Tài liệu Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme protease từ b.subtilis s5

D~I HOC Quac GIA TP. HO CHi MINH TRUONG D~I HOC KHOAHOC TV NHIEN -- ------------------- YO NGOC B{n NGHIEN CUU QUA TRINH THUY PHAN PROTEIN CA BANG ENZYME PROTEASE TU B.5UBTILI5 55 Chuyen nganh: Hml sinh Mil s6: 1.05.10 TOM TAT LU!N AN TIEN si SINH HOC THANHPHO HO CHI MINH - 2004 Cong tr'inh du(jc hoan thanh t~i: Tntong D<;tihQc Khoa hQc Tif nhien TP. H6 Chi Minh va Truong D<;tihQc Thuy san Nha Trang. NguOi huang daD khoa hQc: 1. PGS.TS. D6ng Thi Thanh Thu Truong TP.HCM Dc~lihQc Khoa hQc Tif nhien, D<;ti hQc Qu6c gla 2. PGS. TS. Tr~n Thi Luye'n Truong D<;tihQc ThUy san Nha Trang. Philo bi~n 1: GS.TSKH. Nguy~n Van Thoa Philo bi~n 2: GS.TSKH. Nguy~n TrQngC~n Philo bi~n 3: PGS.TSKH. Ngo Ke'Sudng Lu~n an dii du<;1cbao v~ truoc HQi d6ng cha'm lu~n an ca'p Nha nuoc hQp t<;tiTruong D<;ti hQc Khoa hQc Tif nhien - D<;ti hQc Qu6c gia TP. H6 Chi Minh Vao h6i 9 gio 00 ngay 15 thang 10 Dam 2004 Co th~ HIDhi~u luij.n an t~i: Thu vi~n Truong D<;tihQc Khoa hQc Tif nhien ho<\icthu vi~n Khoa hQcT6ng h<;1p TP.HCM. - DHQG TP.HCM 1 Md DAU 1. Ti'nh dIp thie't ciia lu~n an Protease 1a mt)t nh6m enzyme du<;lcling d\mg trong nhi~u lInh vtfc nhu: Nong nghi~p, cong ngM Thtfc phffm...Trong thai gian gh day mt)t s6 nha khoa hQcdii tie'n hanh nghien CUusit d\mg protease trong che' bie'n Thuy san. Nhung, cac cong trlnh nghien cUu sit d\mg protease trong lInh vtfc nay chua dffy du va v§:ndn du<;lctie'p t\1Cnghien CUu.Bay la lInh vtfc con mai me nhUng co ra't nhi~u tri~n vQngd nuac ta. Nguai ta co th~ thu nMn protease tit nhi~u ngu6n khac nhau nhu tit thtfc v~t, tit nt)i tl:lngdt)ng v~t hay tit vi sinh v~t. Trong do ngu6n protease tit vi sinh v~t nha't la tit vi khuffn Bacillus subtilis la huang nghien cUuco nhi~u tri~n vQng vi B.subtilis co kha nang san xua't protease co hol:lttinh cao va co nhi~u u'u the' hon hh. Trong che' bie'n ThUy san, protease co th~ du<;lcsit d\1ng trong cong ngM san xua't nuac mAmd~ rut ngAnthai gian che' bie'n ho~c sit d\1ngd~ san xua't bt)t dl:lmthuy phan tit ca tl:lp.Ca tl:lPla lol:lica kern gia tri kinh te', tinh rieng tI:liKhanh Hoa, theo s6 li~u th6ng ke cua sd ThUy san, san lu<;lngkhai thac ca m6i (mt)t lol:li ca tl:lp) chie'm 20% - 25% t6ng san lU<;lng khai thac. Ca m6i co co thit khOng san chAcnen gia tri kinh te'tha'p, trong chuang trinh "chi biin cac san phdm co gia tri gia tang" cua Bt) ThUy san co huang nghien cUu sit d\1ngh<;lp19cac ngu6n ca tl:lp.Mt)t trong cac huang "chi biin cac san phllm co gia tri gia tang" tit ca m6i do la sit d\1ng ca m6i d~ san xua't bt)t dl:lmthuy phan. Vi v~y, d~ tai "Nghien CIlu qua trlnh thuy phtin protein ca bling enzyme protease ta B.subtilis S5" la cffn thie't trong lInh vtfc che' bie'n ThUy san. 2. Ml}c dich ciia lu~n an Tham do cac di~u ki~n thich h<;lpd~ khai thac va thu nMn protease tit canh tru'ang nuoi ca'y vi khuffn B.subtilis S5. Sau do sit d\1ngprotease nay trong san xua't bt)t dl:lmthUyphan tit thit ca m6i thuang (Saurida tumbil) va thit nghi~m san xua't nuac mAm tit ca com thuang (Stolephorus commersonii). 2 3. D6i tu(jng va ph~m vi nghien CUll 3.1. D6i tu(jng nghien CUll B.subtilis 55 la chUng vi khu~n co kha nang san xua't protease voi ho1;tt tinh cao dua"'m.San 37 gio nuoi, tho canh tru'ong chua enzyme va xae dinh ho<.1t de>protease. Ke't qua th~ hi~n d bang 3.1. Bang 3.1. Anh hudng cua phuong phap giii' ~m toi ho~t dQ protease B.subtilis 55 tho duQ'ctrong canh truong Phu'ong phap Ho<.1tde>protease giG' a"'m Tr<.1ngthai eoa eanh tru'ong (UI/g canh tru'ong) 1 20,2 B~ m~t eanh tru'ong bi thO, nUt, vi khua"'nmQe trAng phia du'di con d phia tren thl thong mQc. 2 21,1 Tu'ong tl! nhu' tren 3 28,2 I I B~ m~t canh tru'ong thOng bi thO, kh6i canh tru'ong nong, a"'m,m~m, vi khua"'n mQc trAng cii tren va du'di. Ttt ke't qua bang 3.1 cho tha'y phu'ong phap phO vai a"'mtren b~ m~t canh tru'ong nuoi va phon a"'mla phu'ong phap thich hQp nh~m giG'a"'mcho canh tru'ong nuoi B.subtilis 55 d~ san xua't protease. 8 3.1.2. Xac dinh kha Dang san xua't protease cua B.subtilis 55 trong di~u ki~n co thong gio va khOng thong gio Tie'n hflOh san xua't protease tif B.subtilis S5 theo 2 phlidng phap: phlidng phap 1: nuoi ca'y trong di~u ki~n khOng thong gio va phlidng phap 2: nuoi cffy trong di~u ki~n co thOng gio. Sau 37 gio, tho canh trliong chua enzyme va xac dinh ho<:ltdQprotease. Ke't qua th~ hi~n d bang 3.2. Bang 3.2. Anh hlfdng cua thong gio tOi ho~t dQ protease tho dlf(jc Phlfdng phap Hot dQprotease Trng thai canh trlfong (UI/g canh trUong) 1 19,3 Nhit dQcanh trlfong nuoi co th6 leu de'n 55°C, vi khuffn phat tri6n kern, canh trlfong roi rc. 2 28,6 Nhit dQ canh trlfong nuoi t6i da leu Wi 45°C, vi khuffn rnQc triing d. teen va dlfdi, canh trlfong cleo dinh. Ke't qua nghien cUud bang 3.2 cho thffy phlidng phap nuoi ca'y ban dn co thong gio la thich h<;fpcho vi~c san xufft protease tit B.subtilis S5. 3.1.3. Xac dinh thai gian ke't thuc qua trinh nuoi B.subtilis 55 Tie'n hanh san xufft protease tit B.subtilis S5 theo cac di~u ki~n da chQn, sau 17; 21; 25;... 53 gio, tho canh trUong nuoi, sffy kho va xac dinh ho<:ltdQenzyme. Ke't qua th~ hi~n d bang 3.3. Bang 3.3. Anh hlfdng cua thai gian de'n ho~t dQ protease tho dlf(jc Th<'1igian 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 5,0 8,0 12,5 17,5 23,5 31,5 33,2 33,1 32,0 29,5 (gi<'1) Hot d(> protease (DUg) Ke't qua nghien cUu cho tha'y co th~ difng qua trlnh nuoi d thai di~m 41 gio d~ co th~ tho dli<;fccanh trUong co ho<:ltdQprotease cao. 3.1.4. D~ xua't quy trinh san xua't protease tit B.subtilis 85 Tif cac ke't qua nghien cUu d teen d~ xufft quy trlnh nuoi ban din san xufft protease tif B.subtilis S5 nhli sau: 9 Nuoc 80% so voi nguyen lieu BOt blip + kh6 d~u I,!c + cam Khming bon h(ip gaD Giang B.subtilis 55 E>anhwi 1 ffinh 3.1. Sd d6 quy trlnh san xua't protease tt'i B.subtilis 85 * Thuye"t minh quy trlnh + Nhan gi6ng B.subtilis 85: gi6ng B.subtilis 85 phan l~p tu tt! nhien va du'<;1e baa quan (j 5°C tren moi tru'ong giG'gi6ng co thanh ph~n: agar: 2%, eao thit: 0,5%, peptone: 0,5%, NaCl: 0,25%. Chuy~n gi6ng B.subtilis S5 vao moi tru'ong ho<;ttboa co thanh phh: agar: 2%, eao thit: 0,5%, peptone: 0,5%, NaCl: 0,25%, tinh bQt: 1% va nu'de ehie't gia d~u xanh (200glHt). Sau khi ho<;ttboa 48 gio, c1y gi6ng 10 sang m6i tnlong nhiln gi6ng e6 thanh phftn: djeh ehie't earn: 20%, djeh thuy philo kh6 dftu I~e: 10%, NaCl: 0,36%, MgSO4: 0,05%, CaCO3: 0,6%, pH = 7. Truac khi effy gi6ng, hffp va khi't trung m6i truong nhiln gi6ng b~ng hdi nude bao hoa (j ap sufft latm trong thai gian 30 phut. Qua tdnh nhiln gi6ng tie'n hanh tren may Hie vdi t6e dQ 200 vong/phut, sau 24 gio ki€m ITagi6ng b~ng each Iffy gi6ng dang Hie effy tren m6i truong ho~t hoa sau 24 gio thffy gi6ng mQe t6t, d~u kh6ng e6 khuffn l~e I~ Ia du<;le. Sau khi nhan gi6ng Iy tam tho B.subtilis 55 dung d€ san xufft enzyme. + San xua't protease tit' B.subtilis SS M6i truong nu6i B.subtilis 55 san xufft protease (152,19kg/me) e6 thanh phftn nhu sau: bQt belp xay mill: 70kg, earn g~o: 30kg, kh6 dh l~e = 7. pH = 7, (45% protein): 50kg, NaCl: 540g, CaCO3: 900g, DAP: 750g, pH Khoang DAP pha trong 80% nude so vdi nguyen li~u, di~u ehinh trQnvdi nguyen li~u sau d6 hffp (j 100°C trang 2gio, lam nguQi de'n nhi~t dQ 37°C va effy gi6ng theo ty l~ 5% so vdi nguyen li~u, sau d6 philn d~u ra cae khay m6i khay 12kg. Trong qua trlnh san xufft b~ m~t cae khay nu6i du<;lephil vai ffm va sau 4 gio nu6i belt dfiu phon hdi nude d€ t~o dQ ffm eho phong nu6i vao khoang 90+100%. Nu6i trong di~u ki~n e6 th6ng gi6 vdi m\le dich d€ du<3iCO2, giai nhi~t va eung effp oxy eho vi khuffn. Sau 41 gi<'1nu6i (j nhi~t dQ phong tho eanh tru'<'1ng ehua enzyme, sffy kh6 (j nhi~t dQ50°C, xay mill va d6ng vao trong cae tui PE d€ baa qUaD. 3.2. Nghien cUu tach chie't va mQt s6 d~c tinh cua protease 3.2.1. Xac djnh dung djch chie't rut protease tit' B.subtilis SS Protease B.subtilis 55 du<;leehie't rut ra kh6i bQt eanh truong ehua enzyme bhg cae dung djeh: nude efft, dung dieh d~m Britton pH 6, dung dieh d~m phosphat pH 6 va dung dieh mu6i sinh 1:9.Sau khi ehie't rut ly tam tho djeh ehie't (DC) enzyme va xae dinh ho~t dQ protease, ke't qua th€ hi~n (j hinh 3.2. 11 ~ 120 100 %.3 '0 .';:;' ;:, " ~." 90 :0 '=' ~. " 60 :-0. <6 ;:". ~ 30 ~ 0 ::r: 0 . Nudc dlt . f)~m britton GI f)~m phosphat GI Mu6i sinh 19 I Dung djch chi"t enzyme Hinh 3.2. AOOhuang ena dung dieh ehie't rut de'n ho~t dQ protease Tli ke't qua hlnh 3.2 cho tha'y nudc ca't chinh la dung moi thich hQp cho vi~c chie't rut protease tli B.subtilis S5. 3.2.2. Xae djnh tae nhdn ke't tna protease B.subtilis SS Tie'n hanh ke't tua protease B.subtilis S5 ra khai DC enzyme b~ng aceton, ethanol va sulphat amon d cling n6ng de>70%. Sau do ly tam thu che' ph£m enzyme (CPE), boa tan trong cling me>tth~ tich nudc ca't va xac dinh ho~t de>protease. Ke't qua nghien cUuth~ hi~n d hlnh 3.3. 100 '0 '" :::;". 120 gp~1O0 99.9 . 98 II Sulphat amon :0 B' :a .- 80 :g'~ 60 ~ 0 40 ~. ~ Ethanol GIAceton 20 0 Tac nhan k"t IDa Hinh 3.3. AOOhuang ena tae nhdn ke't tna tOi ho~t dQ protease CPE Tli hlnh 3.3 cho tha'y ethanol chinh la tac nhan thich hQp cho vi~c ke't tua d~ thu protease CPE. E>~chQn duQc n6ng de>tac nhan ke't tua thich hQp tie'n hanh ke't tua protease B.subtilis S5 bhg ethanol d cac n6ng de>khac nhau: 60%, 65%,..., 80% ke't qua duQCth~ hi~n d hlnh 3.4. 120 100 ~ 99,89 93,1 ~ ~ ' 50 ~ ~. 0 ~. 0 j x 0 . . 30 35 Ii . 40 g g 0 45 50 55 . -DC . . t'-~ . . . 60 65 70 -0- CPE 75 Nhi~t dQ Hinh 3.6. Anh hu'dng cua nhi~t dQ de'n ho~t dQ protease B.subtilis SS Tit hinh 3.6 cho tha'y ca protease DC va CPE d€u co nhi~t dOtmch hQp la 55°C. 3.2.4.2. Xac dinh dQ b~n nhi~t cua protease B.subtilis SS Xii' 19 nhi~t protease DC va CPE a cac nhi~t dO 60°C va 65°C trong cac khoang thC1igian 0; 5; 10;...;35 phUt. 5au do nhanh chong lam l<.tnhva xac dinh ho<.ttdOprotease. Ke't qua th~ hi~n a hinh 3.7. 13 :g;g ",,'0 150 .§~IOO '=: .D :;;.;s '0 > ... 5; 50 0 o. ~ :r:~ ~ - 0 I --0 .0 5 10 -=t .t 15 20 -0- CPE60 DC60 .0. '9' 25 Thai - .0~ . -0 $ 30 35 gian xii' 19 (pMt) DC65 -- CPE65 I IDnh 3.7. DQ b~n nhi~t cua protease B.subtilis S5 Ke't qua hlnh 3.7 cho tha'y protease B.subtilis 55 kern b~n voi nhi~t so voi cac protease tu tht!c v~t va b~n hdn protease tu na'm m6c. 3.2.5. Aoo hudng cua n6ng dQmu6i an t8i ho~t dQprotease Ke't qua nghien CUllanh hudng cua NaCl toi hol;ltdQ protease CPE duejc th~ hi~n d hlnh 3.8. ~ 150 :g ,~ g,o~ 100 "0 '" J:! :<:. :g- ~ 50 ~ '" 0'" o. 0 :r: 0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 N6ng dONaCI (%) IDnh 3.8. Anh hudng cua n6ng dQ NaCl t8i ho~t dQ protease CPE Ke't qua th~ hi~n d hlnh 3.8 cho tha'y cang tang n6ng dQ mu6i an b6 sung vao phiin ung enzyme hol;lt dQ protease B.subtilis 55 cang giam. Nhu' v~y d~ co th~ sa dl;mgmQt cach co hi~u qua protease B.subtilis 55 trong che' bie'n thuy san nen sa dl;mgtrong cac di~u ki~n cang co it mu6i an cang t6t ho~c ne'u phiii b6 sung them mu6i an vao h6n hejp thuy phan co protease B.subtilis 55 thl nen cho mu6i nhi~u l~n. 3.2.6. Anh hudng cua cae ion kim lo~i hoa trf 2 va mQt so' cha't d~c hi~u OOomtm ho~t dQ protease B.subtilis S5 Tie'n hanh nghien CUllanh hu'dng cua cac ion kim 10l;liboa tri 2 va mQt s6 cha't d~c hi~u nh6m thu'ong co vai tro quan trQng d6i voi hol;lt dQ protease. Ke't qua du'ejCth~ hi~n d hlnh 3.9. 14 ~ :g 01) ,' ",-<"'i ~:;: '1' Ot\."-$' 0"- i}~ Cha't them vao ptian ti'ng Ifmh 3.9. Anh hu'dng cua ion kim lo~i va mQt s6 cha't ~c hi~u nhom de'n ho~t dQ protease B.subtilis 85 Tu hlnh 3.9 cho tha'y ta't ca cac cha't them vao phan ftng (trir 2Mercaptoethanol va L-cystein) d~u lam giam ho;:ttd(>protease CPE va DC. Cac ion Cuz+,Pbz+,Hgz+,HzOzva EDTA lam giam m;:tnhho;:ttd(>cua protease CPE va mftc d(>lam giam nhi~u hdn so vdi protease Dc. Trong khi do 2-Mercaptoethanol va L-cystein l;:ti lam tang r5 r~t ho;:tt d(> protease CPE nhU'nganh huang ra't it de'n ho;:ttd(>protease DC. 3.2.7. Tach protease CPE qua cQt IQcgel sephadex G-75 Tach protease CPE qua c(>tIQc gel sephadex G-75, c(>t(1O0x2cm), din b~ng c(>tb~ng d~m Britton pH 6,0; t6c d(>qua c(>t18ml/giCf,m6i phan do;:tn 3m!. Sau khi qua c(>t thu cac phan do;:tn d~ xac dinh ho;:tt d(> protease va dinh luQngprotein; ke't qua th~ hi~n a hlnh 3.10. II 1.5 .-c c ~8 "0 8' 1.2 1 ~ 1 0.8 "" c <0- "" "0 ..c OJ).eo 0.5 <= OJ) '<0 z '-'a 0.6 a;., ~ <= "'. i;j .g tla I, II, III, IV. Trong do chi co 15 2 dinh co ho~t dOprotease cM ye'u 1a dinh I va II (ki hi~u la P-I va P-II). P-II co ho~tdO protease chie'm toi 84,3% ho~t dO len cOt va co dO tinh s~ch ga'p 15 l~n so voi protease DC ban dffu (bang 3.4). Bang 3.4. Tom tiit qua trinh tinh s~ch protease Miiu Protein (mg) DQs<).ch (Ifill) Ho<).tdQ protease (%) Ho<).tdQ rieng (ill) (ill/mg protein) DC 192,55 8,28 100,00 0,043 1,0 CPE 21,33 6,63 80,07 0,311 7,2 P- I 1,48 0,18 2,17 0,122 2,8 P- II 8,69 5,59 67,51 0,643 15,0 Sail khi tach protease CPE qua cOt lQc gel, tie'n hanh thu cac phan do~n co P-I (phan do~n tit 6 - 12) va P-II (phan do~n tit 13 - 24) d~ tie'p tl,lCnghien CUllmQts6 tinh cha't cua cac protease nay. 3.2.8. MQt s6 tInh chift cua cae P.I va P.II 3.2.8.1. Anh htidng cua mQt s6 ion kim lo~i hoa trf 2 va mQt s6 chift d~c hi~u nhom tOi ho~t dQP-I va P-II Ke't qua nghien CUllth~ hi~n d hinh 3.11. ~ 55 ~ ~ 250 200 "" ,"::: 00 150 ;g <§ "" -5 100 " .~:g 50 <0' '" ';j. 0 :r: 0 L "'- ~< of x d' x <0;'; ~!i x x ~~ x if x x .: 'l- (y {Y~ o(\,.~ ~'Y V tI<}~ Chit'l them vito phao «fig IDnh 3.11. Anh htidng cua cae ion kim lo~i hoa trf 2 va mQt s6 chift d~c hi~u nhom de'n ho~t dQ P-I va P-II Ke't qua nghien CUllcho tha'y ion Caz+va MgZ+d n6ng dO1O-3Mlam giam ho~t dOP-I; nh11ngCaz+l~i khOng anh hudng de'n ho~t dOP-II. Mnz+ khong anh hudng toi ho~t dOP-I nh11ngl~i lam tang ho~t dOP-II. Cac ion Znz+, Cdz+, Baz+, Cuz+, Hgz+,CN-, Fez+, HzOz va EDTA d~u lam giam 16 ho<:ttdQ P-II; trong d6 Hg2+,H2O2va EDTA uc che' m<:tnhme ho<:ttdQP-II va lam giam tu'dng ung tdi 100%,97,9% va 98,6% ho<:ttdQP-II. D~c tinh nay kern theo kha nang du'<;1c ho<:tthoa du'di tac d\mg cua cac chtt khii'2Mercaptoethanol va L-Cystein (2-Mercaptoethanol va L-Cystein lam tang tdi 200% va 189,7%ho<:ttdQP-II) la OOungtinh chtt d~c tru'ngcua protease c6 chua nh6m thiol (-SH) trong trung tam ho<:ttdQng cua enzyme. Ke't qua nay chung to P-II thuQc nh6m proteinase thiol (proteinase cystein) theo cach phan lo<:ticua Hartley. D~ tie'p h,lCtlm hi~u v~ d~c tinh cua P-II, till nghi~m tie'n haOOxii'19PII b~ng EDTA vdi n6ng dQ trong h6n h 'OJ. ;;; 25 :ij ~ 0 DC A B c D E M~u thi nghi~m Hinh 3.12. Anh htfdng cua 2-MercaptoethanoI, Mg2+va Mn2+de'n sf/.h6i ph\lC ho~t dQ P-II (dii bi xii' Iy trtfoc voi EDTA) DC: mfiu d6i chung. A: mfiu xii'I9 vdi EDTA. B : mh tai ho<:tth6a vdi 2-Mercaptoethanol C : mh tai ho<:tthoa vdi Mg2+. D: mfiu llii ho<:tthoa vdi Mn2+. E : mh tai ho<:tthoa vdi Mg2+va Mn2+. Ke't qua hlnh 3.12 cho thty sau khi xii'19 vdi EDTA ho<:ttdQ cua P-II giam g~n OOu'hoan toan. Nhu'ng ne'u sau d6 l<:tithem 2-Mercaptoethanol thl ho<:ttdQ cua P-II h6i phl,lctdi 75%, con ne'u them Mn2+ho~c h6n h<;1p Mg2+va Mn2+thl ho<:ttdQenzyme chi h6i phl,lc25% ho<:ttdQban d~u. Ke't qua tren mQt l~n nua l<:tikh~ng dinh P-II la mQt proteinase thiol. M~t 17 khac ke't qua nay con cho tha'y P-II ding dn ion Mn2+dS h6 tr - Xem thêm -