Tài liệu Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm chuẩn đoán nhanh bệnh sốt denghue ,sốt xuất huyết denghue và viêm đường hô hấp cấp (sars) ở việt nam

Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ Ch−¬ng tr×nh KC- 04 B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc vµ kü thuËt §Ò tµi cÊp nhµ n−íc §Ò tµi: KC 04 - 32 Nghiªn cøu s¶n xuÊt Bé sinh phÈm ®Ó chÈn ®o¸n nhanh bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS) ë ViÖt Nam. GS.TS. Tr−¬ng uyªn Ninh ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng 6701 24/12/2007 Hµ Néi, 9- 2007 B¶n quyÒn thuéc VVSDTTW- Bé Y TÕ Nh÷ng ch÷ viÕt t¾t trong b¸o c¸o ☯ ARN Axit ribonucleic ADN Axit deoxyribonucleic CID Center of Infection Diseases Trung t©m c¸c bÖnh nhiÔm trïng CDC Center of Diseases Control Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt ELISA Enzym linked Immunosorbent Assay Thö nghiÖm miÔn dÞch men GAC- ELISA IgG Capture ELISA Kü thuËt miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn IgG HI Hemagglutination Inhibition test HT HuyÕt thanh FBS IFAT Fetal Bovin Serum (Immunofluorescent indirect Antibody Technique) Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp IFDT (Immunofluorescent direct Antibody Technique) Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang trùc tiÕp IFA (Immunofluorescent Indirect Antibody Technique) Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp MAC - IgM Capture ELISA ELISA Kü thuËt miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn IgM ML Maximum Likelihood Ph−¬ng ph¸p ch¾c ch¾n tèi ®a MP Maximum Pasimony Ph−¬ng ph¸p chi li tèi ®a NJ Neighbor Joining Ph−¬ng ph¸p kÕ cËn liÒn kÒ NNKHC Primer PRNT Ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HI) §äan måi ADN Plaque Assay and Plaque Reduction Neutralization tests. Kü thuËt trung hoµ vµ Kü thuËt Trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö PCR Polymerase Chain Reaction Ph¶n øng chuçi Polymeraza RT- PCR Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Ph¶n øng dao chÐp ng−îc khuÕch ®¹i chuçi SARS Severe Acute Respiratory Syndrome Héi chøng viªm ®−êng h« hÊp cÊp tÝnh SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona virus Virus Corona g©y bÖnh SARS SD SXHD TCYTTG VVSDTTW VCNSH WHO Sèt Dengue Sèt xuÊt huyÕt Dengue Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung ¦¬ng ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc World Health Organization (Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi) WB Western Blot Môc lôc Sè TT Néi dung Trang §Æt vÊn ®Ò 1 Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu A. Nghiªn cøu virus Dengue g©y nªn bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ë ViÖt Nam 1.1 BÖnh sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue 1.1.1 BiÓu hiÖn l©m sµng 1.1.2 T¸c nh©n truyÒn bÖnh 6 1.1.3 T×nh h×nh dÞch bÖnh trªn thÕ giíi 8 1.1.4 T×nh h×nh dÞch bÖnh ë ViÖt Nam 11 1.2 Virus Dengue 11 1.2.1 §Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ cÊu tróc 13 1.2.2 Genome cña virus 13 1.2.3 Chu tr×nh nh©n lªn vµ c¬ chÕ g©y bÖnh cña virus Dengue 15 1.2.4 §Æc ®iÓm kh¸ng nguyªn 17 1.2.4.1 Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ 18 1.2.4.2 Ph©n lËp virus 20 5 B. nghiªn cøu virus corona g©y bÖnh viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS ë ViÖt Nam 1.1 T×nh h×nh nghiªn cøu trªn thÕ giíi 26 1.2 C¸c nghiªn cøu t¹i ViÖt nam 42 Ch−¬ng II §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu A. Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n nhanh bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue 2.1 §èi t−îng vµ vËt liÖu 2.1.1 §èi t−îng 2.1.2 VËt liÖu 2.1.3 Ho¸ chÊt 49 2.2 Trang thiÕt bÞ 54 2.3 Ph−¬ng ph¸p 55 44 C¸c ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn vµ Kh¸ng huyÕt thanh 2.3.1 S¶n xuÊt kh¸ng nguyªn 55 2.3.2 Ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng huyÕt thanh 58 2.3.3 Ph−¬ng ph¸p ELISA ph¸t hiÖn IgM 59 2.3.4 Kü thuËt trung hoµ (Neutralization Test - NT) 59 2.3.5 Ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch hÊp phô liªn kÕt men 60 ph¸t hiÖn KT IgG (GAC- ELISA) 2.4 C¸c ph−¬ng ph¸p ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh type virus 60 2.4.1 CÊy truyÒn trªn n·o chuét æ (1-3 ngµy tuæi) 60 2.4.2 Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus trªn tÕ bµo muçi 61 Aedes. albopictus dßng C6/36. 2.4.3 Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang trùc tiÕp 64 (Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA). 2.4.4 Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp 65 (Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay – IFA). 2.4.5 Kü thuËt Trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö 66 ( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT ) 2.4.6 Ph−¬ng ph¸p tæng hîp d©y chuyÒn chuçi nhê polymerase 68 (RT-PCR - Polymerase Chain Reaction) C. Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS 2.1 §èi t−îng nghiªn cøu 73 2.2 VËt liÖu 74 2.2.1 MÉu bÖnh phÈm 74 2.2.2 TÕ bµo 74 2.2.3 Sinh phÈm kh¸c 74 2.2.4 M«i tr−êng vµ ho¸ chÊt 75 2.2.5 Trang thiÕt bÞ vµ dông cô 76 2.3 Ph−¬ng ph¸p 78 2.3.1 Ph©n lËp virus SARS-CoV 78 2.3.2 T¹o plasmid t¸i tæ hîp. 78 2.3.3 BiÓu lé vµ tinh s¹ch kh¸ng nguyªn . 79 2.3.4 Ph−¬ng ph¸p hÊp phô miÔn dÞch liªn kÕt enzyme tãm b¾t 80 kh¸ng thÓ IgM (MAC- ELISA) 2.3.5 Ph−¬ng ph¸p Western Blot. 81 Ch−¬ng III KÕt qu¶ vµ Bµn luËn A. KÕt qu¶ s¶n xuÊt bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue. 3.1 Nu«i cÊy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus 82 Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) trªn tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36. 3.1.1 Nh©n virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus 82 Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) vµo tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36 ®Ó t¸ch chiÕt ARN. 3.1.2 Quan s¸t sù nh©n lªn cña virus Dengue trong tÕ bµo muçi Aedes 100 albopictus dßng C6/ 36 d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö 3.2 Nghiªn cøu qui tr×nh c«ng nghÖ biÓu hiÖn, t¸ch chiÕt, tinh chÕ kh¸ng 106 nguyªn Dengue t¸i tæ hîp c¸c type. 3.2.1 Kh¸ng nguyªn Dengue th« 106 3.2.2 Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp. 108 3.2.3 Quy tr×nh t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp cña virus dengue tõ chñng E. coli cho c¶ bèn typ virus dengue T¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®äan gen PreM vµ E cña 4 type virus 109 3.3 117 Dengue. 3.3.1 T¸ch RNA tæng sè cña tÕ bµo muçi C6/36 117 3.3.2 KhuÕch ®¹i ®o¹n gene PreM vµ E b»ng ph−¬ng ph¸p RT-PCR 118 3.3.3 BiÓu hiÖn kh¸ng nguyªn mµng vµ vá cña virus Dengue type 1, 2, 3, 4 148 trong hÖ nÊm men Pichia pastoris 3.3.4 BiÓu hiÖn gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn preM-E (gen preM-env) trong Pichia pastoris 163 3.3.5 KiÓm tra ph¶n øng cña kh¸ng nguyªn DxME t¸i tæ hîp víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù nhiªn b»ng Western Blot ThiÕt kÕ cÆp måi vµ x©y dùng kÕ häach t¸ch dßng gen m· hãa kh¸ng 167 3.4 168 nguyªn vá cña virus Dengue c¸c type I, II, III, IV. 3.5 ChÕ t¹o céng hîp (Gold monoclonal antibodies) g¾n kh¸ng nguyªn vµo 173 gi¸ thÓ (mµng thÊm Nitrocellulo membrane) 3.6 Nghiªn cøu dung dÞch ®Öm buffer tèi −u 179 dïng trong ph¶n øng 3.7 Hoµn thiÖn Bé sinh phÈm 183 3.8 3.8.1 Thö nghiÖm Bé sinh phÈm trong phßng thÝ nghiÖm Th−êng qui sö dông Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh sèt Dengue/ 198 200 sèt xuÊt huyÕt Dengue 3.8.2 So s¸nh kÕt qu¶ thö nghiÖm trong phßng thÝ nghiÖm 204 3.9 øng dông Bé sinh phÈm trong thùc ®Þa 210 3.9.1 KÕt qu¶ kiªm tra t¹i phßng thÝ nghiÖm Sèt xuÊt huyªt Arbovirus, ViÖn 210 VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng 3.9.2 Gi¸ thµnh vµ chÊt l−îng Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh sèt 211 Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue 3.9.3 Mét sè h×nh ¶nh khi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm t¹i c¸c ®iÓm nghiªn cøu 213 B. KÕt qu¶ s¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n nhanh bÖnh viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS) 3.1 Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp protein N - SARS-CoV 217 3.2 X¸c ®Þnh c¸c th«ng sè c¬ b¶n cho bé sinh phÈm MAC-ELISA chÈn 218 ®o¸n nhiÔm virus SARS-CoV 3.2.1 X¸c ®Þnh thêi gian sö dông tèi −u cña bé sinh phÈm. 219 3.2.2 X¸c ®Þnh ®é ®Æc hiÖu cña Bé sinh phÈm 220 3.2.3 X¸c ®Þnh ®é nh¹y cña sinh phÈm. 220 3.3 Thµnh phÇn bé sinh phÈm. 221 3.4 Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM trong huyÕt thanh bÖnh nh©n SARS vµ nh©n 221 viªn y tÕ cã tiÕp xóc trùc tiÕp víi bÖnh nh©n SARS. Bµn luËn 1 Mét ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n sím trong phßng thÝ nghiÖm cã hiÖu qu¶ 226 2 Trong giai ®o¹n ®Çu cña dÞch SARS, mét sè ph−¬ng ph¸p ELISA ®−îc 234 giíi thiÖu 3 Bé sinh phÈm MAC- ELISA ph¸t hiÖn sím nhiÔm virus SARS 236 4 Toµn bé bÖnh nh©n ®−îc x¸c ®Þnh nhiÔm virus SARS-CoV trªn l©m 239 sµng ®· ®−îc kh¼ng ®Þnh l¹i khi ph¸t hiÖn ®−îc kh¸ng thÓ IgM kh¸ng ®Æc hiÖu virus SARS –CoV th«ng qua ph−¬ng ph¸p MAC-ELISA. 5 Sù xuÊt hiÖn cña KT kh¸ng ®Æc hiÖu virus SARS-CoV trªn mét sè 239 ng−êi kh«ng cã biÓu hiÖn l©m sµng KÕt luËn 241 Tµi liÖu tham kh¶o 244 §Æt vÊn ®Ò Trong vßng 15 n¨m gÇn ®©y, nhiÒu dÞch bÖnh nguy hiÓm ë qui m« khu vùc còng nh− toµn cÇu ®· x¶y ra vµ lÇn ®Çu tiªn g©y ¶nh h−ëng lín ®Õn nÒn kinh tÕ thÕ giíi. TÊt c¶ c¸c bÖnh dÞch nguy hiÓm nµy (nh− dÞch h¹nh Ên §é vµo n¨m 1994, dÞch cóm gia cÇm t¹i Hång K«ng 1997, dÞch viªm n·o Nipah t¹i Malaysia, dÞch SARS hay héi chøng h« hÊp cÊp tÝnh ë Trung Quèc tõ n¨m 2002 ®Õn 2003, vµ cóm gia cÇm ë vïng §«ng Nam ¸ tõ n¨m 2003 ®Õn2007)… ®Òu cã mÇm bÖnh tõ ®éng vËt vµ ph¸t sinh t¹i ¸ Ch©u vµ dÇn dµ l©y lan lµm ¶nh h−ëng ®Õn nÒn kinh tÕ thÕ giíi. Víi tiÕn tr×nh toµn cÇu ho¸ hiÖn nay, chóng t«i thiÕt nghÜ trong t−¬ng lai sÏ x¶y ra nhiÒu dÞch bÖnh ë tÇm møc t−¬ng tù. H¬n n÷a, do c¸c yÕu tè x· héi, v¨n ho¸ vµ nh©n khÈu ë Ch©u ¸… cã lÏ vÉn lµ n¬i tiÕp tôc xuÊt hiÖn c¸c dÞch bÖnh b¾t nguån tõ ®éng vËt… ViÖc ph¸t hiÖn æ dÞch trong ch−¬ng tr×nh “chiÕn l−îc dù phßng sím” t¹i ¸ ch©u sÏ gióp chóng ta chñ ®éng ph¸t hiÖn vµ ng¨n chÆn kÞp thêi c¸c bÖnh dÞch ®· biÕt ®Õn còng nh− c¸c bÖnh dÞch míi ph¸t sinh. Trong c¸c bÖnh dÞch míi gÇn ®©y, næi lªn cã dÞch SD/ SXHD vµ Viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS.... Sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue (SD/ SXHD) lµ mét bÖnh nhiÔm trïng cÊp tÝnh do virus Dengue g©y ra. BÖnh kh«ng cã vacxin vµ thuèc ®iÒu trÞ. BiÓu hiÖn l©m sµng cña SD/ SXHD rÊt ®a d¹ng tõ sèt cao ®ét ngét kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm theo triÖu chøng ®au ®Çu, ®au c¬, ®au x−¬ng, ®au khíp, ®au bông cho tíi buån n«n, ph¸t ban... Sau ®ã cã thÓ cã biÓu hiÖn xuÊt huyÕt d−íi da, xuÊt huyÕt néi t¹ng (ch¶y m¸u cam, ch¶y m¸u lîi, n«n ra m¸u, ®i ngoµi ra m¸u...). Ngoµi ra cßn cã thÓ cã thªm c¸c dÊu hiÖu kh¸c nh− gan to, sèc, huyÕt ¸p h¹ vµ cã thÓ dÉn tíi tö vong (Barnes W. J. S. vµ Rosen L., 1974). BÖnh SD/ SXHD lµ bÖnh do muçi (Aedes aegypti, Aedes albopictus) [33] truyÒn v× vËy bÖnh th−êng dÔ dµng ph¸t triÓn thµnh dÞch. Virus Dengue ®−îc Sabin ph©n lËp ®Çu tiªn ë Calcuta, Ên 1 ®é, New-Guinea vµ Hawaii (Sabin A. vµ cs, 1952)... Sau nµy ®−îc x¸c ®Þnh lµ virus Dengue type 1-Hawaii vµ virus Dengue type 2-New-Guinea. C¸c type virus Dengue 3 vµ virus Dengue 4 ®−îc Hammon W.M. vµ cs ph©n lËp ë Philippines vµo n¨m 1956 (Hammon W.M. vµ cs 1960). TiÕp ®ã nhiÒu chñng virus Dengue ®· ®−îc ph©n lËp tõ nhiÒu vïng kh¸c nhau trªn thÕ giíi nh−ng ®Òu ®−îc x¸c ®Þnh lµ thuéc 4 type huyÕt thanh nªu trªn (Anonymous, 1986). Tíi n¨m 1997 bÖnh SD/ SXHD ®· lan réng trªn ph¹m vi toµn thÕ giíi. Theo Gubler, D.J. (1997) th× hiÖn nay cã tíi h¬n 2,5 tû ng−êi ®ang sèng trong khu vùc cã l−u hµnh SD/ SXHD vµ hµng n¨m cã kho¶ng 100 triÖu ng−êi m¾c bÖnh nµy. §Ó cã thÓ phßng chèng bÖnh mét c¸ch hiÖu qu¶ th× viÖc chñ ®éng gi¸m s¸t huyÕt thanh häc, dÞch tÔ häc, c«n trïng häc virus Dengue g©y nªn bÖnh sèt Dengue/sèt xuÊt huyÕt Dengue lµ hÕt søc cÇn thiÕt. C¸c ph−¬ng ph¸p chñ yÕu chÈn ®o¸n huyÕt thanh häc cña virus Dengue bao gåm: Ph¶n øng Ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HI), ph¶n øng kÕt hîp bæ thÓ (CF), ph¶n øng trung hßa gi¶m ®¸m ho¹i tö (PRNT), ph¶n øng miÔn dÞch hÊp phô g¾n enzym ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM (MAC-ELISA) vµ ph¶n øng miÔn dÞch hÊp phô g¾n enzym ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgG (GAC-ELISA), kü thuËt RT- PCR Ngoµi bÖnh SD/ SXHD, Héi chøng viªm ®−êng h« hÊp cÊp tÝnh nÆng (SARS) lµ mét bÖnh dÞch míi xuÊt hiÖn trªn ph¹m vi toµn cÇu. SARS ®· xuÊt hiÖn t¹i 23 Quèc gia: Trung Quèc, Hång K«ng, Singapore, Canada, Hoa Kú, ViÖt Nam, Malaysia, Th¸i Land… TÝnh ®Õn th¸ng 04 n¨m 2004 trªn toµn thÕ giíi ®· cã tæng sè m¾c/ tæng sè chÕt lµ: 3169/ 144 ng−êi (Theo Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíiWHO) [39]. T¸c nh©n g©y bÖnh SARS lµ mét biÕn thÓ hä Corona (Coronaviridae); Mét nhãm virus cã thÓ g©y bÖnh cho c¶ ng−êi vµ ®éng vËt [41]. Trªn ng−êi, Corona th−êng g©y ra viªm ®−êng h« hÊp trªn, chñ yÕu ng−êi tr−ëng thµnh. Ngoµi ra 2 còng cÇn chó ý tíi mét sè lo¹i vi khuÈn, virus c¬ héi th−êng xuyªn cã mÆt ë ®−êng h« hÊp cña ng−êi; Cã thÓ gãp phÇn g©y ra c¸c béi nhiÔm ®−êng h« hÊp d−íi vµ viªm phæi kh«ng ®iÓn h×nh trªn bÖnh nh©n SARS. Virus nµy cã søc ®Ò kh¸ng yÕu, tån t¹i víi ®éng lùc lín trong kh«ng khÝ m¸t l¹nh kho¶ng 2- 5 giê. Virus SARS nh¹y c¶m víi nhiÖt ®é cao, tia cùc tÝm, c¸c ho¸ chÊt khö trïng… Nguån bÖnh vµ æ chøa virus SARS: Ch−a biÕt râ rµng. Ng−êi cã thÓ lµ nguån bÖnh chÝnh trong chuçi m¾t xÝch l©y truyÒn Ng−êi- Ng−êi. Ng−êi bÖnh SARS, nhÊt lµ bÖnh nh©n nÆng ®ang trong giai ®o¹n khëi ph¸t vµ toµn ph¸t lµ nguån truyÒn nhiÔm nguy hiÓm. Theo qui luËt chung cña c¸c bÖnh do virus th× SARS cã thÓ th¶i mÇm bÖnh tõ 5 ®Õn 15 ngµy sau khëi ph¸t. Thêi gian ñ bÖnh trung b×nh 7 ngµy; Mét sè tr−êng hîp cã thÓ kÐo dµi tíi 14- 15 ngµy [32]. TriÖu chøng: H¾t h¬i, ch¶y n−íc mòi, ng¹t mòi, ho, ®au häng hoÆc khã thë…Cã thÓ dÉn ®Õn biÕn chøng nh−: NhiÔm khuÈn huyÕt, viªm mµng n·o do béi nhiÔm vi khuÈn… §Ó chÈn ®o¸n bÖnh nµy, ng−êi ta th−êng: Ph¸t hiÖn trùc tiÕp virus hoÆc kh¸ng nguyªn virus. Cã thÓ cã kÕt qu¶ trong vµi giê nÕu bÖnh phÈm lÊy tèt; Råi tiÕn hµnh c¸c kü thuËt: - MiÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp lµ ph−¬ng ph¸p nh¹y c¶m ®Ó ph¸t hiÖn virus trong mÉu bÖnh phÈm l©m sµng vµ nu«i cÊy tÕ bµo. Tû lÖ d−¬ng tÝnh lµ 30%. - C¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c: Ph¶n øng chuçi polymerase (PCR) dïng trong nghiªn cøu. Kü thuËt nµy kh¸ chÝnh x¸c nh−ng ®ßi hái c¸c trang bÞ kü thuËt ®¾t tiÒn còng nh− tay nghÒ cña c¸n bé kü thuËt ViÖc ph¸t hiÖn nhanh virus Dengue g©y bÖnh SD/ SXHD hay bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS sÏ gióp cho c¸c b¸c sü l©m sµng cã h−íng ®iÒu trÞ thÝch hîp vµ 3 c¸c nhµ DÞch tÔ häc ®−a ra c¸c gi¶i ph¸p h÷u hiÖu, lµm gi¶m tû lÖ m¾c vµ tû lÖ chÕt v× bÖnh nµy. Cã nhiÒu ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n hai bÖnh trªn trong phßng thÝ nghiÖm, tuy nhiªn ®Òu tu©n thñ nguyªn t¾c: - Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ (IgG, IgM) kh¸ng virus Dengue hay virus Corona trong huyÕt thanh bÖnh nh©n. - X¸c ®Þnh virus trong huyÕt thanh hoÆc trong c¸c tæ chøc cã kh¶ n¨ng nhiÔm virus. Dùa vµo c¸c ®iÒu kiÖn trªn mµ chóng t«i ®−a ra môc tiªu cña Ch−¬ng tr×nh nghiªn cøu nµy lµ: 1. X©y dùng ®−îc qui tr×nh kü thuËt chÈn ®o¸n nhanh vµ chÝnh x¸c sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS). 2. S¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÊt l−îng cao, dÔ sö dông cho viÖc chÈn ®o¸n bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS). 4 Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu A. Nghiªn cøu virus dengue g©y bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ë ViÖt Nam 1.1 BÖnh sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue 1.1.1. BiÓu hiÖn l©m sµng Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ®−îc chia thµnh nhiÒu cÊp ®é kh¸c nhau tuú theo møc ®é nÆng cña bÖnh mµ bÖnh nh©n cã nh÷ng biÓu hiÖn nh−: sèt cao tõ 38 0C ®Õn 40 0C, thêi gian kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm theo c¸c triÖu chøng ®au ®Çu, ®au c¬, buån n«n, ph¸t ban, cã thÓ kÌm theo rÐt tuy kh«ng thµnh c¬n, cho¸ng v¸ng, chãng mÆt, xuÊt huyÕt d−íi da, xuÊt huyÕt niªm m¹c, xuÊt huyÕt phñ t¹ng. ë thÓ nÆng bÖnh nh©n cã thÓ bÞ sèc hay cßn gäi lµ héi chøng sèc Dengue (HCSD). HCSD x¶y ra víi trÎ em nhiÒu h¬n ë ng−êi lín, phæ biÕn nhÊt vµo ngµy sèt thø 4 ®Õn thø 6, ë bÖnh nh©n nÆng cã dÊu hiÖu suy tuÇn hoµn, ®au bông, bån chån, vËt v·, nÕu kh«ng ®−îc can thiÖp sím bÖnh nh©n cã thÓ bÞ tö vong sau tõ 12 ®Õn 24 giê [8]. C¸c triÖu chøng cña bÖnh th−êng rÊt ®a d¹ng nh−ng l¹i kh«ng cã tÝnh chÊt ®Æc tr−ng. Do ®ã, kh«ng thÓ ph©n biÖt ®−îc sù kh¸c biÖt vÒ l©m sµng gi÷a c¸c bÖnh nh©n nhiÔm c¸c type virus Dengue kh¸c nhau. MÆt kh¸c, c¸c triÖu chøng nµy còng t−¬ng tù nh− c¸c triÖu chøng gÆp ph¶i khi bÞ nhiÔm c¸c lo¹i virus g©y bÖnh kh¸c nh− cóm, sëi, viªm n·o…. C¨n cø theo biÓu hiÖn l©m sµng cña bÖnh SD/ SXHD cã thÓ chia thµnh 3 cÊp ®é sau ®©y : + Sèt Dengue (SD): cßn gäi lµ sèt Dengue cæ ®iÓn, th−êng cã c¸c triÖu 5 chøng nh− c¸c bÖnh nhiÔm virus kh¸c lµ: sèt tõ 38 0 C- 40 0 C, ®au mái c¬ vµ c¸c khíp x−¬ng, ®au ®Çu vïng tr¸n vµ th¸i d−¬ng, rÊt Ýt gÆp m¶ng xuÊt huyÕt d−íi da, tØ lÖ tö vong thÊp (kho¶ng 0.018%) [21]. + Sèt xuÊt huyÕt Dengue: Sèt cÊp tÝnh cao, kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm theo nhøc ®Çu, ®au khíp, ®au c¬, xuÊt hiÖn m¶ng hoÆc chÊm xuÊt huyÕt d−íi da, niªm m¹c, xuÊt huyÕt néi t¹ng, h¹ sèt do xuÊt huyÕt nhiÒu, xuÊt hiÖn c¸c biÓu hiÖn nh− ch¶y m¸u mòi, ch¶y m¸u ch©n r¨ng ... nhiÒu vµ kÐo dµi [21] + Héi chøng sèc Dengue: cã c¸c biÓu hiÖn t−îng tù nh− SXHD nh−ng cßn kÌm theo hiÖn t−îng m¹ch ®Ëp nhanh, huyÕt ¸p tôt, da l¹nh vµ −ít. Khi sèc s©u, kÐo dµi cã thÓ dÉn tíi suy thËn cÊp, rèi lo¹n tiªu ho¸, ngõng tim, xuÊt huyÕt néi t¹ng vµ tö vong sau 12-24 giê [30]. ë ng−êi m¾c sèt Dengue th−êng thÊy c¸c ®Æc ®iÓm nh−: H¹ch lympho s−ng ®au toµn th©n, l−îng tiÓu cÇu Ýt gi¶m, gi·n m¹ch ngo¹i vi, b¹ch cÇu gi¶m, hematocrit t¨ng nhÑ. §èi víi tr−êng hîp m¾c SXHD th× cã thªm c¸c ®Æc ®iÓm kh¸c n÷a nh−: gan to, tiÓu cÇu gi¶m, hematocrit t¨ng h¬n 20% so víi b×nh th−êng, cã biÓu hiÖn vµng da, xuÊt huyÕt phñ t¹ng hÖ tiªu ho¸ vµ ngoµi tiªu ho¸ nh− n·o, mµng n·o ... nÆng cã thÓ chuyÓn sang c¸c giai ®o¹n kh¸c nghiªm träng h¬n nh− SXHD thÓ n·o (héi chøng n·o cÊp), SXHD thÓ suy gan cÊp .... 1.1.2 T¸c nh©n truyÒn bÖnh BÖnh SD vµ SXHD l©y qua ®−êng m¸u. C¸c nghiªn cøu vÒ trung gian truyÒn bÖnh ®· x¸c ®Þnh muçi v»n Aedes aegypti (A.aegypti) lµ vector chñ yÕu, ngoµi ra c¸c lo¹i muçi kh¸c nh− Aedes albopictus, Aedes polynesiens còng cã thÓ truyÒn bÖnh SXHD. Muçi A.aegypti lµ lo¹i muçi sèng ë trong nhµ hoÆc xung quanh nhµ. ChØ cã muçi c¸i ®èt ng−êi vµo ban ngµy, chñ yÕu vµo s¸ng sím vµ chiÒu tèi [35]. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn bÖnh sau thêi kú ñ bÖnh 3 ®Õn 10 ngµy hoÆc cã thÓ truyÒn bÖnh ngay nÕu ®ang hót m¸u bÖnh nh©n dë dang råi ®èt sang ng−êi kh¸c. N¬i ®Ëu cña muçi lµ nh÷ng chç tèi t¨m trong nhµ nh−: hèc tñ, gÇm gi−êng, gÇm 6 bµn, chç treo quÇn ¸o, ch¨n mµn (80.5%) vµ nh÷ng vËt dông kh¸c. Mét ®iÓm ®¸ng l−u ý lµ muçi A.aegypti cã kh¶ n¨ng truyÒn virus Dengue qua l¨ng qu¨ng, nghÜa lµ virus Dengue cã chu kú xuyªn qua trøng. §©y còng lµ mét yÕu tè quan träng trong c«ng t¸c phßng chèng bÖnh, diÖt muçi tr−ëng thµnh ph¶i ®i ®«i víi diÖt l¨ng qu¨ng trong c¸c vËt chøa n−íc. §iÒu nµy chÝnh lµ c¬ së cña ph−¬ng ph¸p qu¶n lý muçi dùa vµ céng ®ång. Vßng ®êi cña muçi A.aegypti ®−îc thÓ hiÖn ë H×nh 1.1. H×nh 1.1. Vßng ®êi cña Muçi Sau khi bÞ nhiÔm virus, muçi sÏ bÞ nhiÔm suèt ®êi. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn virus Dengue cho trøng vµ trøng l¹i cã kh¶ n¨ng tån t¹i rÊt l©u trong ®iÒu kiÖn kh« h¹n (cã thÓ trªn 1 n¨m) [24], ®©y lµ mét yÕu tè khã kh¨n cho viÖc diÖt muçi. Muçi sinh s¶n vµo mïa m−a, ë nh÷ng n¬i chøa n−íc nh©n t¹o (vòng n−íc ®äng, chum, v¹i ...v.v). Thêi gian virus nh©n lªn trong h¹ch n−íc bät muçi lµ tõ 3 – 10 ngµy tuú theo nhiÖt ®é m«i tr−êng. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn däc virus Dengue sang thÕ hÖ sau tuy nhiªn ®−êng truyÒn däc nµy kh«ng cã vai trß lín trong c¬ chÕ l©y truyÒn Dengue sang ng−êi, ng−êi vÉn lµ vËt chñ chÝnh nh©n virus Dengue. 1.1.3 T×nh h×nh dÞch bÖnh trªn thÕ giíi Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue lµ bÖnh nhiÔm virus cÊp tÝnh ®ang lan trµn réng trªn thÕ giíi... BÖnh th«ng th−êng lµ nhÑ (sèt Dengue - SD) nh−ng cã thÓ 7 nÆng nÕu cã xuÊt huyÕt (Sèt xuÊt huyÕt Dengue- SXHD). BÖnh hay bïng næ thµnh dÞch lín ë nh÷ng vïng ch−a tõng bÞ nhiÔm virus Dengue vµ cã ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho sù ph¸t triÓn lan trµn cña vect¬ truyÒn bÖnh. DÞch Sèt Dengue lÇn ®Çu tiªn ®−îc Y v¨n ghi nhËn lµ vµo mïa hÌ n¨m 1780 t¹i Philadenphia, Hoa Kú. Sau ®ã bÖnh ®−îc thÊy ë nhiÒu n−íc nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi... T¹i ch©u A, n¨m 1953, SXHD xuÊt hiÖn lÇn ®Çu tiªn ë Manila (philipin). Råi Th¸i Lan, Indonexia, Singapore, India, Banglades... ë vïng T©y Th¸i B×nh D−¬ng, cã tõ 28 ®Õn 35 n−íc ®· tr¶i qua c¸c vô dÞch SD/ SXHD. Sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue ®· ®−îc c¸c n−íc trªn thÕ giíi c«ng nhËn lµ mét vÊn ®Ò Y tÕ c«ng céng quan träng [34]. T¹i ViÖt Nam, SXHD ®−îc ph¸t hiÖn lÇn ®Çu tiªn ë miÒn B¾c vµo n¨m 1958; Cßn miÒn Nam lµ n¨m 1960. Sau ®ã dÞch lan réng tíi hÇu hÕt c¸c tØnh trong c¶ n−íc...Nh÷ng n¨m cã dÞch lín lµ: 1969,1977,1978,1979,1980,1983,1987,1991, 1994, 1998. HiÖn nay bÖnh SD/ SXHD kh«ng chØ l−u hµnh ë thµnh thÞ, khu vùc ®«ng d©n c− mµ cßn lan trµn c¶ c¸c vïng n«ng th«n ®ång b»ng, trung du vµ miÒn nói [26]. Theo thèng kª cu¶ TCYTTG th× ë ViÖt Nam tõ n¨m 1963 ®Õn n¨m 1988 cã sè bÖnh nh©n m¾c trªn sè bÖnh nh©n chÕt vÒ SD/ SXHD lµ 1.111.734/ 10.415; ®©y lµ sè l−îng bÖnh nh©n m¾c vµ chÕt lín nhÊt so víi c¸c n−íc trong khu vùc §«ng Nam A vµ T©y Th¸i B×nh D−¬ng, tÝnh trung b×nh hµng n¨m cã 50.000 - 100.000 ng−êi m¾c SD/ SXHD. BÖnh c¶nh l©m sµng cña sèt Dengue kÌm theo xuÊt huyÕt ®−îc Hamon vµ CS m« t¶ n¨m 1953 ë Manila (Philippine). §Õn n¨m 1956, còng t¹i Manila, virus Dengue ®· ®−îc Sabin ph©n lËp tõ m¸u bÖnh nh©n vµ muçi. Tõ n¨m 1979 ®Õn n¨m 1980 dÞch lan sang vïng nam Th¸i B×nh D−¬ng, B¾c Qeensland (Australia)... 8 ë ch©u Mü, sau vô dÞch ®Çu tiªn t¹i Philadenphia n¨m 1780 th× m·i ®Õn n¨m 1826-1828, ng−êi ta l¹i ghi nhËn cã nh÷ng trËn dÞch t−¬ng tù x¶y ra t¹i vïng biÓn Caribe (Nam Mü). Trong thËp kû tõ 1950 ®Õn 1960, t¹i vïng nµy cã nh÷ng chiÕn dÞch lín nh»m lo¹i trõ muçi truyÒn bÖnh ®· ®−îc tiÕn hµnh ë Mexico, Panama... Nh−ng sau ®ã muçi l¹i xuÊt hiÖn ë hÇu hÕt c¸c n−íc trong vïng. Tõ ®ã tÇn sè c¸c vô dÞch SXHD l¹i t¨ng lªn víi ®Çy ®ñ c¶ 4 type virus Dengue. Trong 15 n¨m gÇn ®©y do sù giao l−u thuËn tiÖn nªn chØ tõ th¸ng 1 ®Õn th¸ng 10/1995 ®· cã 200.000 bÖnh nh©n sèt Dengue vµ 5.500 bÖnh nh©n sèt xuÊt huyÕt Dengue ®−îc b¸o c¸o tõ c¸c n−íc: Brazin, Hondurat, Nicaragoa, Venezuela. Nh×n vµo H×nh 1.2. B¶n ®å dÞch tÔ vÒ t×nh h×nh m¾c SD/ SXHD trªn thÕ giíi cã thÓ nhËn thÊy r»ng dÞch SD/SXHD cã xu h−íng lan réng kh«ng nh÷ng trong mçi n−íc mµ cßn ra nhiÒu n−íc kh¸c; N¨m 1970- 1980 SD/ SXHD lan ra c¸c n−íc trong khu vùv §«ng Nam A; TiÕp theo 1980- 1997, dÞch SD/ SXHD lan sang ¢n §é….Tõ ®ã hµng n¨m cã sù gia t¨ng sè n−íc b¸o cã dÞch vµ sè tr−êng hîp m¾c bÖnh. Råi tiÕp ®Õn c¸c n−íc vïng T©y Th¸i B×nh D−¬ng vµ Trung Mü ®ang lµ vïng ho¹t ®éng m¹nh cña virus Dengue g©y nªn bÖnh SD/ SXHD. Theo thèng kª cña WHO tõ n¨m 1995 ®Õn nay, mçi n¨m cã kho¶ng 50 triÖu ng−êi bÞ nhiÔm virus Dengue víi kho¶ng 500.000 tr−êng hîp ph¶i nhËp viÖn do m¾c SXHD, trong ®ã cã kho¶ng 12.000 tr−êng hîp tö vong hoÆc cao h¬n n÷a nÕu nh− bÖnh nh©n kh«ng ®−îc chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ kÞp thêi. §Æc biÖt vµo nh÷ng th¸ng ®Çu n¨m 2004, t¹i In®«nªxia dÞch SD/SXHD ®· bïng ph¸t m¹nh víi tæng sè tr−êng hîp bÞ nhiÔm h¬n 80.000, sè tö vong lµ h¬n 1000 tr−êng hîp [17]. 9 H×nh 1.2. B¶n ®å dÞch tÔ vÒ t×nh h×nh m¾c SD/ SXHD trªn thÕ giíi Nh×n vµo H×nh 1.3, ta thÊy bÖnh SD/ SXHD hiÖn ®ang l−u hµnh t¹i vïng Trung, Nam Mü vµ vïng §«ng Nam A. H×nh 1.3. Vïng l−u hµnh bÖnh SD/ SXHD hiÖn nay 10 BÖnh SD/ SXHD hiÖn ®ang ®e däa tÝnh m¹ng vµ søc kháe têi hµng tû ng−êi n»m trong khu vùc nhiÖt ®íi, A nhiÖt ®íi [14]. 1.1.4 T×nh h×nh dÞch bÖnh ë ViÖt Nam ë ViÖt Nam, tõ n¨m 1913, Gaide ®· th«ng b¸o vÒ bÖnh Dengue cæ ®iÓn ë miÒn B¾c vµ miÒn Trung. N¨m 1929, Boye cã viÕt vÒ mét vô dÞch Dengue cæ ®iÓn x¶y ra ë miÒn Nam ViÖt nam vµo n¨m 1927. MiÒn B¾c ViÖt Nam, vô dÞch SXHD ®©u tiªn ®−îc Mirosky. J, F. Vymola, Hoang Thuc Thuy ghi nhËn vµo mïa hÌ n¨m 1958 [19]. NhiÒu t¸c gi¶ ®· m« t¶ c¸c ®Æc ®iÓm l©m sµng cña 68 bÖnh nh©n n»m viÖn gièng hÖt nh− c¸c nÐt l©m sµng cña nh÷ng tr−êng hîp m¾c SXHD ë c¸c n−íc kh¸c trong vïng ®· ®−îc x¸c minh vÒ mÆt virus häc. TiÕp ®ã, n¨m 1969, ®· cã dÞch lín x¶y ra ë 19 tØnh, thµnh phè miÒn B¾c [23]. Theo Tr−¬ng Uyªn Ninh vµ CS [27]: N¨m 1976 cã 11 tØnh th× ®Õn 1987 lªn ®Õn 17 tØnh thµnh miÒn B¾c cã SD/ SXHD. MiÒn Nam ViÖt Nam, dÞch SXHD ®−îc m« t¶ ®Çu tiªn vµo n¨m 1960 víi 60 bÖnh nh©n tö vong. TiÕp theo, tõ th¸ng 6 ®Õn th¸ng 10 n¨m 1963, cã 331 bÖnh nh©n nhËp ViÖn vµ tö vong 116 tr−êng hîp do virus Dengue type 2 ®· ®−îc Halstead ghi nhËn. Sau ®ã, liªn tôc n¨m nµo còng cã bÖnh nh©n th−êng x¶y ra hµng n¨m ë c¸c tØnh, thµnh phè ®«ng ng−êi, miÒn ®ång b»ng ch©u thæ vµ c¸c vïng ven biÓn. BÖnh ®· lan réng ®Õn c¸c thÞ x·, thÞ trÊn, huyÖn lþ miÒn nói, trªn c¸c trôc ®−êng giao th«ng chÝnh liªn tØnh. Sè m¾c trung b×nh hµng n¨m tõ 50.000 - 100.000 ng−êi. Trong giai ®o¹n 1980-1989, SD/ SXHD cã tû lÖ chÕt ®øng ®Çu: 0,84/100.000 d©n. Tõ 1985-1989 tû lÖ m¾c cao thø ba trong c¸c bÖnh truyÒn nhiÔm: 201,5/ 100.000 d©n, sau héi chøng cóm vµ Øa ch¶y [9]. Theo Lª Hång Hinh vµ CS [10] th× SD/ SXHD lµ mét trong 10 bÖnh truyÒn nhiÔm cã tû lÖ m¾c vµ chÕt cao nhÊt ë ViÖt Nam (1994). 11 1.2. ViruS Dengue M E Lipids từ vật chủ Capsid Hệ gen ssRNA ~ 11 kb Sợi ARN đơn chứa khoảng 11,000 bazơ CAP 5’ N.C.R ~ 100 nt C prM Vùng cấu trúc E Vùng không cấu trúc NS NS 2a 2b Enzymes liên quan đến quá trình dịch mã 4a 4b N.R. 650 3 NS : NS2B/NS3 serine protease complexe : Furin-like Golgi protease : ER signalases H×nh 1.4. H×nh th¸i cÊu tróc cña virus Dengue Vïng NS1..NS5: Khu vùc cã cÊu tróc gièng c¸c virus thuéc hä Flaviviridae (ChiÕm >50% sè l−îng nucleotid trong chuçi ARN) Vïng C-prM-E: Khu vùc cã cÊu tróc riªng biÖt (Khu vùc më) 1.2.1 §Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ cÊu tróc Virus Dengue thuéc hä Flaviridae, gièng Flavivirus bao gåm 4 type huyÕt thanh lµ Dengue1, Dengue2, Dengue3, Dengue4. Virus Dengue h×nh khèi cÇu cã ®−êng kÝnh kho¶ng 40-50 nm, chøa mét sîi ARN ®¬n-d−¬ng (kho¶ng 10200 nucleotide). Còng nh− c¸c Flavivirus kh¸c virus Dengue cã mét líp vá 12