Tài liệu Nghiên cứu tác động của fluoxetine đến nồng độ camp, progesterone và testosterone trong tế bào hek293 khi kích thích bởi hfsh tái tổ hợp chuỗi đơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TAO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN QUỲNH NGA NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA FLUOXETINE ĐẾN NỒNG ĐỘ cAMP, PROGESTERONE VÀ TESTOSTERONE TRONG TẾ BÀO HEK293 KHI KÍCH THÍCH BỞI hFSH TÁI TỔ HỢP CHUỖI ĐƠN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Bình Định - Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TAO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN QUỲNH NGA NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA FLUOXETINE ĐẾN NỒNG ĐỘ cAMP, PROGESTERONE VÀ TESTOSTERONE TRONG TẾ BÀO HEK293 KHI KÍCH THÍCH BỞI hFSH TÁI TỔ HỢP CHUỖI ĐƠN Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 8420114 Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Mộng Điệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng trong bảo vệ bất kì một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện hoàn thành luận văn đã được cảm ơn và mọi thông tin trích dẫn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Quỳnh Nga LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến quý Thầy Cô trong Ban giám hiệu Trường Đại học Quy Nhơn, quý Thầy Cô trong trường đã tạo điều kiện, dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Nguyễn Thị Mộng Điệp đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất, quan tâm, hướng dẫn nhiệt tình nhất, tạo động lực lớn giúp tôi vượt qua được những khó khăn trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin cảm ơn quý Thầy Cô ở Học viện Quân Y, Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) đã tài trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, người thân cùng tập thể lớp Sinh học thực nghiệm K23 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Do thời gian thực hiện và sự hiểu biết của bản thân có hạn nên luận văn khó tránh khỏi sai sót. Tôi mong nhận được những lời góp ý, chỉ bảo của Thầy Cô để có thể hoàn thiện hơn luận văn của mình. Quy Nhơn, ngày 20 tháng 8 năm 2022 Tác giả luận văn Nguyễn Quỳnh Nga MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. 4 MỤC LỤC ........................................................................................................ 5 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................... 3 DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. 4 DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... 5 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ..................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................ 3 5. Những đóng góp mới của đề tài .............................................................. 3 NỘI DUNG....................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1 Tổng quan về Fluoxetine ...................................................................... 4 1.2 cAMP và cơ chế hình thành trong tế bào.............................................. 7 1.2.1 cAMP và cơ chế hình thành trong tế bào .......................................... 7 1.2.2 Adenylate cyclase và vai trò trong sự hình thành tế bào................... 9 1.3 Hormone kích noãn bào tố ( hFSH) .................................................... 13 1.3.1 Tổng quan về hormone kích noãn bào tố FSH ................................ 13 1.3.2 Vai trò của hormone FSH trong sinh sản ........................................ 15 1.4 Progesterone và vai trò trong sinh sản ................................................ 17 1.4.1 Tổng quan về Progesterone ............................................................. 17 1.4.2 Vai trò Progesterone trong sinh sản................................................ 19 1.5 Testosterone và vai trò trong sinh sản ................................................ 22 1.5.1 Tổng quan về Testosterone .............................................................. 22 1.5.2 Vai trò Testosterone trong sinh sản ................................................. 24 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 26 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị hóa chất và đối tượng nghiên cứu ............... 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 26 2.1.2 Nguyên vật liệu ................................................................................ 26 2.1.3 Thiết bị hóa chất. ............................................................................. 26 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................... 26 2.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 26 2.4 Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 27 2.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào ......................................................... 27 2.4.2 Phương pháp xác định cAMP nội bào ............................................ 27 2.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng sống của tế bào HEK293 .......... 28 2.4.4 Phương pháp xác định nồng độ Progesterone ............................... 29 2.4.5 Phương pháp xác định nồng độ testosterone ................................. 30 2.4.6 Phương pháp xác định mức năng lượng ATP trong tế bào ............. 31 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 32 3.1. Ảnh hưởng của Fluoxetine đến tỷ lệ sống của tế bào HEK293 ......... 32 3.2. Ảnh hưởng của Fluoxetine đến nồng độ cAMP nội bào dưới tác động kích thích của hFSH tái tổ hợp chuỗi đơn ................................................ 36 3.3. Ảnh hưởng của Fluoxetine đến nồng độ ATP trong tế bào HEK293 40 3.4. Ảnh hưởng của Fluoxetine đến quá trình tạo steroid trong tế bào HEK293..................................................................................................... 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 49 1. Kết luận............................................................................................... 49 2. Kiến nghị ............................................................................................ 50 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................... 51 PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO) DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT TỪ VIẾT TẮT TỪ ĐẦY ĐỦ 1 AC adenylyl cyclase 2 ACs Adenylyl cyclases 3 ACTH Adrenocorticotropic hormone 4 ART assisted reproductive technology 5 cAMP cyclic Adenosine Mono Photphate 6 ATP Adenosine triphosphate 7 CG chorionic gonadotropin 8 CRP catabolite reactive protein 9 CYP2D6 cytochrome P450 2D6 10 DNA Deoxyribonucleic acid 11 FSH Follicle Stimulating Hormone 12 FSHR The follicle-stimulating hormone receptor 13 GPCR G protein-coupled receptor 14 GPCRs G-protein coupled receptors 15 GnRH Gonadotropin-releasing hormone 16 hFSH Human follicle-stimulating hormone 17 HEK293 293 Human Embryonic Kidney 293 18 LH luteinizing hormone 19 MC4Rs Melanocortin-4 receptors; 20 PKA protein kinase A 21 SSRIs Selective serotonin reuptake inhibitors DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Số hiệu bảng 3.1 Tỷ lệ tế bào HEK293 sống theo nồng độ Fluoxetine Trang 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Công thức hóa học Fluoxetine 4 1.2 Tố chức và chức năng của lộ trình tín hiệu 8 cAMP 1.3 Các cấu trúc đại diện của AC 10 1.4 Cấu trúc domain của adenylyl cyclase (AC) 11 1.5 Cấu trúc mô phỏng và công thức hóa học 14 hormone FSH 1.6 Mô hình cấu trúc phân tử và cấu trúc không gian 19 của progesterone 1.7 Mô hình cấu trúc không gian và cấu trúc phân tử 24 của testosterone 2.1 Cơ chế hoạt động của Glosensor và Luciferin 28 trong phản ứng tạo cAMP 2.2 Ảnh đại diện của xét nghiệm Cell Titer Blue với 29 tế bào HEK293 2.3 Cơ chế phản ứng phát quang của Lucifenin 31 trong CellTiter-Glo 2.0 dưới xúc tác của enzyme luciferase và ion Mg2+ 3.1. Ảnh hưởng của Fluoxetine đến khả năng sống 33-34 sót của tế bào HEK293 3.2 Hình ảnh tế bào HEK293 và tế bào sau khi nhuộm thuốc thử phát huỳnh quang Cell Titer Blue 35 3.3 Biểu hiện tín hiệu của cAMP dưới tác động kích 37 thích của r-hFSH sau 60 phút ủ tế bào với Fluoxetine ở các nồng độ khác nhau 3.4 Biểu hiện tín hiệu của cAMP dưới tác động kích 38 thích của r-hFSH sau 5 phút ủ tế bào với Fluoxetine ở các nồng độ khác nhau 3.5 Ảnh hưởng của Fluoxetine đến nồng độ ATP 41 trong tế bào HEK293 3.6 Ảnh hưởng của Fluoxetine đến sản xuất 44 progesterone dưới kích thích của hFSH trong HEK293 3.7 Ảnh hưởng của Fluoxetine đến sản xuất testosterone dưới kích thích của hFSH trong HEK293 45-46 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài cAMP (cyclic Adenosine Mono Photphate) là tín hiệu thứ hai được xác định và đóng vai trò cơ bản trong phản ứng tế bào đối với nhiều hormone và chất dẫn truyền thần kinh. Nồng độ cAMP nội bào được điều chỉnh bởi sự cân bằng giữa hoạt động của hai enzyme: adenylyl cyclase (AC) và phosphodiesterase nucleotide vòng (PDE). Các đồng phân khác nhau của các enzyme này được mã hoá bởi một số lượng lớn các gen khác nhau về biểu hiện kiểu hình và cơ chế điều hòa, tạo ra các phản ứng tế bào và kích thích đặc hiệu. Fluoxetine, còn có tên thương mại là Prozac và Sarafem cùng một số tên khác, là một loại thuốc phản ức chế của chất ức chế tái hấp thu serotonin đặc hiệu (SSRI). Chúng được sử dụng để điều trị rối loạn trầm cảm chính, rối loạn ám ảnh cưỡng chế, rối loạn thần kinh, rối loạn hoảng loạn và rối loạn tiền kinh nguyệt. Fluoxetine có thể cải thiện tâm trạng, giấc ngủ, ăn không ngon, tăng năng lượng và có thể giúp khôi phục các mối quan tâm của bạn trong cuộc sống hàng ngày. Fluoxetine có thể làm giảm sự sợ hãi, lo lắng, suy nghĩ bất chợt và hoảng loạn. Fluoxetine cũng được sử dụng để điều trị một số rối loạn ăn uống khác, rối loạn căng thẳng sau chấn thương, và một số rối loạn hệ thần kinh/giấc ngủ. Thuốc này cũng có thể được sử dụng để điều trị các cơn nóng bừng xảy ra ở thời kỳ mãn kinh. Đề tài tập trung nghiên cứu tác động của Fluoxetine đối với động học cAMP nội bào trong dòng tế bào phôi thận người HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) được kích thích bởi hFSH tái tổ hợp chuỗi đơn. Đây là một hướng nghiên cứu mới về khoa học không chỉ ở Việt Nam mà còn ở trên thế giới. Dòng tế bào HEK293 có nguồn gốc từ tế bào thận phôi người. Tế bào HEK293 phát triển thuận lợi trong môi trường nuôi cấy, được chuyển nhiễm dễ dàng, và được sử dụng làm vật chủ để biểu hiện gene. Dòng tế bào này đã được sử dụng 2 rộng rãi trong nghiên cứu sinh học tế bào trong nhiều năm và cũng được sử dụng để sản xuất các protein điều trị cho liệu pháp gen, vì sự phát triển và xu hướng chuyển nhiễm đáng tin cậy của chúng. Do vậy, chúng tôi đã chọn sử dụng những tế bào này cho nghiên cứu của mình. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi sẽ nghiên cứu tác động của Fluoxetine đối với động học cAMP nội bào và sản xuất progesterone, testosterone trong dòng tế bào HEK293 để có được cái nhìn chính xác hơn về cơ chế hoạt động Fluoxetine đến chức năng sinh dục. Ngoài ý nghĩa khoa học quan trọng, nghiên cứu vấn đề này còn rất cần thiết cho việc hỗ trợ tư vấn cho chẩn đoán và điều trị bệnh nhân bị trầm cảm. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của đề tài là đánh giá tác động của Fluoxetine đến nồng độ cAMP, progesterone, và testosterone trong tế bào HEK293 khi kích thích bởi hFSH tái tổ hợp chuỗi đơn. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1 Xác định ảnh hưởng của Fluoxetine đến tỷ lệ sống của tế bào HEK293. 3.2 Xác định nồng độ cAMP tạo ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt của hFSH tái tổ hợp chuỗi đơn dưới tác động của Fluoxetine. 3.3 Xác định nồng độ ATP tạo ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt của hFSH tái tổ hợp chuỗi đơn dưới tác động của Fluoxetine. 3.4 Xác định nồng độ progesterone tạo ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt của hFSH tái tổ hợp chuỗi đơn cùng với sự tác động của Fluoxetine. 3.5 Xác định nồng độ testosterone tạo ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt của hFSH tái tổ hợp chuỗi đơn cùng với sự tác động của Fluoxetine. 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Từ các kết quả nghiên cứu mức độ sự ảnh hưởng của các dược phẩm Fluoxetine đến sự tích lũy cAMP nội bào và sản xuất progesterone, testosterone có thể đánh giá liệu các chất hoạt hóa này có thể điều chỉnh sự sản xuất quá mức cAMP và hormone steroid trong tế bào. 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Những kết quả này sẽ cung cấp những hiểu biết sâu sắc hơn về việc sử dụng thuốc trị bệnh trầm cảm Fluoxetine và đóng góp vào tiến bộ về phương pháp cần thiết cho việc điều trị những bệnh nhân này, cũng có thể cung cấp tư vấn về vấn đề sinh lý cho bệnh nhân bị bệnh trầm cảm đang uống loại thuốc này. 5. Những đóng góp mới của đề tài Tính mới hấp dẫn trong nghiên cứu này là chúng tôi sẽ kiểm tra được hoạt tính sinh học của hFSH tái tổ hợp chuỗi đơn trên dòng tế bào HEK293 và ảnh hưởng của các dược phẩm Fluoxetine đối với tế bào nói chung và đưa ra những nhận định về sử dụng dược phẩm này đối với con người. 4 NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Fluoxetine Fluoxetine, tên thương mại thường gặp là Prozac, Sarafem, là thuốc ức chế tái hấp thu serotonin chọn lọc (SSRI) [1]. Fluoxetine có công dụng làm tăng lượng serotonin trong não, duy trì sự cân bằng cho thần kinh. Do vậy người ta thường sử dụng Fluoxetine để điều trị rối loạn trầm cảm chính, rối loạn ám ảnh cưỡng chế, rối loạn thần kinh bulimia, rối loạn hoảng loạn, rối loạn tiền kinh nguyệt, rối loạn lo âu, chứng cuồng ăn, ngoài ra còn được dùng để điều trị xuất tinh sớm. Thuốc được sử dụng có thể làm giảm nguy cơ tự tử ở những người trên 65 tuổi [1]. Fluoxetine được dùng bằng đường uống. Tác dụng phụ thường gặp bao gồm khó ngủ, rối loạn chức năng tình dục, chán ăn, khô miệng, phát ban và những giấc mơ bất thường. Tác dụng phụ nghiêm trọng có thể có như hội chứng serotonin, co giật, tăng nguy cơ tự tử ở những người dưới 25 tuổi và tăng nguy cơ chảy máu. Nếu đột nhiên dừng sử dụng thuốc, hoặc cai thuốc thì có thể xảy ra các triệu chứng như lo lắng, chóng mặt và thay đổi cảm giác [1]. Vẫn chưa rõ ràng về mức độ an toàn nếu dùng trong thai kỳ, nếu đã dùng thuốc, việc tiếp tục cho con bú có thể vẫn thực hiện được. Hình 1.1. Công thức hóa học Fluoxetine 5 Fluoxetine được công ty Eli Lilly and Company phát hiện năm 1972 và được sử dụng vào năm 1986 [2]. Đây là loại thuốc nằm trong danh sách các thuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế giới, tức là nhóm các loại thuốc hiệu quả và an toàn nhất cần thiết trong một hệ thống y tế. Trầm cảm là bệnh thường gặp ở phụ nữ vào giai đoạn sau khi sinh và có thể dẫn đến những ảnh hưởng tiêu cực đến trẻ sơ sinh và gia đình của họ, ngoài ra còn có khả năng gây ra bệnh tật cho người mẹ. Đã có rất nhiều phụ nữ bị trầm cảm sau khi sinh con, được gọi là trầm cảm sau sinh [3]. Biểu hiện của trầm cảm qua các giai đoạn được đặc trưng bởi một loạt các triệu chứng, chẳng hạn như tâm trạng sa sút, mất hứng thú, cảm giác tội lỗi, mất năng lượng và có thể có ý định tự tử. Cũng như ảnh hưởng đến người mẹ, trầm cảm sau khi sinh có thể có những tác động tiêu cực đến trẻ sơ sinh và tác động lớn hơn là ở phạm vi gia đình [4-5]. Những kết quả này có thể bao gồm các tác động tiêu cực đến sự gắn bó giữa mẹ và trẻ sơ sinh, và ảnh hưởng đến sự phát triển cảm xúc hoặc hành vi của trẻ [5]. Trầm cảm là một vấn đề liên quan trong chăm sóc ban đầu; nó gắn liền với bệnh tật cá nhân, xã hội và kinh tế rõ rệt, và tạo ra những yêu cầu đáng kể đối với các nhà cung cấp dịch vụ về khối lượng công việc. Phương pháp điều trị chủ yếu là dùng thuốc hoặc tâm lý. Thuốc chống trầm cảm dùng để điều trị các triệu chứng của bệnh trầm cảm, người ta nhận thấy rằng hiệu quả của chúng tăng lên theo mức độ trầm trọng của bệnh trầm cảm. Tuy nhiên, có thể việc giảm thiểu tiếp xúc với thuốc trong thai kỳ và các biện pháp can thiệp không dùng thuốc có hiệu quả trong việc phòng ngừa và điều trị trầm cảm nhẹ đến trung bình, sẽ giảm những rủi ro đáng kể đối với người mẹ, thai kỳ và thai nhi hoặc trẻ sơ sinh. Fluoxetine làm phát huy tác dụng chống trầm cảm bằng cách ức chế tái hấp thu serotonin trong khớp thần kinh, bằng cách liên kết với bơm tái hấp thu 6 trên màng tế bào thần kinh để tăng tính khả dụng và tăng cường dẫn truyền thần kinh [6]. Serotonin và norepinephrine, cả hai amin sinh học, đã được chứng minh là có vai trò trong bệnh trầm cảm. Nồng độ serotonin thấp xuất hiện trong dịch não tủy của bệnh nhân trầm cảm. Ngoài ra, số lượng điểm hấp thu serotonin thấp hơn nằm trên tiểu cầu của bệnh nhân trầm cảm. Các thụ thể serotonin 5HT1A trước synap nằm trong nhân raphe ở lưng và chiếu đến vỏ não trước. Fluoxetine phát huy tác dụng của nó bằng cách ngăn chặn sự tái hấp thu serotonin vào tế bào thần kinh trước synap bằng cách ngăn chặn protein vận chuyển tái hấp thu nằm ở đầu cuối trước synap. Fluoxetine cũng có hoạt tính nhẹ ở các thụ thể 5HT2A và 5HT2C. Fluoxetine có hoạt tính tối thiểu đối với tái hấp thu noradrenergic. Do khả năng tái hấp thu serotonin, fluoxetine tạo ra tác dụng kích hoạt, và do thời gian bán hủy dài của nó, tác dụng chống trầm cảm ban đầu xuất hiện trong vòng 2 đến 4 tuần. Chất chuyển hóa có hoạt tính của fluoxetine là norfluoxetine, được tạo ra khi enzyme cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) tác động lên nó. Điều quan trọng là fluoxetine có một số tương tác thuốc - thuốc do sự chuyển hóa của nó tại isoenzyme CYP2D6. Ngoài ra, norfluoxetine có thể có tác dụng ức chế cytochrome P450 3A4 (CYP3A4). Cũng cần nhớ rằng fluoxetine có thời gian bán hủy từ 2 đến 4 ngày, và chất chuyển hóa có hoạt tính của nó là norfluoxetine có thời gian bán hủy từ 7 đến 9 ngày [7-8]. Fluoxetine được sử dụng lần đầu tiên cách đây hơn mười năm, và ngay sau khi được giới thiệu, nó đã trở thành chất được kê toa nhiều nhất cho bệnh trầm cảm ở nhiều quốc gia. Fluoxetine đã trở thành một phương pháp điều trị thời thượng trong y tế, trở nên phổ biến trên các phương tiện truyền thông và tin tức, và các nhà xã hội học mô tả nó như một hiện tượng 'dược phẩm tâm thần xã hội', 'sự bùng nổ của Prozac' [9]. 7 1.2 cAMP và cơ chế hình thành trong tế bào 1.2.1 cAMP và cơ chế hình thành trong tế bào Cyclic adenosine monophosphate (cAMP, AMP vòng) là một phân tử tín hiệu phổ biến trên tất cả các lĩnh vực của sự sống. Con đường tín hiệu cAMP là một cơ chế điều hòa được bảo tồn cao. cAMP hiện diện ở tất cả các cơ quan trong cơ thể và tham gia vào vô số các quá trình điều hòa của tế bào. Theo quan niệm này, các chất kích thích ngoại bào được gọi là các chất truyền tin thứ nhất, mà thông thường là các chất dẫn truyền thần kinh và hormone, và chúng có vai trò biến đổi cấu trúc adenylyl cyclase (AC) để tạo ra cAMP [10]. Sự hình thành cAMP phụ thuộc vào thụ thể kết hợp protein G (G-protein coupled receptors – GPCRs). Protein G là một protein heterotrimer, bao gồm một họ protein được phân loại dựa vào cách nó liên kết với màng tế bào và cơ chế hoạt hóa nó. Họ protein này giúp hoạt hóa enzyme adenylyl cyclases (ACs). Adenylyl cyclases là các enzyme tạo ra cAMP, và do đó là thành phần quan trọng của các con đường điều hòa và truyền tín hiệu cAMP. cAMP được tạo thành bởi các adenylyl cyclases bằng cách chuyển hóa ATP thành cAMP và pyrophosphat vô cơ. Hoạt động của ACs được điều chỉnh bởi GPCRs thông qua hai phức hợp protein liên kết GTP (Guanosine-5'triphosphate ) dị phân tử là protein Gs và Gi. Kích hoạt các thụ thể liên kết với protein Gs dẫn đến tăng hoạt động ACs và hình thành cAMP, trong khi kích hoạt các thụ thể protein Gi dẫn đến ức chế ACs và giảm mức cAMP [10]. cAMP sau đó kích hoạt hoạt động của protein kinase A (PKA) biến thông tin chức năng của cAMP thành các đáp ứng, như sự chuyển hóa năng lượng, sự phiên mã gene và hoạt động của các kênh ion. 8 Hình 1.2. Tố chức và chức năng của lộ trình tín hiệu cAMP Lộ trình tín hiệu cAMP điều khiển một lượng lớn các quá trình nội bào, ví dụ như sau: - cAMP có hoạt động kháng viêm mạnh bởi sự ức chế hoạt động của macrophages và dưỡng bào (mast cell). - Thụ thể melanocortin 4 (MC4Rs) trên neuron thứ hai (second-order) sử dụng lộ trình tín hiệu cAMP để tổng hợp lên các yếu tố phiên mã hạ đồi (hypothalamic transcription factor) single-minded 1 (Sim 1) làm giảm lượng thức ăn đưa vào cơ thể và gây giảm cân. - cAMP có vai trò trung gian đối với các hormone ưa lipid trong tế bào mỡ vàng bằng cách hoạt hóa enzyme lipase nhạy cảm hormone (hormonesensitive lipase). - Sự sinh nhiệt của tế bào mỡ nâu được điều hòa bởi hoạt động của noradrenaline qua hoạt động của cAMP. - Sự hoạt hóa Dopamine and cAMP regulated phosphoprotein 32 kDa (DARPP-32) cùng phối hợp với hoạt động của lộ trình tín hiệu của dopamine 9 và glutamate trong neuron tủy trung gian (medium spiny neurons). - Sự phân hủy glycogen cảm ứng adrenaline (adrenaline-induced glycogenolysis) trong tế bào cơ xương phụ thuộc vào sự phosphoryl hóa của protein kinase PKA. - Sự hoạt hóa của các yếu tố phiên mã phụ thuộc AMP (The cAMP response element binding protein - CREB) góp phần điều hòa sự tổng hợp glucagon trong tế bào tụy. 1.2.2 Adenylate cyclase và vai trò trong sự hình thành tế bào Adenylate cyclase (EC 4.6.1.1) hay còn gọi là adenylyl cyclase (hoặc adenyl cyclase), là các enzyme quan trọng trong con đường cAMP được bảo tồn về mặt tiến hóa cao, ACs kiểm soát sinh lý của tế bào, mô, cơ quan và sinh vật về sức khỏe và bệnh tật. Để hiểu biết toàn diện về vai trò cụ thể của ACs trong các quá trình sống này đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về cấu trúc và cơ chế hoạt động của các enzyme này. Adenylate cyclase (ACs) đóng vai trò quan trọng trong chuỗi truyền tín hiệu từ bên ngoài tế bào vào trong tế bào chất. Khi nhận được tín hiệu truyền từ protein G (protein G nhận tín hiệu từ thụ thể), ACs sẽ thực hiện chức năng xúc tác quá trình chuyển hóa adenosine triphosphate (ATP) thành adenosine monophosphate mạch vòng (cAMP) và pyrophosphate (PPi). Sản phẩm của adenylyl cyclase, cAMP, là một mắt xích quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào, được xem như là chất truyền tín hiệu thứ hai trong tế bào. Các AC trong thế giới của sự sống bao gồm sáu lớp riêng biệt (lớp I – VI). Sáu lớp này có ở sinh vật nhân sơ, nhưng bộ gene của động vật có vú chỉ mã hóa các AC lớp III. Mặc dù có sự khác biệt sâu sắc về cấu trúc và tổ chức miền, sáu lớp AC có chức năng rất giống nhau, xúc tác chuyển đổi phân tử ATP thành cAMP. 10 Hình 1.3. Các cấu trúc đại diện của AC (a) Cấu trúc tinh thể của nhân tố phù nề AC anthrax cấp II cho thấy các gốc quan trọng liên quan đến liên kết và xúc tác ATP thành cAMP. (b) Kiến trúc vị trí hoạt động của AC hòa tan ở người (AC10) với sự hiện diện của chất tương tự ATP và các ion kim loại hóa trị hai. (c) Cấu trúc tia X của AC cấp IV từ Yersinia pestis, liên kết với chất tương tự ATP. Mặc dù có sự khác biệt đáng kể về các nếp gấp cấu trúc, các AC này có thể duy trì các cấu hình vị trí hoạt động tương tự liên quan đến các gốc axit để điều phối các ion kim loại hóa trị hai và các gốc cơ bản để ổn định ATP tích điện âm trong túi xúc tác. Sáu lớp adenylyl cyclase (AC) khác nhau được phân bố khắp vi khuẩn, vi khuẩn cổ và eukaryote; các lớp này không liên quan về trình tự và cấu trúc nhưng tất cả đều tạo ra cAMP là kết quả của quá trình tiến hóa [11]. Ở động vật có vú, AC bao gồm 10 loại: 9 loại trong số đó là đính trên màng nên gọi là AC màng, loại thứ 10 tan trong bào tương nên gọi là AC hòa tan.