Tài liệu nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris

Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp PHẦN I MỞ ĐẦU Nấm Đ«ng trïng hạ thảo (§THT) lµ một loại nấm ký sinh trên côn trùng, kh«ng chỉ được c¸c nhµ khoa học nghiªn cứu, mµ cßn được cả xã hội quan tâm đến, vì nấm là loại dược liệu quý, rất tốt cho sức khoẻ con người, phù hợp với mọi lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu niên, cho đến người già. Theo các tài liệu ghi chép về đông dược cổ, Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với các bệnh như rối loạn tình dục, thận hư, liệt dương, di tinh, đau lưng, mỏi gối, ho hen, và có tác dụng tốt đối với trẻ em còi xương chậm lớn. Một số nghiên cứu hiện đại gần đây đã chỉ ra rằng nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cường công năng của tuyến thượng thận, cải thiện được chức năng thận, nâng cao năng lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư và chất phóng xạ [10,11]. Trên thế giới, nấm Đông trùng hạ thảo đã được các nhà khoa học nghiên cứu và thu được rất nhiều thành tựu có giá trị. Với công nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước đã thành công trong việc nuôi cấy chất nền Cordyceps và phát triển nền công nghiệp sản xuất Cordyceps. Công ty Biofact life (Malaysia) đã kết hợp công nghệ tiên tiến của Nhật và các nước khác nuôi cấy thành công nấm Cordyceps trên môi trường nhân tạo để tạo ra hai hoạt chất chính là Cordycepin và Adenosine được tạo ra từ hệ sơi nấm. C¸c níc như Trung Quèc, Hµn Quèc, Mü, NhËt B¶n, Malaysia ®· s¶n xuÊt ®îc nấm §«ng trïng h¹ th¶o trªn quy m« c«ng nghiÖp từ những năm 1995, thế kỷ XX. Ở Việt Nam việc nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo mới chỉ bắt đầu, cho nên còn gặp nhiều khó khăn, cả về cơ sớ vật chất và kiến thức. Cho đến nay chưa có một tổ chức, cơ quan nào áp dụng được thành công công nghệ sinh học tiên tiến để nuôi cấy và sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng cho người. TrÇn thuú h¬ng 1 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp Để góp phần vào nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam, chúng tôi được giao thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS ” Mục đích và yêu cầu ®Æt ra a. Mục đích. 1. Nghiên cứu môi trường nuôi nấm Cordyceps militaris ®Ó xác định môi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris sinh trưởng và phát triển tốt. 2. Xác định được một số đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng phát triển của nấm Cordyceps militaris trên môi trường thích hơp. 3. Bước đầu xác định giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris. b. Yêu cầu. 1. Xác định được thành phần môi trường nuôi cấy cho nấm Cordyceps militaris ph¸t triÓn tèt. 2. Xác định được ¶nh hëng cña yÕu tè nhiÖt ®é và Èm ®é ®Õn sự sinh trưởng và phát triển của nÊm Cordyceps militaris. 3. Xác định được giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris. TrÇn thuú h¬ng 2 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp PHẦN II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I. Tình hình nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo trªn thÕ giíi 1.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo được các nhà khoa học Trung Quốc xác đinh mới đầu xuất hiện từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu này thực chất là hiện tượng ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. ký sinh. Năm 1878 các nhà khoa học đã phát hiện ra nấm này ký sinh trên sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes. Thường dễ gặp nhất ở sâu non loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus, ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi Thitarodes cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Vào cuối mùa thu các chất trên da của sâu non họ ngài đêm (Noctuidae) tương tác với các bào tử nấm và tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm đã đâm sâu vào ấu trùng, coi chúng là chất dinh dưỡng để phát triển. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát sinh mạnh và gây chết sâu, sau đó chúng hình thành chồi, phát triển chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu. Do đó nhiều người gọi là nấm Đông trùng hạ thảo bởi vì mùa đông nấm sống trong cơ thể côn trùng, mùa hè thì nấm phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ (hình 1) [8, 9]. Đầu thế kỷ XVIII, những người truyền giáo Châu Âu đã đưa Đông trùng hạ thảo đến với nước Pháp để nghiên cứu, và họ coi nước Pháp là nước có nền y học hiện đại. Đến nay rất nhiều nước đã nghiên cứu, điều tra và thu thập nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ngoài tự nhiên để làm nguyên liệu sản xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho người [10]. TrÇn thuú h¬ng 3 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp Hình 1: Nhộng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ( nguồn http://thucphamchucnang.files.won ) 1.2. Sù ph©n bố của nấm Đông trùng hạ thảo Theo tài liệu của báo điện tử [8, 9] nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy được vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000 m như cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam,... Theo các nhà khoa học thì chi nấm Cordyceps có tới 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông trùng hạ thảo. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu được 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con người. Vị thuốc này thực chất là hiện tượng ký sinh trên cơ thể ấu trùng của loài bướm có tên khoa học là Thitarodes thuộc chi Cordyceps, chñ yÕu lµ Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus. Loài nấm này phân bố rộng ở châu Á với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á và Châu Úc. 1.3. Cơ chế lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể côn trùng Theo Bách khoa toàn thư [8] thì loài nấm Cordyceps lây nhiễm vào cơ thể s©u hại đến nay vẫn chưa rõ nguyên nhân. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mặc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm TrÇn thuú h¬ng 4 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu. Đến một giai đọan nhất định, nấm phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử. Nấm Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm. Bên ngoài có màu vàng xẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà [11, 12]. II. Giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps: Năm 1993, Đông trùng hạ thảo đã làm cả thế giới kinh ngạc qua sự kiện thể thao quốc tế. Một nữ vận động viên người Trung Quốc đã liên tục phá kỷ lục thế giới nội dung chạy cự ly 1000 m, 3000 m và 10000 m. Thành công của người nữ vận động viên này một phần nhờ vào dùng Đông trùng hạ thảo trong bữa ăn hàng ngày. Tập đoàn Dược phẩm Tasly đã nhân giống Đông trùng hạ thảo đầu tiên ở vùng đầm lầy cao nguyên có độ cao trên 4000 m. Nhờ đó, Tasly đã phân lập và chiết xuất được hết hoạt động sinh học có giá trị dược liệu của Đông trùng hạ thảo, tạo nên viên nang Tasly Hoàng trùng thảo với hàm lượng Polissaccharid cao. Hướng đi này đã cho Trung Quốc có thương hiệu Đông trùng hạ thảo đã xuất khẩu vi toàn cầu. Nấm §THT có các chất dược liệu quý chủ yÕu là Cordycepin vµ Adenosine, ngoµi ra cßn nhiÒu chÊt kh¸c còng cã t¸c dông tèt cho con ngêi nh: Protein, Acid amin, Vitamin, Lipit, Polysaccharide,và các khoáng chất, … TrÇn thuú h¬ng 5 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp Phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của ĐTHT có 17 acid amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na...). Quan trọng hơn là trong sinh khối ĐTHT có nhiều chất hoạt động sinh học mà các nhà khoa học đang phát hiện dần dần ra nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự nhiên. Trong đó phải kể đến chất Cordiceptic acid, Cordycepin, Adenosine, Hydroxyethyl-adenosine. Đáng chú ý hơn cả là nhóm hoạt chất HEAA ( Hydroxy-Ethyl-Adenosine- Analogs). Ngoµi ra còn có chứa nhiều loại Vitamin (trong 100g ĐTHT có 0,12 g, vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg, vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K.. ) [11]. Sau đây là giá trị dược liệu quan trọng của một số chất: 2.1. Chất Cordycepin ( 3- deoxyadenosine ) có trong nấm ĐTHT với hàm lượng là 0.006 mg/g, đây lµ một dạng analoge của Adenosine, chất này có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống virus, ngăn chặn ung thư, ung thư vòm họng, bệnh lao (tuberculosis bird-type) ở người …. 2.2. Chất acid Cordycepic ( một dạng D-mannitol ) cña §THT ở thiên nhiên có hàm lượng là 30.05 mg/g. Chất Acid Cordycepic có tác dụng giảm ho và hen suyễn, giảm đường huyết và kháng vi khuẩn. 2.3. Chất SOD, một chất chống oxi hóa ( Superoxide Dismutase ) ở nấm ĐTHT có hàm lượng là 149.4 U/ml, cã t¸c dông chống lại thấp khớp, phát ban đỏ lupus, viêm tấy da hay cơ, ung thư và phóng xạ, nó cũng có khả năng chống lại lão hóa và làm đẹp làn da [10, 11]. 2.4. Chất Polysaccharide có hàm lượng là 94,6 mg/g, có tác dụng gia tăng hệ miễn dịch, chống ung thư, điều trị các bệnh về tim phổi, viêm phế quản mãn tính ở tuổi già cũng như cải thiện khả năng giải độc của gan. Hàm lượng Polysaccharide ở thiên nhiên là 94,6 mg/g, có tác dụng gia tăng hệ miễn dịch, chống ung thư, điều trị các bệnh về tim phổi, viêm phế quản mãn tính ở tuổi già cũng như cải thiện khả năng giải độc của gan [9, 10]. TrÇn thuú h¬ng 6 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp 2.5. Chất Manitol có thể tìm thấy ở nhiều thực vật, nhưng ở nấm Đông trùng hạ thảo có hàm lượng diosmol là cao nhất, ngoài công dụng làm giảm mỡ máu, đường máu và cholesterol. Chất Manitol còn giúp cho mạch máu giãn mỡ, phòng chống bệnh tim mạch rất hữu hiệu. 2.6. Chất Adenosin có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ thể. Chất này giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lực cho cơ bắp, giảm sinh trưởng của các tế bào thoái hóa, tăng lượng oxy trong máu…Vì vậy việc bổ sung hàm lượng Adenosin cao cho cơ thể là vô cúng cần thiết, giúp cho con người luôn dồi dào năng lượng để lao động hiệu quả. III. Công dụng của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh được nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps có những tác dụng sau: 1- Chống lại tác dụng xấu của các tân dược đối với thận, thí dụ đối với độc tính của Cephalosporin A. 2 - Bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thưng do thiếu máu. 3 - Chống lại sự suy thoái của thận, xúc tiến việc tái sinh và phục hồi các tế bào tiểu quản ở thận. 4 - Làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp. 5 - Chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim. 6 - Giữ ổn định nhịp đập của tim. 7 - Tăng cường tính miễn dịch không đặc hiệu. 8 - Điều tiết tính miễn dịch đặc hiệu. 9 - Tăng cường năng lực thực bào của các tế bào miễn dịch. 10 - Tăng cường tác dụng của nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trương nở các nhánh khí quản. 12 - Làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể. 13 - Hạn chế bệnh tật của tuổi già. 14 - Nâng cao năng lực chống ung thư của cơ thể. TrÇn thuú h¬ng 7 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp 15 - Chống lại tình trạng thiếu oxygen của cơ thể. 16 - Tăng cường tác dụng lưu thông máu trong cơ thể. 17 - Hạn chế tác hại của tia gamma đối với cơ thể. 18 - Tăng cường tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh. 19 - Tăng cường việc điều tiết nồng độ đường trong máu. 20 - Làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch. 21- Xúc tiến tác dụng của các nội tiết tố (hoocmon). 22 - Tăng cường chức năng tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dưỡng. 23 - Ức chế vi sinh vật có hại, kể cả vi khuẩn lao. 24 - Kháng viêm và tiêu viêm. 25 - Có tác dụng cường dương và chống liệt dương. Với những tác dụng trên thì nấm Đông trùng hạ thảo còn trực tiếp ảnh hưởng đến một số hệ thống quan trọng trong cơ thể . 3.1. Đối với hệ thống miễn dịch: Những nghiên cứu thực nghiệm ở Trung Quốc đã chứng minh ĐTHT có khả năng làm tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể. Cụ thể là nấm có tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và các tế bào nhiễm khuẩn. Chúng điều tiết các phản ứng đáp của tế bào lympho B, tăng cường một cách có chọn lọc hoạt tính của các tế bào ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể IgG, IgM trong huyết thanh. Mặt khác, nấm ĐTHT còn là một vị thuốc ức chế miễn dịch có tác dụng chống lại sự lão hóa của các tế bào. 3.2. Đối với hệ thống tuần hoàn tim, não: Nấm ĐTHT có tác dụng làm giãn mạch máu, làm tăng lưu lượng tuần hoàn não và tim, thông qua cơ chế hưng phấn thực thể M ở cơ trơn thành mạch. Mặt khác, nấm ĐTHT còn có khả năng điều chỉnh lipit máu, làm giảm lượng cholesterol và lipoprotein, hạn chế quá trình tiến triển của tình trạng xơ vữa động mạch. TrÇn thuú h¬ng 8 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp 3.3. Đối với hệ hô hấp: Nấm ĐTHT có tác dụng bình xuyễn, trừ đờm và phòng chống khí phế thũng. Điều này làm sáng tỏ quan điểm của cổ nhân xa xưa cho rằng nấm Đông trùng hạ thảo có khả năng “bảo phế, ích thận” và “dĩ lao khái” [11]. 3.4. Đối với hệ thống nội tiết: Các tác giả Chen L.T, Cao H.F & Huang W.F năm 2009 cho biết nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng trọng lượng tuyến vỏ thượng thận và tăng tổng hợp các hoocmon tuyến này, đồng thời nấm có tác dụng tương tự như hormon nam tính và làm tăng trọng lượng tinh hoàn cũng như các cơ quan sinh dục phụ trên động vật thực nghiệm. Ngoài ra, ĐTHT còn có tác dụng chống ung thư, chông viêm nhiễm, chống quá trình lão hoá và trấn tĩnh chống co giật [12]. IV. Nghiên cứu lâm sàng của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sp Các nhà y học cổ truyền trong và ngoài nước đã nghiên cứu sử dụng nấm ĐTHT để điều trị thành công khá chứng bệnh như rối loạn máu, viêm phế quản mãn và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục. Viện nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc) cũng đã dùng nấm ĐTHT để điều trị cho các bệnh nhân bị liệt dương, kết quả đạt được khá tốt. Như vậy, có thể thấy rằng nấm ĐTHT là một trong những vị thuốc đông y có khả năng cải thiện đời sống tình dục trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tác dụng nâng đỡ bồi bổ cơ thể. Điều này đã được các nhà y học cổ truyền biết đến từ rất sớm. Theo các cuốn sách cổ xưa, nấm ĐTHT có vị ngọt, tính ấm vào hai kinh thận và phế, có công năng dưỡng phế, bổ thận, ích tinh được dùng để trị phế hư khái xuyễn, thận suy dương nuy (liệt dương), di tinh, lưng đau gối mỏi. Khó có thể kể hết các phương thuốc đông y có sử dụng ĐTHT, nhưng để cải thiện và phòng chống các bệnh rối loạn tình dục. TrÇn thuú h¬ng 9 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp Các nhà y học cổ truyền ở Trung Quốc, đã nghiên cứu dùng nấm ĐTHT điều trị thành công khá nhiều bệnh như: Rối loạn lipid máu (hiệu quả đạt 76,2%), viêm phế quản mạn tính và hen phế quản, viêm thận mạn tính và suy thận (đạt hiệu quả từ 44,7-70%), rối loạn nhịp tim (đạt hiệu quả 74,5%), tăng huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính (đạt hiệu quả 70%), ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục (đạt hiệu quả từ 31,57-64,15%) [11,12,13]. 4.1. Cải thiện chức năng gan: Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu thực hiện trên 70 bệnh nhân viêm gan B mãn tính và xơ gan, khi sử dụng nấm ĐTHT hoặc là hỗn hợp thảo dược với thành phần chính là nấm linh chi, kết quả cho thấy có 68 % người bệnh có phản ứng lâm sàng tốt (với nhóm sử dụng ĐTHT) và chỉ có 57 % phản ứng tốt (với nhóm hổn hợp thảo dược chứa nấm Linh chi). Điều này cho thấy nấm Đông trùng hạ thảo tốt hơn nấm linh chi trong việc điều trị bệnh gan hay xơ gan cho người [14]. Thí nghiệm khác cũng được thực hiện trên 22 bệnh nhân xơ gan ở liều lượng 6 g/ngày cũng cho kết quả rất khả quan khi thử nghiệm các chức năng gan sau thời gian điều trị bằng Đông trùng hạ thảo [10]. 4.2. Giải độc cho thận: Bác sĩ y học cổ truyền cho rằng nấm ĐTHT có tác dụng làm tăng chức năng thận. Rất nhiều công trình y học hiện đại xác nhân là nhờ nấm có khả năng làm tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục tiết. Thực hiện trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận mãn tính, theo liệu trình điều trị từ 3-5 g ĐTHT/ ngày, kết quả cho thấy chức năng thận được cải thiện đáng kể. Mặt khác chức năng của hệ miễn dịch cũng được nâng cao hơn so với nhóm đối chứng. Một nghiên cứu khác trên 57 bệnh nhân bị hỏng thận do sử dụng gentamixin , người ta quan sát thấy bệnh nhân có sử dụng nấm ĐTHT với lượng 4.5 g/ ngày thì thận được bảo vệ tốt hơn, 89 % chức năng thận được hồi phục, giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chứng khi dùng giả dược hay sử dụng liệu pháp khác chỉ cho kết quả 45 %. Nghiên cứu ở 51 bệnh nhân bị suy thận có dùng nấm TrÇn thuú h¬ng 10 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp đông trùng hạ thảo với lượng 3-5 g/ngày thì nhận thấy chức năng thận và hệ miễn dịch được cải thiện. Thử nghiệm trên 69 bệnh nhân ghép thận, kết quả là nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps đã làm giảm độc tính của Cyclosporine trên thận [9,10]. 4.3. Hiệu quả giảm đường huyết: Nấm ĐTHT có hiệu quả với hệ thống chuyển hóa glucose máu. Các nhà khoa học nghiên cứu ngẫu nhiên có đến 95 % bệnh nhân được cải thiện chỉ số đường huyết khi sử dụng 3 g nấm/ ngày. Hiệu quả này đạt được là do tác dụng của nấm ĐTHT trong việc tăng độ nhạy của chất insulin, và các emzyme chuyển hóa glucose gan, glucokinase và hexokinasse. Kết quả này khẳng định rằng việc sử dụng nấm ĐTHT trong việc kiểm soát chỉ số đường huyết mà không gây ra các phản ứng phụ [11] 4.4. Bệnh phổi: Tác dụng điều trị bệnh về đường hô hấp của nấm ĐTHT đã được Y văn cổ ghi nhận từ hàng nghìn năm nay bao gồm các bệnh hen, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính ( COPD ) và bệnh viêm phế quản. Nghiên cứu về lâm sàng tại trường Đại học Y Bắc Kinh trên 50 bệnh nhân hen suyễn khi được điều trị bằng nấm ĐTHT nhận thấy tình trạng bệnh nhân đã được cải thiện có khoảng 81,3 % số bệnh nhân sau khi sử dụng nấm 5 ngày so với nhóm điều trị bằng các thuốc kháng histamine thông thường [13]. 4.5. Bệnh tim mạch: Nấm ĐTHT thường dùng để điều trị rối loạn nhịp tim, ngoài ra nấm còn được sử dụng để điều trị bệnh tim, hay hồi phục sau khi đột quỵ. Với các bệnh nhân suy tim mãn tính thì việc sử dụng nấm ĐTHT dài ngày và điều trị thông thường với các loại thuốc như Dioxin, hydrochlorothiazide, Dopamine, và Dobutamine sẽ thúc đẩy việc cải thiện chất lượng cuộc sống nói chung, bao gồm cả thể chất lẫn tinh thần, sinh lý và chức năng tim mạch. Nấm ĐTHT còn là loại nấm có khả năng làm giảm cholesterol, gia tăng tỷ số HDL / LDL Cholesterol và giảm Triglyceride. TrÇn thuú h¬ng 11 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp 4.6. Nâng cao khả năng miễn dịch: Thí nghiệm ở 61 bệnh nhân bị bệnh lupus trong 5 năm kết quả cho thấy việc dùng nấm §ông trùng hạ thảo với liều 3 g/ngày và chất Artesmisinine với lượng 0,6 g/ngày đã làm giảm căn bệnh trên [9]. 4.7. Hỗ trợ điều trị ung thư: Nhiều nghiên cứu lâm sàng được tiến hành tại Trung Quèc và Nhật Bản trên những bệnh nhân bị ung thư cho kết quả khả quan. Nghiên cứu trên 50 bệnh nhân ung thư phổi đã được uống 6 g nấm ĐTHT/ ngày, cùng với liệu pháp vật lý trị liệu thì khối u đã giảm đi ở 23 bệnh nhân chiếm 46 %. Nghiên cứu trên một số các bệnh nhân bị các dạng ung thư khác nhau, khi sử dụng nấm ĐTHT trong 2 tháng với liều lượng là 6 g/ ngày, kết quả cho thấy có cải thiện về triệu chứng trên đa số bệnh nhân. Số lượng tế bào máu trắng bằng hoặc cao hơn 3000 mm 3; ngay cả khi sử dụng liệu pháp chiếu xạ hay hóa chất thì các tham số miễn dịch cơ thể đã không bị thay đổi đáng kể trong khi kích thước khối u giảm đi nhiều trên một nửa bệnh nhân. Như vậy việc kết hợp sử dụng nấm ĐTHT với các liệu pháp hóa trị cho kết quả khả quan giảm tác dụng phụ của các liệu pháp trên [11,12]. 4.8. Chống rối loạn tình dục: Nấm ĐTHT dùng để điều trị rối loạn tình dục ở cả nam giới và nữ giới bao gồm giảm ham muốn, lãnh cảm hoặc liệt dương. Nghiên cứu được tiến hành tại Trung Quốc với 756 bệnh nhân bị suy giảm ham muốn, sau 40 ngày sử dụng 3 g ĐTHT/ ngày, thì có 64.8 % bệnh nhân đã cải thiện được tình trạng tình dục. Công trình nghiên cứu khác trên các đối tượng người cao tuổi, cả nam và nữ đều có triệu chứng giảm ham muốn, liệt dương và các bệnh suy giảm sinh lý khác, sử dụng 3 g/ngày trong vòng 40 ngày, các chỉ số đo được như thời gian sống của tinh trùng, số lượng tinh trùng đã tăng lên, còn tỷ lệ khiếm khuyết của tinh trùng giảm xuống đối với đa số các đói tượng, hơn gấp đôi số người bị liệt dương cũng được ghi nhận có cải thiện về tình trạng tình dục. Đối với nữ giới, chứng đa khí hư, tình trạng rối loạn kinh nguyệt, ham muốn tình dục cũng được cải thiện. TrÇn thuú h¬ng 12 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp 4.9. Tăng sức bền, chống mệt mỏi: Theo báo điện tử thì khi sử dụng mỗi ngày liều 3 g nấm Đông trùng hạ thảo thì kết quả làm gia tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mãn tính. Năm 2004, tại Mỹ các nhà khoa học đã thí nghiệm cho người 40 - 70 tuổi, nếu dùng nấm Đông trùng hạ thảo trong 12 tuần thì có sự gia tăng sức bền thể lực. Sự gia tăng sức mạnh được thể hiện ở cả hai yếu tố đó là gia tăng Adenosine Triphophate ( ATP ) và giải phóng năng lượng trong ty lạp thể của tế bào cũng như hệ số sử dụng hiệu quả oxy của tế bào trong quá trình giải phóng năng lượng [9]. 4.10. Chống lão hóa: Nấm ĐTHT chứa nhiều chất SOD (Superoxide Dismutase ) là chất chống oxy hóa cao, nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể. V. Công nghệ sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo và sản phẩm sử dụng: HiÖn nay nấm §THT đã ®îc rÊt nhiÒu níc trªn thÕ giíi s¶n xuÊt thành viên dược liệu thực phẩm chức năng cho người trªn quy m« c«ng nghiÖp nh Trung Quèc, Hµn Quèc, NhËt Bản, Mü vµ Malaysia. NÊm §THT được s¶n xuất trªn m«i trêng nh©n t¹o tèt h¬n nhiÒu so víi §THT thu ®îc ë ngoµi tù nhiªn. Cã rÊt nhiÒu s¶n phÈm ®îc s¶n xuÊt tõ nấm §THT vµ ®îc b¸n kh¾p mäi n¬i trªn thÕ giíi. 5.1. Sản phẩm CORDY-CGB: Dạng đóng gói: 90 viên nang/ hộp gồm 500 mg Đông trùng hạ thảo. Tổng cộng có 45 gam Đông trùng hạ thảo / hộp. Bột §ông trùng hạ thảo có chất lượng cao với hàm lượng Adenosine > 0.25 %, Mannitol > 7 % và Polysacchyride > 10 %. Mỗi ngày sử dụng khoảng 4-6 viên, trường hợp hỗ trợ điều trị xơ gan, suy thận, suy gan hay ung thư thì dùng liều lượng gấp 2 lần [11]. 5.2. S¶n phÈm CODYCAP – Đông trùng Hạ thảo Tenamyd: TrÇn thuú h¬ng 13 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp CODYCAP được sản xuất hoàn toàn từ Cordyceps Cephalosporium Mycelia nguyên chất, nguồn nguyên liệu tốt nhất từ nhà cung cấp nguyên liệu Đông trùng hạ thảo. Đặc điểm vượt trội của CODYCAP là hàm lượng rất cao Adenosine trong thành phần (5,088.90 mcg/g) (Tài liệu nghiên cứu thực tế bởi BIOFACT LIFE; Analytica Chimica Acta 567 (2006) 218-228) giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu quả và nhanh chóng xoá đi các triệu chứng mệt mỏi. Sản phẩm CODYCAP được chỉ định trong mọi trường hợp, dùng 2 viên/ngày/2 lần [10, 11]. VI. Nghiên cứu nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam Hiện nay ở nước ta nghiên cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới đạt được một số kết quả. Việc nghiên cứu mới chỉ mang tính chất điều tra, phát hiện và thu thập chúng trong điều kiện Việt Nam. Năm 2009, Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang. Tác giả Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện được loài nấm Đông trùng hạ thảo và được giám định là loài Cordyceps nutans. Đây là loài nấm đầu tiên được mô tả và ghi nhận có phân bố tại Việt Nam [1]. Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc Phạm Quang Thu đã phát hiện nấm ĐTHT Cordyceps Gunnii [2]. Tại vườn Quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nấm ĐTHT Cordyceps militari (NÊm nhéng trïng th¶o) [3]. Năm 2009, Phạm Thị Thùy đã thu thập ở vườn Quốc gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình nguồn nấm Cordyceps [6]. Về nấm Nhộng trùng thảo Cordyceps militaris lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam [1,2]. Loài nấm này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900 m đến 2.100 m so với mực nước biển. Ký chủ của loài này là nhộng thuộc TrÇn thuú h¬ng 14 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp bộ cánh vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 – 6,5 cm, hình chuỳ, phần thân và cuống nhỏ, phần đầu( phần sinh sản) phình to có chiều rộng đến 0,6 cm. Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và nhiều mụn nhỏ. Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản. Túi bào tử có kích thước 300 – 510 µ x 3,5 – 5µ, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,5 – 5 µ [3]. Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm và nghiên cøu nấm Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những khu rừng nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m. Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militarris PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người. Kết quả đã nghiên cứu và xác định được 3 loài nấm Đông trùng hạ thảo đó là: - Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc. - Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh. - Cordycep sp1 ở Sơn Động, Bắc Giang. Tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris gồm chất Cordycepin, HEAA, một số vitamin và một số nguyên tố vi lượng. Trên đây là một số kết quả bước đầu về việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam. Vì vậy việc nghiên cứu nấm này cần thiết được tiếp tục để đi sâu và phát triển những nấm Cordyceps để làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người [5]. Như vây nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam là hoàn toàn cần thiết, đáp ứng nhu cầu đòi hỏi là bảo vệ sức khoẻ con người ở Việt Nam. TrÇn thuú h¬ng 15 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 1. Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Viện Bảo vệ thực vật - Đông Ngạc - Từ Liêm Hà Nội 2. Thời gian nghiên cứu. Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2010 đến hết tháng 5/2010 II. Vật liệu nghiên cứu 1. Đối tượng nghiên cứu. Chủng nấm Cordyceps militaris do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ - Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. 2. Vật liệu nghiên cứu. a. Một số hoá chất: + Agar + Pepton + Maltoza + Cao nấm men b. Muối khoáng: + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + Chất bám dính, Tween 80 (Mỹ), Agral (Nhật) c. Dụng cụ và thiết bị cơ bản: Kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, nồi khử trùng, tủ sấy, tủ định ôn, tủ lạnh, buồng cấy, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, lọ thuỷ tinh, ống đong, phễu đong,… TrÇn thuú h¬ng 16 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp III. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1. Nội dung: 1.1 Nghiên cứu một số môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác định môi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris phát triển. 1.2 Nghiên cứu ¶nh hëng của thời gian đến sự phát triển của nÊm Cordyceps militaris. 1.3 Xác định giá trị dược liệu, thµnh phÇn hoá học của nấm Cordyceps militaris 2. Phương pháp nghiên cứu. 2.1. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác đinh môi trường tối ưu a. Một số môi trường sử dụng: + Môi trường Czapek – Dox: - Agar: 20 g - Saccaroza: 30 g - NaNO3: 2g - K2HPO4: 1g - MgSO4.7H2O: 0.5 g - KCl: 0.5 g - H2O: 1000 ml + Môi trường PDA: - Agar: 20 g - Saccaroza: 30 g - Khoai Tây: 300 g - H2O: 1000 ml + Môi trường MYPS: - Agar: 20 g - Đường kính: 10 g - Maltoza: 4g - Pepton: 6g TrÇn thuú h¬ng 17 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp - Cao nấm men: 4g - H2O: 1000 ml b. Phương pháp tiÕn hµnh: Thí nghiệm 1: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 3 môi trường Czapek-Dox, PDA, MYPS trong tháng 2 để xác định môi trường tối ưu Bước 1: Cân số lượng từng thành phần của 3 môi trường. Bíc 2: Nấu từng loại m«i trêng cho tan các thành phần nguyên liệu, đo độ pH =6 Bíc 3: §æ 1/2 phần m«i trêng vµo èng nghiÖm( 1/4 ®Õn 1/3 èng ) và để nguội, rồi gói lại. Phần môi trường còn lại đổ vào bình tam giác, mang tất cả đi khử trùng trong thời gian 60 phút, 1210C (với áp suất 1at) Bước 4: - Cho ra và nghiªng m«i trêng ở ống nghiÖm trong buồng cấy - Rót môi trưòng trong bình tam giác ra đĩa petri trong buồng cấy, để nguội. - Sau đó để nguội và khử trùng buồng cấy bằng tia UV ( 30 phút đến 60 phút ). Bíc 5: TiÕn hµnh cÊy chÊm ®iÓm trên đĩa petri và cấy rÝch r¾c trên từng ống nghiệm. Bíc 6: Gói ống nghiệm và đĩa petri cấy nấm, nu«i trong tñ định ôn, theo dâi hµng ngµy sự phát triển của nấm. Thí nghiệm 2: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 2 môi trường PDA và MYPS trong tháng 3 Phương pháp như thí nghiệm 1 Thí nghiệm 3: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 2 môi trường PDA và MYPS trong tháng 4 – 5 Phương pháp như thí nghiệm 1 c. Theo dõi sự phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris về hình thái, sinh trưởng và phát triển TrÇn thuú h¬ng 18 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp + Chỉ tiêu theo dõi hàng ngày: - Quan sát hình thái nấm bằng mắt thường: Quan sát màu sắc sự phát triển của sợi nấm cả mặt trước và mặt sau của khuẩn lạc để xác định sắc tố. Mô tả quá trình phát triển nấm. - Theo dõi và ghi chép nhiệt độ và ẩm độ trong phòng nuôi cấy. - Đo đưòng kính khuẩn lạc: Kể từ khi nấm hình thành khuẩn lạc sau 5,10,15,,20,25 ngày (dùng thước đo cm kẻ rõ) để đo đường kính, đo cả mặt trước và mặt sau của đĩa theo hai đường vuông góc, sau đó tính trị số trung bình theo công thức: D1 + D2 D = ------------2 Trong đó: D: đường kính trung bình của khuẩn lạc D1, D2: đường kính khuẩn lạc của hai đường vuông góc - Chụp ảnh sự phát triển của nấm theo thời gian phát triển 2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên môi trường tối ưu nhất - Nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên môi trường tối ưu nhất trong ba khoảng thời gian khác nhau (tháng 2, 3, 4). - Theo dõi hàng ngày và đo đường kính khuẩn trung bình của khuẩn lạc nấm ở các khoảng thời gian trên, nhận xét và mô tả sự phát triển. - Sau ba đợt thí nghiệm so sánh đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm và rút ra kết luận trong khoảng thời gian, nhiệt độ, ẩm độ nào nấm phát triển mạnh nhất. - Chụp ảnh sự phát triển của nấm (thông qua mô tả sự phát triển). TrÇn thuú h¬ng 19 506301024 Khoa CNSH & MT Khãa LuËn Tèt NghiÖp 2.3. Xác định giá trị dược liệu và thành phần hoá học của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris a. Phương pháp tiến hành: - Nguồn nấm Cordyceps militaris làm khô trong không khí ở 40 0C và dùng máy nghiền thành bột - Lấy 0,1 g bột trên chiết 3 lần với nước sôi (3 x 10 ml). Lọc qua phễu và làm khô lạnh để thu chất chiết suất - Sau khi làm khô lạnh, phần còn lại được hoàn nguyên trong 10 ml methanol và lọc qua màng 0,22 µm. Trước khi phân tích tiếp HPLC, các mẫu được hoà tan trong 10 ml các dung dịch thích hợp - HPLC: Thể tích mẫu 5 µl; dung dịch rửa giải methanol: 20 mM phosphoric acid = tỷ lệ 15 : 85 trong 20 phút, phát hiện tại bước sóng 260 nm b. Định lượng chuẩn: Xác định Cordycepin hoặc Cordycepic Acid hoặc đường cụ thể bằng hợp chất N6 -(2- hydroxyethyl) – Adenosine, đây là chất chỉ thị để phát hiện trong các mẫu Cordyceps và không được tìm thấy trong các sinh vật. Hợp chất này và chất Adenosine và 3’ deoxyadenosine ( Cordycepin ) được sử dụng làm chất chỉ thị chất lượng để so sánh các chủng khác nhau của nấm Cordyceps c. Xác định một số vitamin và nguyên tố vi lượng theo phương pháp chung của phân tích hóa học Phần xác định giá trị dược liệu do Công ty cổ phần dược liệu Trung ương II thực hiện TrÇn thuú h¬ng 20 506301024