Tài liệu Nghiên cứu khả năng nhân nhanh giống lan hài giáp paphiopedilum malipoense bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- TRẦN THI ̣PHƢƠNG NHUNG Tên đề tài NGHIÊN CƢ́U KHẢ NĂNG NHÂN NHANH GIỐNG LAN HÀ I GIÁP (Paphiopedilum malipoense) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hê ̣ đào ta ̣o : Chính quy Chuyên ngành : Công nghê ̣ sinh ho ̣c Khoa: : CNSH-CNTP Khoá học : 2012-2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- TRẦN THI ̣PHƢƠNG NHUNG Tên đề tài NGHIÊN CƢ́U KHẢ NĂNG NHÂN NHANH GIỐNG LAN HÀ I GIÁP (Paphiopedilum malipoense) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hê ̣ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghê ̣ sinh ho ̣c Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2012-2016 Giảng viên hƣớng dẫn 1: ThS. Nguyễn Thi Ti ̣ ̀nh Giảng viên hƣớng dẫn 2: ThS. Nguyễn Xuân Vũ Thái Nguyên - năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Đƣợc sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trƣờng , Ban chủ nhiê ̣m khoa Công nghê ̣ sinh ho ̣c và Công nghê ̣ thƣ̣c phẩ m , trong thời gian thƣ̣c tâ ̣p tố t nghiê ̣p em đã thƣ̣c hiê ̣n đề tài : “Nghiên cƣ́u khả năng nhân nhanh giố ng lan hài G iáp (Paphiopedilum malipoense) bằ ng phƣơng pháp in vitro” Trang đầ u tiên của khoá luâ ̣n này em xin gƣ̉i lời cảm ơn tới Ban giám hiê ̣u nhà trƣờng, Ban chủ nhiê ̣m khoa Công nghê ̣ S inh ho ̣c và Công nghê ̣ T hƣ̣c phẩ m cù ng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cƣ́u này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc , em xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thi Ti ̣ ̀nh và thầy giáo T hS. Nguyễn Xuân Vũ , giảng viên khoa Công nghê ̣ Sinh ho ̣c và Công nghê ̣ Thƣ̣c phẩ m đã tâ ̣n tình chỉ bảo , giúp đỡ và hƣớng dẫn em trong thời gian thƣ̣c hiê ̣n đề tài . Đồng thời, em xin cám ơn tha ̣c si ̃ Ma Thi ̣Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhấ t cho em trong suố t quá trình thƣ̣c tâ ̣p tố t nghiê ̣p. Cuố i cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dƣ̣a tinh thầ n cho em trong suố t thời gian thƣ̣c tâ ̣p , cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá triǹ h thƣ̣c tâ ̣p , cũng nhƣ là quá trình làm báo cáo thƣ̣c tâ ̣p thời gian có ha ̣n , trình độ và kỹ năng bản thân còn nhiều hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi nhƣ̃ng sai sót . Em rấ t mon g nhâ ̣n đƣơ ̣c nhƣ̃ng ý kiế n đó ng góp của thầ y cô và các bạn để đề tài của em đƣợc hoàn thiện hơn . Lời cuố i em xin kiń h chúc các thầ y , cô giáo trong nhà trƣờng , trong khoa Công nghê ̣ Sinh ho ̣c và Công n ghê ̣ thƣ̣c phẩ m , cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ , thành công trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 21 tháng 5 năm 2016 Sinh viên thƣc̣ hiêṇ Trầ n Thi Phƣơng Nhung ̣ ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quố c tế (IUCN) [1] .................................................................................8 Bảng 3.1. Thiế t bi,dụng cụ nghiên cƣ́u .....................................................................23 ̣ Bảng 3.2. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng cuả nồ ng đô ,̣ thời gian của chấ t khƣ̉ trùng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây lan hài Giáp ......................................26 Bảng 4.1. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ,̣ thời gian khƣ̉ trùng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy)..............................32 Bảng 4.2. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ BA đế n khả năng tái sinh chồ i lan hài Giáp (sau 40 ngày nuôi cấy) .................................................................35 Bảng 4.3. Kế t quả nghiên cƣ́u ản h hƣởng của BA kế t hơ ̣p với Kinetin đế n khả năng nhân nhanh giố ng lan hài Giáp (sau 30 ngày nuôi cấy) ...........................................38 Bảng 4.4. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của BA kế t hơ ̣p với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Giáp (sau 30 ngày nuôi cấy) ............................40 Bảng 4.5. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA đế n khả năng ra rễ cây lan hài Giáp (sau 30 ngày nuôi cấy) ..........................................................................43 Bảng 4.6. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của NAA kế t hơ ̣p với than hoa ̣t tính đế n khả năng ra rễ cây lan hài Giáp (sau 30 ngày nuôi cấy) ..........................................45 iii DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) .....................12 Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan hài Giáp ............................25 Hình 4.1. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣, thời gian của HgCl 2 đến khả năng tạo vật liê ̣u vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) ...........................................................................33 Hình 4.2. Biể u đồ ảnh hƣởng của BA đế n khả năng tái sinh giố ng lan hài Giáp sau 40 ngày nuôi cấy .......................................................................................................35 Hình 4.3. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ BA tố t nhấ t kế t hơ ̣p với Kinetin đế n khả năng nhân nhanh giố ng lan hài Giáp (sau 30 ngày nuôi cấy) ...................................38 Hình 4.4. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ BA tố t nhấ t kế t hơ ̣p với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Giáp (sau 40 ngày nuôi cấy)......................40 Hình 4.5. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA đế n khả năng ra rễ cây lan hài Giáp (sau 30 ngày nuôi cấy) ..............................................................................................43 Hình 4.6. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA tố t nhấ t kế t hơ ̣p với THT đế n khả năng ra rễ cây lan hài Giáp (sau 30 ngày nuôi cấy) ..................................................46 iv DANH MỤC CÁC TƢ̀, CỤM TỪ VIẾT TẮT BA : 6-Benzyladenine BT : Bình thƣờng Cs : Cô ̣ng sƣ̣ CT : Công thƣ́c CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog’s, 1962 MT : Môi trƣờng NAA : α-Naphthalene acetic acid ND : Nƣớc dƣ̀a PLB : Protocorm like body RE : Robert Ernst TDZ : Thidiazol THT : Than hoa ̣t tính TN : Thí nghiệm v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... ii DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TƢ̀, CỤM TỪ VIẾT TẮT ......................................................... iv MỤC LỤC ...................................................................................................................v Phần 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................2 1.3. Yêu cầ u của đề tài ................................................................................................2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀ I LIỆU ...........................................................................3 2.1. Tổ ng quan về lan Hài ...........................................................................................3 2.1.1. Phân loa ̣i và nguồ n gố c .....................................................................................3 2.1.1.1. Phân loa ̣i .........................................................................................................3 2.1.1.2. Nguồ n gố c ......................................................................................................3 2.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................4 2.1.3. Sinh thái ............................................................................................................5 2.1.4. Hiê ̣n tra ̣ng cây lan Hài Viê ̣t Nam ......................................................................6 2.2. Giới thiê ̣u về giố ng lan Hài Giáp .......................................................................10 2.2.1. Nguồ n gố c và sƣ̣ phân bố ................................................................................10 2.2.2. Hình thái ..........................................................................................................11 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. malipoense ...................13 2.2.3.1. Nhiê ̣t đô ̣, đô ̣ ẩ m, ánh sáng ............................................................................13 2.2.3.2. Nhu cầ u bón phân .........................................................................................13 2.2.3.3. Giá thể trồng .................................................................................................13 2.2.4. Các phƣơng pháp nhân giống vô tính lan hài Giáp .........................................13 2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ...............................................14 vi 2.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật .................................................................14 2.3.2. Sƣ̣ phân hoá tế bào ..........................................................................................14 2.3.3. Sƣ̣ phản phân hoá tế bào .................................................................................15 2.3.4. Mô ̣t số yế u tố ảnh hƣởng đế n quá trin ̀ h nuôi cấ y mô tế bào thƣ̣c vâ ̣t .............15 2.3.4.1. Vâ ̣t liê ̣u nuôi cấ y ..........................................................................................15 2.3.4.2. Điề u kiê ̣n nuôi cấ y .......................................................................................16 2.3.5. Môi trƣờng dinh dƣỡng ...................................................................................16 2.3.5.1. Nguồ n Cacbon ..............................................................................................16 2.3.5.2. Các nguyên tố khoáng đa lƣợng, vi lƣơ ̣ng ...................................................16 2.3.5.3. Vitamin .........................................................................................................17 2.3.5.4. Các chất hữu cơ tự nhiên ..............................................................................17 2.3.5.5. Các thành phần khác ....................................................................................18 2.3.5.6. pH của môi trƣờng .......................................................................................18 2.3.5.7. Các chất điều hoà sinh trƣởng ......................................................................18 2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nƣớc .......20 2.4.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài tr ên thế giới ...........................20 2.4.2. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trong nƣớc .............................22 Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U ......23 3.1. Vâ ̣t liê ̣u, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................23 3.1.1. Đối tƣơ ̣ng, vâ ̣t liê ̣u nghiên cƣ́u ........................................................................23 3.1.2. Hoá chất sử dụng .............................................................................................23 3.1.3. Thiế t bi,dụng cụ nghiên cứu ............................................................................23 ̣ 3.2. Phạm vi, điạ điể m và thời gian nghiên cƣ́u ........................................................24 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................24 3.2.2. Điạ điể m nghiên cƣ́u .......................................................................................24 3.2.2. Thời gian nghiên cƣ́u ......................................................................................24 3.3. Nô ̣i dung nghiên cƣ́u ..........................................................................................24 3.3.1. Nô ̣i dung 1: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ,̣ thời gian của chấ t khƣ̉ trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây lan hài Giáp .............................24 vii 3.3.2. Nô ̣i dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi lan hài Giáp từ đoạn thân mang chồi ngủ..........................................................24 3.3.3. Nô ̣i dung 3: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ n g đô ̣ BA, Kinetin, TDZ đế n khả năng nhân nhanh chồ i lan hài Giáp ...........................................................................24 3.3.4. Nô ̣i dung 4: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA và than hoa ̣t tính đế n khả năng ra rễ của cây lan hài Giáp ..........................................................................24 3.4. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u ....................................................................................25 3.4.1. Chuẩ n bi môi trƣờng nuôi cấ y in vitro ............................................................25 ̣ 3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u .................................................................................25 3.4.3. Phƣơng pháp bố trí thí nghiê ̣m ........................................................................25 3.4.3.1. Nô ̣i dung 1: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ,̣ thời gian của chấ t khƣ̉ trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây lan hài Giáp .............................26 3.4.3.2. Nô ̣i dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi lan hài Giáp từ đoạn thân chứa mắt ngủ............................................................27 3.4.3.3. Nô ̣i dung 3: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đế n khả năng nhân nhanh chồ i lan hài Giáp . ...................................................................27 3.4.3.4. Nô ̣i dung 4: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của NAA và thanh hoa ̣t tin ́ h đế n khả năng ra rễ của cây lan hài Giáp .................................................................................28 3.5. Phƣơng pháp đánh giá và xƣ̉ lý số liê ̣u ..............................................................29 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN ...........................................31 4.1. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ,̣ thời gian của chấ t khƣ̉ trùng HgCl 2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng ............................................................................31 4.2. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng củ a nồ ng đô ̣ BA đế n khả năng tái sinh chồ i lan hài Giáp .....................................................................................................................34 4.3. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ BA, Kinetin, TDZ đế n khả năng nhân nhanh giố ng lan hài Giáp ..................................................................................37 4.3.1. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của BA kế t hơ ̣p với Kinetin đế n khả năng nhân nhanh giố ng lan hài Giáp ..................................................................................37 viii 4.3.2. Kế t quả nghiên cứu ảnh hƣởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giố ng lan hài Giáp .........................................................................39 4.4. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của NAA và thanh hoa ̣t tin ́ h đế n khả năng ra rễ của cây lan hài Giáp ..................................................................................................42 4.4.1. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA đế n khả năng ra rễ của cây lan hài Giáp ...............................................................................................................42 4.4.2. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của NAA kế t hơ ̣p với than hoa ̣t tính đế n khả năng nhân nhanh cây lan hài Giáp ............................................................................45 Phầ n 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI .................................................................. 48 ̣ 5.1. Kế t luâ ̣n ..............................................................................................................48 5.2. Kiế n nghi ............................................................................................................ 48 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... I. Tiế ng Viê ̣t ................................................................................................................... II. Dịch từ tiếng nƣớc ngoài .......................................................................................... III. Tiế ng Anh ................................................................................................................ PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Phong lan Việt Nam là nguồn tài nguyên quý giá, không chỉ có sức hấp dẫn cao đối với các nhà khoa học, mà còn là thú say mê, là nguồn cảm hứng của nhiều ngƣời yêu hoa trong và ngoài nƣớc. Nói đến những loài Lan quý và đặc hữu ở Việt Nam, đặc biệt phải kể đến chi lan Hài với 22 loài mọc tự nhiên hiện tại đƣợc coi là trung tâm đa dạng nhất thế giới [5]. Lan Hài thuô ̣c ho ̣ lan Orchidaceae, là một trong những họ lớn nhất và cũng mang la ̣i nhiề u giá trị kinh tế , khoa ho ̣c trong ngành thƣ̣c vâ ̣t ha ̣t kín . Hài G iáp (Paphiopedilum malipoense) là một trong những loài lan đă ̣c hƣ̃u quý hiếm của Việt Nam [3]. Đặc điểm của giống lan này là cánh hoa hình trứng hơi nhọn , có lông t ơ trắ ng ở gố c , lông nhung ở mă ̣t trong . Hoa có mùi thơm ngo ̣t diụ , lá đài và cánh hoa có màu xanh táo , có đốm và sọc tím -hồ ng. Cánh môi nằm ngang , màu xanh nhạt có đố m tím hồ ng ở mă ̣t trong, hình túi sâu nhìn nhƣ chiếc hài. Hiê ̣n nay , trong quá triǹ h ph át triển kinh tế xã hội , nhiề u loài lan quý hiế m đang bi ̣đe doa ̣ tuyê ̣t chủng . Trong đó phải kể đế n lan hài Giáp là một trong các loài lan Hài đă ̣c hƣ̃u Viê ̣t Nam đang bị đe doạ nghiêm trọng [1]. Cùng với sƣ̣ phát triể n của khoa ho ̣c kỹ thuâ ̣t việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy in vitro tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lƣợng tốt, đồng đều cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn. Bởi vâ ̣y, phƣơng pháp nhân giố ng vô tin ́ h in vitro lan Hài đã và đang mở ra triể n vo ̣ng tố t ch o viê ̣c bảo tồ n các loài thƣ̣c vâ ̣t quý hiế m và phát triển các giống lan quy hiế m này . Xuấ t phát tƣ̀ nhƣ̃ng cơ sở khoa học và cơ sở thƣ̣c tiễn đó , chúng tôi tiế n hành thƣ̣c hiê ̣n đề tài : “Nghiên cƣ́u khả năng nhân nhanh giố (Paphiopedilum malipoense) bằ ng phƣớng pháp in vitro” ng lan hài Giáp 2 1.2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cƣ́u thành công quy trình nhân nhanh giố ng lan hài Giá p tƣ̀ đoa ̣n thân non mang chồ i ngủ bằng phƣơng pháp in vitro. 1.3. Yêu cầ u của đề tài - Xác định hiệu quả khử trùng của HgCl2 ở nồng độ và các mốc thời gian đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ BA đế n khả năng tái sinh chồ i lan hài Giáp . - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồ i lan hài Giáp . - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Giáp. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết đƣợc học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy đƣợc kinh nghiệm thực tế cũng nhƣ tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vu ̣ cho cho công tác sau này. - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân giống cây lan hài Giáp bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô. - Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất đƣợc quy trình nhân nhanh giống lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) bằng phƣơng phán nuôi cấy in vitro, tạo ra số lƣợng giống lan hài Giáp góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trƣớc nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 2.1. Tổ ng quan về lan Hài 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1. Phân loại Lan Hài là mô ̣t nhóm rấ t khác biê ̣t trong ho ̣ lan . Chúng dễ dàng đƣợc nhận ra bởi cấ u trú c hoa khác thƣờng với mô ̣t cá nh hoa giƣ̃a hình túi sâu trông giố ng mô ̣t chiế c hài nằ m ở vi ̣trí thấ p nhấ t của hoa. Chiế c môi đă ̣c sắ c và hình da ̣ng khác thƣờng của hoa ta ̣o nên vẻ bề ngoài dễ dàng phân biê ̣t lan Hài với các loài lan khác . Vì vâ ̣y nó trở thành tên chung của loài lan này . Về mă ̣t thƣ̣c vâ ̣t ho ̣c, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thƣờng đƣơ ̣c go ̣i là hài Vê ̣ nƣ̃ , phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồ m khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mi.̃ - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Đô ̣ và Đông Hymalaya đế n Philip pine, New Guinea và Quầ n đảo Solomon. Ở Viê ̣t Nam các loài lan Hài đề u thuô ̣c chi Cypripedioideae, họ phụ (Orchidales), phân lớp hành Epidendroideae, họ lan Paphipedilum, thuô ̣c tông (Orchidaceae), bô ̣ lan (Liliidae), lớp mô ̣t lá mầ m (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thƣ̣c vâ ̣t (Plantae)[1],[9]. 2.1.1.2. Nguồ n gố c Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á , trong đó có Viê ̣t Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này đƣợc tìm thấy chủ yếu ở Trung Quố c và Bắ c Viê ̣t Nam, mỗi loa ̣i trong chi này đề u có khu phân bố rấ t ha ̣n chế . 4 Hầ u nhƣ tấ t cả các loài lan đề u bắ t nguồ n tƣ̀ các tổ tiên kiể u hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài go ̣i là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhi ̣đƣ̣c ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong). Xu hƣớng tiế n hoá của ho ̣ Lan là giảm số lƣơ ̣ng nhi ̣đƣ̣c và sƣ̣ dính liề n giƣ̃a nhị đực hữu thụ với nhị c ái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sƣ̣ giảm liên tu ̣c số lƣơ ̣ng nhi ̣đƣ̣c dẫn đế n sƣ̣ hình thành các nhóm lan có ba, hai hay mô ̣t nhi đƣ̣ ̣ c tồ n ta ̣i trong hoa . Trong ho ̣ Lan , chi lan Hài (thuô ̣c tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồ n ta ̣i trong hoa [1]. 2.1.2. Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rấ t đa da ̣ng tuy nhiên chúng đề u mang nhƣ̃ng đă ̣c điể m hin ̀ h thái : - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thƣớc trung bình với thân mang nhiề u lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt , đôi khi có da ̣ng thân bò . Tấ t cả các loài đều có thân rễ nhƣng đa số rấ t ngắ n [1] - Lá: thƣờng có da ̣ng lá dài gấ p đôi , hình trứng ngƣợc hay bầ u du ̣c thuôn và mở rô ̣ng. Mỗi lá có đốt ở gốc , dƣới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mă ̣t trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoă ̣c khảm bởi các mảng đâ ̣m nha ̣t không đề u với các gân màu xanh lá nổ i rõ . Mă ̣t dƣới lá có các đố m tim ̉ chỉ thấ y rõ ở gầ n gố c lá . Lá của các ́ dày đă ̣c hoă ̣c vế t tim ́ xin loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nƣớc và cƣ́ng [1]. - Cụm hoa : thƣờng thẳ ng đƣ́ng hay cong . Mô ̣t số loài có ngang, mô ̣t số loài la ̣i có cuố ng hoa chúc xuố ng cuố ng hoa nằ m , nhƣng hầ u hầ u các loài đề u có cuố ng hoa dƣ̣ng đƣ́ng. Phầ n lớn các loài chỉ có mô ̣t hoa riêng lẻ . Tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rấ t hiế m . Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoă ̣c nhẵn . Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài , từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thƣờng có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhƣng nói chung thƣờng có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá , ở một số loài có lá hoa nhẵn. 5 - Hoa: Gồ m hai lá đài ở vòng ngoài , mô ̣t lá đài lƣng, mô ̣t lá đài hơ ̣p và ba cánh hoa ở vòng trong . Lá đài lƣng thƣờng lớn, hƣớng thẳ ng lên trên và thƣờng nổ i bâ ̣t với các va ̣ch hay chấ m ở mă ̣t trong . Lá đài lƣng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấ p hơn và hƣớng xuố ng phía dƣới . Lá đài hợp nằm phía sau của môi thƣờng có mô ̣t màu tố i xin̉ và kém nổ i bâ ̣t hơn so với lá đài lƣng . Cả hai lá đều thƣờng có lông tơ dày ở mă ̣t ngoài [1]. Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thƣờng hơi xoè xuống dƣới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũ i giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giƣ̃a thƣ́ ba biế n da ̣ng rõ rê ̣t thành mô ̣t môi giố ng nhƣ cái bao hoă ̣c hin ̀ h chiế c hài . Môi da ̣ng túi sâu và phồ ng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài. Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị - nhuỵ. Hai nhi ̣đƣ̣c hƣ̃u thu ̣ của vòng trong có chỉ nhi ̣ngắ n dính liề n ở phía sau núm nhuy ̣ và hai bên cuố n cô ̣t. Bầ u dƣới, mô ̣t ô, đin̉ h noañ bên là điể m đă ̣c trƣng của chi này . Hầ u hế t các loài lan Hài, bầ u có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tiá xin ̉ [1]. - Qủa: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba va n he ̣p. Qủa mở ở gầ n đỉnh bằ ng 6 rãnh nứt. Qủa thƣờng chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấ n tƣ̀ sáu đế n mƣời tháng [1]. - Hạt: Có hình bầu dục , hình con suốt chỉ ngắn ,dạng thuôn dài hay hẹp và thƣờng có chiề u dì a tƣ̀ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ , dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nô ̣i nhũ do đó rấ t khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]. - Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật , lớp màng xố p này có vai trò trong việc giƣ̃ nƣớc và ngăn chă ̣n ánh sáng gay gắ t [7]. Sau khi rễ trƣởng thành thì có da ̣ng sơ ̣i mảnh với hê ̣ floem phát triể n ma ̣nh và không có các búi nấm xung quanh rễ [1]. 2.1.3. Sinh thái Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng . Mô ̣t nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phiá Bắ c Viê ̣t Nam tƣ̀ đô ̣ cao mă ̣t nƣớc biể n lên đế n 6 1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat , đá phiế n và cát kế t ở đô ̣ cao tƣ̀ 700-2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nƣ́t hay rià của các vách núi dƣ̣ng đƣ́ng đá granit. Lan Hài của Viê ̣t Nam có thể số ng trên đấ t , bám đá và phụ sinh mùn . Các loài số ng trên đấ t thƣờng mo ̣c ở nơi c ó ít ánh sáng của tán cây rừng , ở nơi sƣờn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn . Các loài lan Hài mọc trên đá thƣờng mọc dƣới bóng cây của kiểu rừng ít khép t án, chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dƣới các đƣờng đỉnh . Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m. Tại Việt Nam , lan Hài thƣờng phân bố ở vùng có lƣơ ̣ng mƣa lớn , ẩm độ cao . Tuy nhiên do đă ̣c trƣng là vùng khí hâ ̣u nhiê ̣t đới gió mùa nên chúng thƣờng phải trải qua một giai đoạn khô hạn . Sƣ̣ xuấ t hiê ̣n lá dày , dai và mo ̣ng nƣớc là hƣớng thích n ghi tố t để cây có thể số ng sót đƣơ ̣c qua đơ ̣t khô ha ̣n đinh ̣ kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phu ̣c hồ i khi mùa mƣa trở la ̣i . Độ ẩm xung quanh rễ , kiể u đấ t và đô ̣ pH, sƣ̣ có mă ̣t của các nấ m rễ , tác nhân thu ̣ phấ n và cƣờng đô ̣ ánh sáng là các nhân tố quan tro ̣ng trong sƣ̣ hiǹ h thành và phát triển của quần thể lan Hài. Trong rƣ̀ng nguyên sinh , lan Hài phân bố đề u nhau ở các hƣớng của sƣờn núi . Nhƣng trong các vùng rƣ̀ng đã bi ̣xuố ng cấ p , lan Hài có khuynh hƣớng phát triể n ở các sƣờn núi phía Bắc, đông Bắ c và tây Bắ c của núi. Ngày nay, thƣờng chỉ tim ̀ thấ y lan Hài mo ̣c thành tƣ̀ng đám nhỏ . Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con ngƣời,sƣ̣ thay đổ i các điều kiện môi trƣờng và viê ̣c thu hái lan để bán là nhƣ̃ng nguyên nhân chiń h gây ra s ự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam [1] 2.1.4. Hiê ̣n tra ̣ng cây lan Hài Viê ̣t Nam Hiê ̣n nay , nhu cầ u về hoa tƣơi nói chung và hoa lan n ói riêng trên thế giới cũng nhƣ trong nƣớc đang ngày càng gia t ăng. Vì vậy việc trồng lan đã trở thành mô ̣t ngành kinh tế của nhiề u nƣớc trên thế giới và nhiề u nƣớc đang phát triể n khu vƣ̣c Đông Nam Á . 7 Lan Hài là chủng ho ̣ lan có giá tri ̣thƣơng ma ̣i cao nhấ t , đƣơ ̣c yêu chuô ̣ng , sƣu tầ m , tìm kiế m nhiề u nhấ t thế giới . Với sƣ̣ hiê ̣n hƣ̃u của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Viê ̣t Nam là mô ̣t trong các quố c gia có nguồ n lan Hài tƣ̣ nhiên phong phú nhấ t . Không nhƣ̃ng phong phú về chủng loa ̣i , Viê ̣t Nam còn có nhiề u loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao , đƣơ ̣c thế giới ƣa chuô ̣ng . Điề u này đã ta ̣o nên tiǹ h tra ̣ng thu thâ ̣p và xuấ t khẩ u lan Hài mô ̣t cách ồ a ̣t đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên trƣờng tƣ̣ nhiên bi khai thác ca ̣n kiê ̣t nhƣ hiê ̣n nay ̣ , không kiể m soát , dẫn . Đồng thờ i với tình tra ̣ng môi , lan Hài càng biế n mấ t nhanh chóng. [1] Dƣ̣a trên nhƣ̃ng nghiên cƣ́u thƣ̣c điạ gầ n đây , tình trạng bảo tồn các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn cá c thƣ́ ha ̣ng về mƣ́c đô ̣ đe doa ̣ tuyê ̣t chủng của tổ chƣ́c bảo tồ n thiên nhiên Quố c tế (IUCN) đƣơ ̣c tổ ng kế t ở bảng 2.1. 8 Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] Tình trạng Tên loài (tiế ng Latinh) Tên loài (tiế ng Viêt)̣ Đã bi tuyê ṭ chủng ̣ ngoài thiên nhiên P. vietnamense Hài Việt Đang bi tuyê ṭ ̣ chủng trầm trọng p. delenatii Hài Đỏ P.  aspersum P. barbigerum var. lokianum P. callosum P. dianthum P. emersonii P. gratrixianum P. hangiannum P. helenae P. henryanum P.  herrmannii Đang bi tuyê ṭ ̣ P. malipoense var. jackii chủng P. malipoense P. micranthum P. purpuratum P. tralienianum Sắ p bi tuyê ṭ chủng P. appletonianum ̣ P. concolor P. hirsutissimum var. chiwuawnum P. hirsutissimum var. esquirolai P. villosun var. annamense Thiế u dẫn liêụ P.  affine P.  datalanse P. villosum var. boxalli Chƣa rõ tên go ̣i Hài Lộc Hài Vân Hài Xoắ n Hài Hƣơng Lan Hài Đuôi công Hài Hằng Hài hê len Hài Henry Hài Herman Hài Jack Hài Giáp Hài Mốc Hồng Hìa Tía Hài Trần liên Hài Cánh Sen Hài Gia Định Hài Tiên biến dị Hài Tiên Hài Lông Hài Hoà Chƣa rõ tên go ̣i Chƣa rõ tên go ̣i 9 Trên thƣ̣c tế , mƣ́c đô ̣ đe do ạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt Nam đƣơ ̣c chỉ ra ở bảng trên đây đã bi ̣thay đổ i nhiề u trong thời gian gầ n đây do sƣ̣ suy giảm nhanh các quầ n thể đƣơ ̣c biế t . Trong nhƣ̃ng năm gầ n đây, qua các đơ ̣t điề u tra thƣ̣c điạ đã phát hiê ̣n ra tố c đô ̣ phá huỷ ma ̣nh mẽ trên diê ̣n rô ̣ng của nhƣ̃ng khu rƣ̀ng còn sót la ̣i của Viê ̣t Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [16],[17],[18]. Sƣ̣ thay đổ i môi trƣờng số ng do con ngƣời gây nên và viê ̣c thu mua với số lƣơ ̣ng lớn để buôn bán hiê ̣n nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lƣơ ̣ng các loài lan Hài . Tấ t nhiên, viê ̣c phá huỷ nơi số ng tƣ̣ nhiên của chúng có liên quan đế n tố c đô ̣ phát triể n kinh tế và sƣ̣ gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trƣờng nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biế n mấ t trƣớc tiên sau khi nơi số ng tƣ̣ nhiên của chúng bi ̣suy thoái . Yế u tố thƣ́ hai dẫn đế n sƣ̣ tuyê ̣t c hủng của các loài lan Hài ở Việt Nam trong nhƣ̃ng năm gầ n đây là viê ̣c thu hái trên diê ̣n rô ̣ng của ngƣời dân điạ phƣơng để bán và xuất khẩu một lƣợng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nƣớc ngoài . Do không có biê ̣n phá p quản lý có hiê ̣u quả viê ̣c thu mẫu các loài thƣ̣c vâ ̣t hoang dã với sƣ̣ giàu có nổ i bâ ̣t của lan Hài đă ̣c hƣ̃u của Viê ̣t Nam đã khuyế n khić h viê ̣c thu thâ ̣p các loài lan từ thiên nhiên với số lƣợng lớn trên toàn bộ lãnh thổ [1]. Nế u khôn g có các biê ̣n pháp bảo vê ̣ các khu rƣ̀ng nguyên sinh khẩ n cấ p và hiê ̣u quả thì chắ c chắ n các sinh vâ ̣t sẽ phải đố i mă ̣t với nguy cơ tuyê ̣t chủng trong tƣơng lai gầ n . Điề u này sẽ kéo theo sƣ̣ tuyê ̣t chủng của mô ̣t số lƣơ ̣ng lớn các loài hiế m và đă ̣c hƣ̃u . Trƣớc tiǹ h hiǹ h lan Hài ca ̣n kiê ̣t ngoài thiên nhiên , nhiề u chƣơng trin ̀ h quố c gia về bảo tồ n loài hoa quý này đã đƣơ ̣c triể n khai ,chủ yếu là thu thập , phân loa ̣i , nghiên cƣ́u về các loài l an Hài và bảo tồ n môi trƣờng số ng tƣ̣ nhiên của chúng . Mô ̣t công trình hơ ̣p tác quố c tế về liñ h vƣ̣c này là mô tả các giố ng lan Hài ở Viê ̣t Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov , Phillip Cribb , Phan Kế Lô ̣c và Nguyễn Tiế n Hiê ̣p năm 2004 [1]. Một mạng lƣới rộng khắp các khu bảo tồn đã đƣợc thành lập ở Việt Nam. Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài nhƣ: 10 - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum. - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum. - Vƣờn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thƣợng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P.dalatensis. - Vƣờn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum. - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.hangianum, P. malipoense varijackii. - Vƣờn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae. - Vƣờn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. malipoense Bên ca ̣nh đó , nhiề u nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấ y mô tế bào thƣ̣c v ật in vitro nhằ m nhân nhanh số lƣơ ̣ng lớn lan Hài . Đầu tiên phải kế đế n PGS . TS. Dƣơng Tấ n Nhƣ̣t , ngƣời đầ u tiên nuôi cấ y thành công lan hài Hồ ng năm 2005 [32],[33]. Sau đó đã có nhiề u nhà nghiên cƣ́u khác đã nuôi cấ y in vitro thành công nhiề u loài lan Hài khác nhƣ hài Hằ ng các phƣơng pháp nuôi cấy mô khác nhau , hài Tam Đảo bằng , Khoa CNSH – CNTP trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bƣớc đầu đã thành công nhân giống bằng phƣơng pháp in vitro một số loài lan Hài nhƣ: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen. 2.2. Giới thiêụ về giố ng lan Hài Giáp 2.2.1. Nguồ n gố c và sự phân bố Năm 1954, hai nhà thực vật học Trung Quốc là S.C. Chen và Z.H. Tsi đã đƣa ra bản mô tả về Paphipedilum malipoense dựa trên tiêu bản thực vật do K.M.Feng thu thâ ̣p đƣơ ̣c năm 1947 ở gần Malipo, đông nam tỉnh Vân Nam, sát biên giới Việt