Tài liệu Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của sâm việt nam (panax vietnamensis ha et grushv., araliaceae) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƢƠNG HỒNG TỐ QUYÊN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV., ARALIACEAE) NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC TP. Hồ Chí Minh, năm 2019 Công trình được hoàn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: GS. TS Nguyễn Minh Đức PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện 2 ……………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP. HCM DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI CỦA TÁC GIẢ Tạp chí trong nƣớc 1. Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng carbon tetrachlorid trên chuột nhắt trắng”, Y Học TP.Hồ Chí Minh, tập 19 phụ bản của số 5, tr.143-148. 2. Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Vũ Huỳnh Kim Long, Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro của saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Y Học TP.Hồ Chí Minh, tập 19 phụ bản của số 5, tr. 157-164. 3. Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Lê Huỳnh Thi, Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của cao chiết từ Sâm Việt Nam trồng trên chuột bị stress cô lập”, Dược liệu, tập 20, số 6/2015 , tr. 378-383. 4. Duong Hong To Quyen, Nguyen Thai Minh Truc, Nguyen Thi Thu Huong, Nguyen Minh Duc (2015), “Effect of cultivated Vietnamese ginseng extract on endurance capacity in mice”, Journal of Medicinal Materials , vol.20, No.3. pp 181-186. 5. Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh Đức (2017), “Khảo sát tác dụng của các bột chiết từ Sâm Việt Nam trồng trên sự rút ngắn giấc ngủ pentobarbital gây bởi stress cô lập”, Dược liệu, 2 (22), tr.109-113. 6. Duong Hong To Quyen, Nguyen Thi Thu Huong, Nguyen Thuy Viet Phuong, Nguyen Minh Duc (2017), “Hepatoprotective activity of cultivated Vietnamese ginseng on oxidative stress-induced liver injury in mice”, Journal of Medicinal Materials, vol.22, No.3. pp 183-189. Tạp chí quốc tế 7. Quyen H T Duong, Phuong T V Nguyen, Huong T T Nguyen, Duc M Nguyen (2016), “Effects of ocotillol-type saponins majonoside-R1 and vina-ginsenoside-R2 on abrogating depression and neuronal oxidative stress in socially isolated depression mouse model”, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol. 9 (2), pp. 27-32. 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) được tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973. Đến năm 1985, tên khoa học được xác định là Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân Sâm (Araliaceae). Hiện nay, Sâm Việt Nam cũng đã được lựa chọn là cây thuốc hàng đầu trong danh mục sản phẩm quốc gia. Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng đề án: “Chương trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dược liệu trong nước và các sản phẩm từ dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030. Xây dựng hồ sơ 40 dược liệu có tiềm năng khai thác và phát triển thị trường”, trong đó cây Sâm Việt Nam được chọn đứng vị trí đầu tiên trong danh sách. Sâm Việt Nam được thế giới biết đến như là một loài Sâm mới và có giá trị cao. Hiện nay, Sâm Việt Nam được trồng tại một số vùng đặc hữu như Kon Tum và Quảng Nam. Trên thị trường Sâm Việt Nam thường bị giả mạo bởi những dược liệu khác, vì vậy việc kiểm nghiệm đánh giá chất lượng Sâm Việt Nam là cần thiết. Về mặt dược lý của Sâm Việt Nam mọc hoang có tác dụng tăng lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ, tăng cường miễn dịch...Tuy nhiên, hiện nay nguồn Sâm sử dụng trên thị trường chủ yếu là từ nguồn trồng trọt. Vì các lý do cần thiết trên tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam”. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu: 1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin chính trong Sâm Việt Nam trồng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) và phương pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC–DAD). 2. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng. 3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi - Tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi - Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi 2 - Tác dụng chống stress tâm lý của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi - Tác dụng chống stress tâm lý của saponin thuộc nhóm ocotillol: Majonosid-R1, majonosid-R2, vinaginsenosid-R2. 2. Tính cấp thiết của đề tài Theo Quyết định số 787/QĐ/TTg ngày 05/6/2017 của Thủ tướng chính phủ, Sâm Việt Nam là sản phẩm thuộc chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020. Cho thấy vai trò cũng như hướng phát triển của Sâm Việt Nam trong nước đang được quan tâm rất nhiều. Tuy nhiên, gần đây sự phát hiện một thứ của cây Sâm này là Panax vietnamensis var. Fuscidiscus mọc hoang tại Vân Nam thuộc Trung Quốc, có hình thái giống Sâm Việt Nam. Loài Sâm này đã được đánh giá bước đầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy trong thành phần saponin có nhóm ocotillol như Sâm Việt Nam. Do đó, vấn đề nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng (Sâm VN) là vấn đề cấp thiết, nhằm góp phần xây dựng thương hiệu quốc gia về Sâm Việt Nam. 3. Những đóng góp mới của luận án Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình nghiên cứu cho Sâm VN : - Có nhiều nghiên cứu đã công bố phương pháp định lượng đồng thời nhiều ginsenosid trong Nhân Sâm, Sâm Tam thất, Sâm Mỹ. Nhưng chủ yếu saponin thuộc nhóm protopanaxadiol, protopanaxatriol. Đề tài lần đầu tiên công bố xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 5 saponin là Ginsenosid-Rg1, Ginsenosid-Rb1, Ginsenosid-Rd, Majonosid-R2 (M-R2) và Vinaginsenosid-R2 (V-R2) bằng phương pháp HPLC-Q-TOF-MS, trong đó có 02 saponin thuộc nhóm ocotillol là M-R2 và V-R2 chỉ có trong Sâm VN mà không có trong Nhân Sâm. - Đề tài đã xây dựng tiêu chuẩn Sâm VN với các chỉ tiêu yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển và có xây dựng thêm chỉ tiêu đánh giá như: Kim loại nặng, xác định chất chiết được trong methanol 70%, xây dựng quy trình định lượng đồng thời 05 saponin bằng phương pháp HPLC- 3 Q-TOF-MS là phương pháp hiện đại, nhanh, chính xác với độ tin cậy cao và được sử dụng phổ biến trên thế giới. - Đề tài lần đầu tiên công bố các kết quả đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm VN 6 tuổi có so sánh đối chiếu với Nhân Sâm trồng 6 tuổi: + Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng Sâm VN 6 tuổi có tác dụng tăng lực trên thử nghiệm chuột bơi kiệt sức Brekhman, tại liều 50 mg/kg Sâm VN có tác dụng tăng lực điển hình hơn Nhân Sâm (NS). Tác dụng tăng lực của Sâm VN tương đương NS trên thử nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng. + Sâm VN có tác dụng bảo gan khỏi tác nhân gây tổn thương gan bởi CCl4, cyclophosphamid, ethanol. + Sâm VN có tác dụng chống stress tâm lý (tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm, chống stress oxy hóa não trên in vivo) tương đương NS. - Đề tài lần đầu tiên đã công bố kết quả và so sánh tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm, chống stress oxy hóa tế bào não trên in vivo của MR1, M-R2 và V-R2; các saponin này giống nhau khung genin chỉ khác nhau giữa các gốc đường và nhóm chức acetyl. Các saponin trên thuộc nhóm ocotillol chỉ có trong Sâm VN với hàm lượng tương đối cao mà không tìm thấy trong NS. Các thực nghiệm trước đây trên Sâm VN để đánh giá tác dụng chống trầm cảm bởi stress tâm lý chỉ dựa trên thực nghiệm bơi bắt buộc (FST). Bởi vì, thực nghiệm FST bị ảnh hưởng bởi yếu tố hạ thân nhiệt do thực hiện trong môi trường nước, để có kết quả tin cậy đề tài thực hiện trên cả hai thử nghiệm FST và treo đuôi chuột (TST). Kết quả M-R1, M-R2 và V-R2 có tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm, chống stress oxy hóa trên não. 4. Bố cục luận luận án Luận án gồm 2 quyển: 1 quyển luận án và 1 quyển phụ lục. Quyển luận án: gồm có 1 trang Bìa, 1 trang Lời cam đoan và 11 trang tài liệu tham khảo không đánh số, 8 trang đánh số La Mã bao gồm các trang: Mục lục, Danh mục hình ảnh, bảng biểu và Ký hiệu viết tắt. Nội dung luận án gồm 137 trang được đánh số tự nhiên (Ả Rập), mở đầu 2 trang, chương 1 tổng quan tài liệu 29 trang, chương 2 đối tượng và phương pháp nghiên cứu 25 trang, chương 3 kết quả nghiên cứu 55 4 trang, chương 4 bàn luận 23 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang. Luận án có 67 bảng, 20 hình, 146 tài liệu tham khảo, 18 tài liệu tham khảo tiếng việt và 127 tài liệu tham khảo tiếng nước ngoài và 1 trang web. Quyển phụ lục: gồm có 9 phụ lục với 123 trang và 1 trang bìa phụ lục không đánh số. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chi Panax Phân loại thực vật chi Panax: Hiện nay theo The Plant list có 13 loài thuộc chi Panax được chấp nhận . Thành phần hóa học các loài thuộc chi Panax: Gồm có đường, acid béo, acid amin, nguyên tố đa và vi lượng, saponin phân 4 nhóm chính là Protopanaxadiol (PPD), Protopanaxatriol (PPT), Ocotillol (OCT). Ngoài ra còn có saponin cấu trúc acid oleanolic (OA), saponin có mạch nhánh C-17, các saponin có khung không phổ biến khác. Phương pháp xác định saponin trong loài thuộc chi Panax Saponin được định lượng bằng phương pháp HPLC kết hợp với detector là UV hay đầu dò tán xạ bay hơi (ELSD), DAD, detector phổ khối tứ cực thời gian bay (HPLC- Q-TOF- MS). Sự liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của ginsenosid: Chủ yếu liên quan đến phần đường trên khung genin. Kiểm nghiệm Sâm thuộc chi panax theo chuyên luận Dược điển Các chỉ tiêu phân tích kiểm nghiệm Sâm theo một số Dược điển như: Châu âu (EP 8.0), Mỹ (USP 4.0, NF35), Nhật Bản (JP 17), Trung Quốc (CP 2015), Hàn Quốc (KP X) và Dược điển Việt Nam V. 1.2. SÂM VIỆT NAM Thực vật học Sâm Việt Nam là cây thảo, sống lâu năm, cao 40-80 cm có khi tới 1 m. Thân rễ nạc, mọc bò ngang, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30-40 cm hay có thể dài hơn, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm 5 để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối là rễ củ hình con quay. Thành phần hóa học: Cho đến nay từ phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất đã phân lập được 61 saponin. Ngoài ra nhiều thành phần khác trong Sâm VN đã được nghiên cứu và xác định như thành phần acid amin, acid béo, thành phần nguyên tố đa vi lượng và 7 polyacetylen. Một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam Tác dụng chủ yếu của Sâm Việt Nam là tác dụng tăng lực, bảo vệ gan, chống stress tâm lý, kích thích miễn dịch, giảm đường huyết, giảm cholesterol…. Phương pháp định tính, định lượng saponin trong Sâm Việt Nam Định tính bằng sắc ký lớp mỏng Phương pháp định lượng saponin trong Sâm Việt Nam Hiện nay, thường dùng phương pháp HPLC-DAD, HPLC-ELSD. 6 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 . Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam trồng từ 2- 6 tuổi, thu hái vào tháng 11/2012 tại Trạm Dược liệu Trà Linh thuộc Công ty Cổ phần Dược phẩm Quảng Nam. Sau khi thu hái được rửa sạch và sấy khô; mẫu Sâm VN 6 tuổi được dùng để xây dựng quy trình định lượng, tiêu chuẩn hóa và chiết cao toàn phần thử tác dụng dược lý. Mẫu Sâm 2 - 5 năm tuổi dùng xác định hàm lượng một số saponin. 2.1.2. Chất đối chiếu Các chất đối chiếu: Ginenosid-Rg1 số lô: GRg1. Ref .012011, ginenosid-Rd số lô: GRd-001-0913, ginenosid-Rb1 số lô: GRb1. Ref. 012011. Majonosid-R2 số lô: Majo.Ref. 012012, vinaginsenosid-R2 số lô: VR2. Ref. 012015. Các chất đối chiếu được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm thuốc Tp.HCM. 2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích. Hóa chất dùng trong thử nghiệm dược lý: Carbon tetrachlorid, cyclophosphamid monohydrat, ethanol. Thuốc thử ellman [5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)], thiobarbituric acid (TBA), natri pentobarbital. Hóa chất định lượng: AST, ALT. Thuốc đối chiếu: Diazepam 5 mg, fluoxetin, silymarin. 2.1.4. Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh chủng Swiss albino trọng lượng 20 ± 2 g được cung cấp bởi Viện Vaccin và Sinh phẩm Y Tế Nha Trang. 2.1.5. Thiết bị dùng trong nghiên cứu Hệ thống HPLC 1290 của Agilent (USA), cột phân tích cột Zorbax Eclipse Plus (150 x 4,6 mm, 3,5µm). Bộ tiêm tự động cho HPLC của Agilent. Tất cả các dữ liệu được ghi và xử lý bằng phần mềm masshunter. Hệ thống phổ khối phân giải cao 6500 series Q-TOF-MS (Agilent). Hệ thống HPLC 1200 của agilent (USA) bao gồm: cột phân tích Phenomenex gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm) và detector DAD. Tất cả các dữ liệu được ghi và xử lý trên phần mềm chemstation. 7 Ngoài ra còn có thêm một số thiết bị nghiên cứu khác. 2.1.6. Nơi thực hiện đề tài Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM: Ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện. Thử nghiệm dược lý được tiến hành tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM. Phòng phân tích thí nghiệm hóa phân tích, bộ môn di truyền – Đại học Khoa học tự nhiên. 2.2 . Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin trong Sâm Việt Nam trồng - Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin bằng hai phương pháp HPLC-MS và HPLC-DAD: Khảo sát điều kiện thông số HPLC-MS và HPLC-DAD, khảo sát điều kiện chiết xuất mẫu. 2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi - Nghiên cứu thực vật. Mô tả bằng cảm quan mô tả chi tiết bộ phận dùng (hình dạng, màu sắc, đặc điểm riêng biệt). Nghiên cứu đặc điểm vi học: Cắt và làm tiêu bản vi phẫu, soi bột thân rễ và rễ, mô tả và chụp ảnh. - Định tính: Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Định lượng: Định lượng đồng thời 05 saponin (G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 và V-R2) bằng phương pháp HPLC-Q-TOF-MS. - Thử tinh khiết: Các chỉ tiêu thử tinh khiết được tiến hành theo DĐVN V: Độ ẩm (Phụ lục 9.6), tro toàn phần (phụ lục 9.8), t lệ vụn nát (phụ lục 12.12), tạp chất (phụ lục 12.11), giới hạn kim loại nặng. 2.2.4. Đánh giá tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 2.2.4.1. Chiết xuất cao toàn phần, saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi Chiết xuất cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 45%, cô thu hồi dung môi, phần dịch chiết còn lại đem đông khô. Kiểm nghiệm cao toàn phần gồm một số chỉ tiêu: Cảm quan, định tính, định lượng. Chiết xuất saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi bằng phương pháp Diaion HP-20. Rửa giải lần lượt với nước, methanol, 8 cloroform. Thu phân đoạn methanol cô thu hồi dung môi, dịch chiết còn lại đem đông khô thu được saponin toàn phần. 2.2.4.2. Khảo sát độc tính cấp Dựa vào thể tích tối đa có thể cho uống trên chuột nhắt trắng uống với thể tích 20 ml/kg thể trọng bằng kim đầu tù chuyên dụng. 2.2.4.3. Tác dụng tăng lực - Tiến hành trên 02 thử nghiệm: Thử nghiệm chuột bơi kiệt sức Brekhman và thử nghiệm bơi trong bể bơi có thể điều chỉnh tốc độ dòng. Liều thử nghiệm của mẫu là 10 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg. 2.2.4.4. Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng trên in vitro Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao toàn phần, saponin toàn phần và một số saponin nhóm ocotillol từ Sâm VN 6 tuổi trên tế bào Hep G2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa nội bào được xác định dựa vào nguyên tắc hoạt động của 2’,7’- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). 2.2.4.5. Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng trên in vivo Tác dụng của Sâm VN trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid, cyclophosphamid, ethanol. Các chỉ tiêu đánh giá: AST, ALT trong huyết thanh, hàm lượng MDA, GSH trong gan. 2.2.4.6. Tác dụng chống stress tâm lý của Sâm Việt Nam trồng - Thực nghiệm gây stress cô lập: Tiến hành nuôi cô lập mỗi chuồng 1 con riêng biệt không tiếp xúc với nhau, kích thước chuồng 22 x 34 x 25 cm. Mỗi chuồng sẽ được ngăn cách nhau bằng tấm carton để chặn sự nhìn thấy nhau giữa các chuột. Mục tiêu của thử nghiệm để đánh giá thời gian chuột bị stress do cô lập, chỉ tiêu đánh giá dựa vào mức độ hồi phục giấc ngủ pentobarbital bị rút ngắn do stress. - Khảo sát tác dụng của Sâm VN trên sự rút ngắn giấc ngủ pentobarbital gây bởi stress cô lập - Tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của Sâm VN + Thực nghiệm hộp sáng tối (Light-dark box test) để đánh giá tác dụng giải lo âu. + Thực nghiệm FST để đánh giá tác dụng chống trầm cảm . 2.2.4.7.Tác dụng của M-R1, MR2, V-R2 trên sự giảm lo âu, chống 9 trầm cảm và stress oxy hóa tế bào não gây ra bởi stress cô lập trên chuột nhắt trắng - Thực nghiệm hộp sáng tối đánh giá tác dụng giải lo âu - Thực nghiệm FST và TST đánh giá tác dụng chống trầm cảm - Xác định hàm lượng MDA và GSH trong não chuột Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng và đánh giá quy trình định lƣợng đồng thời một số saponin trong Sâm Việt Nam trồng 3.1.1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC-MS 3.1.1.1. Xây dựng quy trình định lượng Khảo sát điều kiện HPLC Điều kiện tối ưu sau quá trình khảo sát được lựa chọn: Hệ thống sắc ký: Agilent HPLC 1290 kết hợp hệ thống phổ khối phân giải cao 6500 series Q-TOF. Pha tĩnh: Cột Zorbax Eclipse Plus (150 x 4,6 mm, 3,5µm). Pha động: Kênh A là H2O chứa 0,1 % acid formic, kênh B là acetonitril chứa 0,1 % acid formic theo chương trình sau: 0 - 15 phút (80 % A : 20% B), 15 -17 phút (20% A : 80% B), 17- 19 phút (5% A : 95% B), 19,1 - 25 phút (80% A : 20% B). Thể tích mẫu tiêm: 10 µl. Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Nhiệt độ cột: 40 oC. 10 Thông số đầu dò phổ khối Đề tài dùng chế độ Scan với phần mềm Data Acquisition, dữ liệu MS được ghi với chế độ ion dương và khoảng m/z từ 400-1700 Dalton. Bảng 3.7. Thông số của detector phổ khối định lượng saponin Buồng ion hóa Thông Bộ cô lập khối Thông số số Gas temp (oC) 300 Fragmentor 140 Gas flow (l/min) 10 Skimmer 1 65 Nebulizer (psig) 35 OctopoleRFPeak 650 SheathGastemp 300 SheathGasFlow 12 Vcap 3500 Nozzle voltage (V) 400 Nhận diện saponin trong mẫu thử và chuẩn bằng MS Bảng 3.8. Kết quả HPLC-MS nhận dạng ion của 5 saponin đối chiếu Saponin Công thức Rt (phút) Ion phân tử (m/z) (Da) G-Rg1 C42H72O14 13,681 823,4722 M-R2 C41H70O14 13,834 809,4562 V-R2 C43H72O15 15,205 851,4677 G-Rb1 C54H92O23 17,365 1131,5931 G-Rd C48H82O18 18,534 969,5391 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Kết quả lựa chọn điều kiện chiết xuất để thu được 05 saponin với hàm lượng cao: Phương pháp siêu âm, dung môi MeOH 70%, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 25 oC. 11 3.1.1.2.Đánh giá quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC-MS Tính tương thích hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối của t lệ tín hiệu diện tích pic trên nồng độ chất chuẩn qua sáu lần tiêm liên tiếp có giá trị RSD < 2 %. Do đó qui trình đạt tính tương thích hệ thống. Tính đặc hiệu: Dữ liệu phổ MS xác định tất cả 05 saponin cần định lượng có chỉ số IP > 4, phương pháp định lượng có tính đặc hiệu. Tính tuyến tính: có sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong khoảng tuyến tính (0,05-50 μg/ml), riêng G-Rb1 có khoảng tuyến tính (0,1-50 μg/ml), các hệ số tương quan R2 ≥ 0,9995. Độ lặp lại: Kết quả độ lặp lại trong ngày có % RSD < 5% Độ đúng: Các giá trị hiệu suất thu hồi và hiệu suất thu hồi trung bình đều nằm trong tiêu chuẩn chấp nhận 80 - 110 % , qui trình đạt yêu cầu về độ đúng. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của saponin Bảng 3.24. Giới hạn phát hiện và định lượng bằng HPLC-MS Saponin (ng/ml) Giới hạn G-Rg1 M-R2 V-R2 G-Rb1 G-Rd LOD 0,582 3,209 3,307 0,306 0,234 LOQ 1,940 10,697 11,023 1,018 0,778 Ứng dụng phƣơng pháp LC- MS để định lƣợng saponin trong mẫu Sâm Việt Nam trồng 2 -6 năm tuổi. Hàm lượng G-Rg1, M-R2, V-R2, G-Rb1 và G-Rd tăng dần theo độ tuổi. Ginsenosid–Rb1, M-R2 đạt hàm lượng cao vào năm thứ 6. Tổng hàm lượng saponin tăng dần theo độ tuổi với hàm lượng cao nhất ở năm thứ 6. 3.1.2. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng saponin trong Sâm Việt Nam trồng bằng phương háp HPLC-DAD 3.1.2.1. Xây dựng quy trình định lượng saponin bằng phương háp HPLC- DAD Khảo sát một số thông số HPLC Máy: Agilent HPLC 1200 Detector: Bước sóng 196 nm, nhiệt độ cột: 40 °C Cột: Phenomenex Gemini 5u C18 110A (250 × 4,6 nm, 5 µm) 12 Thể tích tiêm mẫu: 10 µl, tốc độ dòng: 1 ml/phút. Đề tài thăm dò một số điều kiện sắc ký tìm điều kiện tối ưu: Điều kiện 3: 0 –1 phút (80 % A : 20 % B), 1 - 3 phút (68 % A : 32 % B), 3 - 12 phút (68 % A : 32 % B), 12 - 17 phút (55 % A : 45 % B), 17 - 20 phút (50 % A: 50% B), 20 - 24 phút (10 % A: 90% B), 24-24,1 phút (0 % A: 100 % B), 24,1-28 phút (0% A : 100 % B), 28-28,1 phút ( 80 % A : 20 % B), 28,1 - 35 phút (80 % A : 20 % B). Thăm dò điều kiện chiết mẫu Kết quả lựa chọn điều kiện chiết xuất để thu được 05 saponin với hàm lượng cao: Chiết bằng phương pháp siêu âm, dung môi MeOH 70%, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 25 oC. 3.1.2.2. Đánh giá quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC-DAD Tính tương thích hệ thống Các thông số thời gian gian lưu (Rt) và diện tích đỉnh (S) đều có % RSD < 2 %, hệ số kéo đuôi nằm trong khoảng 0,8 - 1,5, các pic có độ phân giải Rs ≥ 1,5. Như vậy quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống. Tính đặc hiệu Sắc ký đồ thể hiện đạt độ tinh khiết pic, thời gian lưu của các pic trong mẫu chuẩn và mẫu thử tương đương nhau. Mẫu trắng không có tín hiệu trùng với thời gian lưu của các pic quan tâm. Khi thêm chuẩn vào dung dịch thử, diện tích đỉnh của mẫu thử tăng lên. Quy trình đáp ứng các yêu cầu về tính đặc hiệu của quy trình định lượng. Tính tuyến tính Kết quả có sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong khoảng tuyến tính, giá trị của hệ số tương quan 0,9995 ≤ R2 ≤ 0,9999. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) LOD của G-Rd thấp nhất 2,9 µg/ml, M-R2 cao nhất là 63 µg/ml. LOQ của G-Rd là 8,6 µg/ml, M-R2 cao nhất là 190 µg/ml. 13 Độ lặp lại của phương pháp HPLC-DAD Độ lặp lại trong ngày: Kết quả định lượng 6 mẫu thử độc lập cho hàm lượng G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 có % RSD < 2%. Do đó quy trình định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại. Độ lặp lại liên ngày: Kết quả định lượng 3 mẫu thử độc lập, lặp lại 3 ngày khác nhau, hàm lượng G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 có % RSD < 5%. Do đó, quy trình định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại. Độ đúng của phương pháp định lượng saponin bằng HPLC-DAD Kết quả có t lệ phục hồi của các ginsenosid trong thực nghiệm trong giới hạn cho phép của t lệ phục hồi lý thuyết của các chất phân tích (90-107 %). 3.2. Xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở Sâm Việt Nam trồng gồm có một số chỉ tiêu: Vi phẫu, soi bột, thử tinh khiết (độ ẩm, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng), định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC-QTOF-MS. 3.3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi 4.3.1. Chiết xuất cao toàn phần, saponin toàn phần Chiết xuất cao toàn phần: Kết quả từ 300 g nguyên liệu có độ ẩm 7,56 % bằng phương pháp chiết ngấm kiệt thu được 150,6 g cao, hiệu suất (54,32 %).Hàm lượng một số saponin trong cao toàn phần SÂM VNT: G-Rg1 (102,2 mg/g), G-Rb1 (35,1 mg/g), G-Rd (36,4 mg/g), M-R2 (73,9 mg/g), V-R2 (0,5 mg/g). Chiết xuất saponin toàn phần Kết quả từ 50 g cao toàn phần có độ ẩm 4,45% thu được 14,86 g saponin toàn phần với độ ẩm 3,48%, hiệu suất (30,02%). 3.3.2. Kết quả khảo sát độc tính cấp Không ghi nhận phân suất tử vong ở liều cao tối đa có thể cho chuột uống Dmax là 48,5 g/kg, thể tích uống 20 ml/kg trọng lượng chuột. 3.3.3. Khảo sát tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam trồng 3.3.3.1. Ảnh hưởng của cao Sâm Việt Nam trồng trong thực nghiệm chuột bơi kiệt sức Brekhman 14 Kết quả cho thấy tại thời điểm T60, T7, T14: Các lô chuột uống cao Sâm VN hay cao NS liều 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg làm tăng phần trăm thời bơi có ý nghĩa thống kê so với lô chứng nước cất (p<0,05). Lô chuột uống cao Sâm VN liều 50 mg/kg sau 7 ngày lặp lại có thời gian bơi tăng 63% đạt ý nghĩa thống kê so với lô uống cao NS liều 50 mg/kg (p<0,05). 3.3.3.2. Ảnh hưởng của cao Sâm Việt Nam trồng trong thực nghiệm chuột bơi trong bể bơi có thể điều chỉnh tốc độ dòng Kết quả cho thấy, tại thời điểm T60, T7, T14: Các lô chuột uống cao Sâm VN hay cao NS liều 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg làm tăng phần trăm thời bơi có ý nghĩa thống kê so với lô chứng nước cất (p<0,01). Tác dụng của Sâm VN tương đương NS. 3.3.4. Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng 3.3.4.1.Tác dụng chống oxy hóa của SâmVN trên in vitro Kết quả cho thấy cao Sâm VN, cao NS cũng như thành phần saponin thuộc nhóm ocotillol (M-R1,M-R2,V-R2) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa thấp. Do đó chưa đủ dữ liệu để tính được nồng độ kháng oxy hóa 50% (EC50). Saponin toàn phần thể hiện phần trăm giảm ROS của Sâm VN là 79,91% và NS là 50,58%; tính toán trên phần mềm Graphpad prism 7.00, xác định EC50 của saponin Sâm VN là 2,381 ± 0,39 (mg/ml) và của saponin NS là 5,031 ± 1,81 (mg/ml). 3.3.4.2. Tác dụng của Sâm Việt Nam trồng trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid Tác dụng cao Sâm Việt Nam trồng trên chỉ số AST, ALT trong huyết tƣơng Kết quả trên nhóm CCl4 (-): Lô chuột uống cao Sâm VN, cao NS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg, saponin Sâm VN hay saponin NST liều 50 mg/kg, cũng như silymarin liều 100 mg/kg có AST, ALT không thay đổi có nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Nhóm CCl4 (+): Lô chứng bệnh lý có hoạt độ AST tăng 115% (p<0,05) và ALT tăng 136,7% (p<0,001) đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng sinh lý. Điều này chứng tỏ chuột bị tổn thương gan khi tiêm CCl4 liều 1 ml/kg. Lô chuột uống cao Sâm VN, cao NS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg, saponin Sâm VN hay saponin NS liều 50 mg/kg, 15 cũng như silymarin liều 100 mg/kg có hoạt độ enzym AST, ALT giảm có nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Ảnh hƣởng cao Sâm VN trên hàm lƣợng MDA và GSH Kết quả cho thấy nhóm chuột không tiêm CCl4: Hàm lượng MDA, GSH trong gan chuột của lô uống silymarin và các lô uống cao toàn phần, không thay đổi đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Nhóm CCl4 (+): hàm lượng MDA trong gan của lô chứng tiêm CCl4 tăng 96% đạt ý nghĩa thống kê (p<0,001) so với lô chứng không tiêm CCl4 (p< 0,001), chứng tỏ CCl4 liều 1 ml/kg gây tổn thương oxy hóa trên gan chuột. Hàm lượng MDA trong gan của lô uống cao Sâm VN liều 200 mg/kg giảm 43% (p<0,05), cao NST giảm 36% và lô uống silymarin liều 100 mg/kg giảm 32% (p<0,05) so với lô chứng bệnh lý. Lô uống cao Sâm VN, cao NS liều 100 mg/kg và saponin Sâm VN hay saponin NS liều 50 mg/kg, có hàm lượng MDA thay đổi không đạt ý nghĩa thống kê. Hàm lượng GSH trong gan chuột của lô chứng bệnh lý giảm 22% đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (p < 0,001), chứng tỏ CCl4 liều 1 ml/kg gây tổn thương oxy hóa trên gan chuột. Hàm lượng GSH trong gan của lô uống cao Sâm VN liều 200 mg/kg tăng 44,8% (p<0,05) so với lô chứng. Lô uống cao NS liều 200mg/ kg tăng 37% (p<0,05), saponin Sâm VN hoặc NS liều 100 mg/kg có hàm lượng GSH tăng 24,7% (p<0,05), 23% (p<0,05) tương ứng so với lô chứng. Cao Sâm VN liều 100 mg/kg hay silymrarin 100 mg/kg làm tăng hàm lượng GSH đạt ý nghĩa thống kê 23% (p<0,05), 38% (p<0,05) tương ứng so với lô chứng bệnh lý. Lô uống cao NS liều 100 mg/kg chưa có sự thay đổi đạt ý nghĩa thống kê. Tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa của cao toàn phần liều 100 mg/kg trên cao Sâm VN điển hình hơn cao NS. 3.3.4.3. Khảo sát tác dụng của Sâm Việt Nam trồng trên thực nghiệm gây tổn thương gan cấp bằng cyclophosphamid Kết quả xác định hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột trên thực nghiệm cyclophosphamid: Kết quả cho thấy nhóm chuột không tiêm cyclophosphamid có hàm lượng MDA và GSH của lô uống cao Sâm VN liều 100 mg/kg, 200 16 mg/kg, silymarin liều 100 mg/kg trong 8 ngày chưa có thay đổi đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Lô uống cao Sâm VN liều 100mg/kg, 200 mg/kg Sâm hay silymarin liều 100 mg/kg chưa có ảnh hưởng lên hàm lượng MDA, GSH trong gan. Nhóm CY (+): Hàm lượng MDA của lô chứng bệnh lý tăng đạt ý nghĩa thống kê (p<0,001) so với lô chứng sinh lý, hàm lượng GSH của lô chứng bệnh lý giảm đạt ý nghĩa thống kê (p<0,001) so với lô chứng sinh lý. Chứng tỏ cyclophosphamid liều duy nhất 150 mg/kg gây tổn thương oxy hóa trên gan. Hàm lượng MDA của lô uống cao Sâm VN hay cao NS liều 100 mg/kg trong 8 ngày giảm nhưng không đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý (p=0,073). Hàm lượng MDA của lô uống cao Sâm VN hay cao NS liều 200 mg/kg, silymarin liều 100 mg/kg trong 8 ngày giảm hàm lượng MDA, đồng thời làm tăng hàm lượng GSH đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý (p<0,001). Cho thấy Sâm VN và NS (liều 200 mg/kg), silymarin liều 100 mg/kg thể hiện tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa lipid tế bào gan, có tác dụng bảo vệ gan. 3.3.4.4 Tác dụng của Sâm Việt Nam trên thực nghiệm gây tổn thương gan mạn bằng ethanol Kết quả khảo sát hàm lượng AST, ALT trong huyết tương vào tuần 8 Kết quả từ cho thấy trên nhóm chuột không uống ethanol: Lô chuột uống cao Sâm VN, cao NS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg, silymarin liều 100 mg/kg có hoạt độ enzym AST, ALT không khác biệt có nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Nhóm EtOH (+): Nhóm chứng bệnh lý có hoạt độ AST tăng 56,6% (p<0,01) đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng sinh lý. Chỉ số ALT của nhóm chứng bệnh lý không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Điều trị với cao Sâm VN hoặc cao NS liều 200 mg/kg thì hoạt độ AST giảm 32,5%, 33,9% đạt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lô chứng bệnh lý. Lô uống cao Sâm VN, cao NS cũng như silymarin liều 100 mg/kg có hoạt độ AST giảm 34,5%,31,7%, 32,9% tương ứng (p<0,050) so với lô chứng bệnh lý. 17 Hoạt độ ALT của các lô điều trị không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Kết quả hàm lƣợng MDA, GSH trong gan chuột sau 8 tuần Kết quả cho thấy nhóm EtOH(-): Các lô chuột uống mẫu thử có hàm lượng MDA và GSH không có sự khác biệt đạt nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Nhóm EtOH (+): Lô chứng bệnh lý có hàm lượng MDA tăng 38,6% và hàm lượng GSH giảm 19% đạt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng sinh lý. Lô uống cao Sâm VN hoặc cao NS liều 200 mg/kg có hàm lượng MDA giảm 35,1%, 33,6% đạt ý nghĩa thống kê (p<0,01) so với lô chứng uống nước cất. Lô uống cao Sâm VN, cao NS cũng như silymarin liều 100 mg/kg có hàm lượng MDA giảm 44%, 44,3%, 46% đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Lô uống cao Sâm VN hoặc cao NS liều 200 mg/kg có hàm lượng GSH tăng 51,8%, 24,4% (p<0,01) so với lô chứng uống nước cất. Lô uống cao Sâm VN, cao NS cũng như silymarin liều 100 mg/kg có hàm lượng GSH tăng 40%, 26,8%, 27,1% tương ứng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Lô điều trị với cao Sâm VN hay cao NS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg cũng như silymarin liều 100 mg/kg, hàm lượng MDA và GSH không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê giữa các nhóm với nhau. 3.3.5. Tác dụng chống stress tâm lý 3.3.5.1. Mô hình gây stress cô lập Kết quả từ cho thấy trên nhóm chuột nuôi chung: Thời gian ngủ giữa các tuần so với nhau và so sánh với ngày đầu thì không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Nhóm nuôi cô lập: Sau 4 tuần nuôi cô lập thì giấc ngủ gây bởi pentobarbitral rút ngắn nhiều nhất (p< 0,05); chứng tỏ sau 4 tuần nuôi cô lập chuột có dấu hiệu bị stress.