều sử dụng thích hợp của chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin dùng để phòng chống aflatoxin trên ngô, lạc tại các địa phương này. 3.3.2.1 Khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2 (Chế phẩm AF) trên đất trồng ngô và ngô ở giai đoạn đồng ruộng và trong quá trình bảo quản + Khả năng cạnh tranh của chế ph m AF trong đất trồng ngô Kết quả ở bảng 3.2 chỉ ra rằng, ở ruộng ngô đối chứng không sử dụng chế phNm AF tổng mật độ nấm A.flavus trong đất trồng ngô là 2,0x104 CFU/g, trong đó mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin chiếm 90% số chủng A.flavus phân lập được. Khi sử dụng 1 lần, 2 lần và 3 lần chế phNm AF, tỷ lệ chủng A.flavus sinh aflatoxin trong đất trồng ngô giảm từ 90% xuống còn 39,4%, 7,3% và 4,5% theo thứ tự. Như vậy, chủng A. flavus DA2 đã có khả năng cạnh tranh cao và thay thế các chủng A. flavus sinh aflatoxin tồn tại tự nhiên trong đất, vì vậy đã làm giảm rõ rệt mật độ các chủng A. flavus sinh aflatoxin trong đất trồng ngô. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Robert và công sự khi sử dụng chủng A. flavus AF36 để phòng chống A. flavus và aflatoxin trên ngô, chủng này đã có tác dụng giảm 95% A. flavus sinh aflatoxin trong đất trồng ngô. 16