Tài liệu Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây tứ thư hồng, tetrastigma erubescens planch., họ nho ( vitaceae )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY TỨ THƯ HỒNG, TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH., HỌ NHO (VITACEAE) S K C 0 0 3 9 5 9 MÃ SỐ: T2014-48TĐ S KC 0 0 4 7 8 3 Tp. Hồ Chí Minh, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY TỨ THƯ HỒNG, TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH., HỌ NHO (VITACEAE) Mã số: T2014-48TĐ Chủ nhiệm đề tài: ThS. Phan Thị Anh Đào Thành viên đề tài: TS. Võ Thị Ngà TP. HCM, 11, 2014 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI ST T Đơn vị công tác và lĩnh vực chuyên môn Họ và tên Nội dung nghiên cứu được giao 1 Phan Thị Anh Đào Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa học& Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP. HCM Chủ trì 2 Võ Thị Ngà Bộ môn Hóa Phân Tich, Khoa Hóa, Tham gia ĐH Khoa học Tự Nhiên TP. HCM ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tên đơn vị Nội dung phối hợp Họ và tên trong và ngoài nước nghiên cứu người đại diện đơn vị Phòng thí nghiệm Hóa Dược– ĐH Khoa học Tự nhiên Tp. HCM Thử hoạt tính kháng oxy Nguyễn Xuân Hải Phòng phân tích trung tâm-– ĐH Khoa học Tự nhiên Tp. HCM hóa Phân tích phổ nghiệm iii Nguyễn Huỳnh Hoa MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................... Error! Bookmark not defined. LỜI CAM ĐOAN ............................................................. Error! Bookmark not defined. MỤC LỤC........................................................................................................................ iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .......................................................................................... ix DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ..................................................................................... ix DANH M ỤC CÁC SƠ ĐỒ ............................................................................................... x MỞ ĐẦU .......... ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................. 4 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA............................................................ 4 1.1.1 Khái niệm về gốc tự do...................................................................................... 4 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể ....................................................... 5 1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể ...................................................................... 9 1.1.4 Khái niệm về chất kháng oxy hóa .................................................................... 13 1.1.5 Phân loại ......................................................................................................... 13 1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa ........................................ 19 1.2 TÌM HIỂU VỀ CÁC CÂY THUỐC SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA Error! Bookmark not defined. 1.3 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH................. 23 1.3.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Tetrastigma erubescens Planch.... 23 1.3.2 Nghiên cứu về dược học của cây T.erubescen.................................................. 24 1.3.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetrastigma................................... 25 1.4 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.)Error! Bookmark not defined. 1.4.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Nauclea orientalis (L.) ......... Error! Bookmark not defined. 1.4.2 Nghiên cứu dược học của cây N. orientalis........ Error! Bookmark not defined. 1.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây N. orientalisError! Bookmark not defined. 1.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi NaucleaError! defined. iv Bookmark not 1.5 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 30 1.5.1 Những vấn đề còn tồn tại ................................................................................. 30 1.5.2 Định hướng nghiên cứu ................................................................................... 30 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ....................................................................................... 32 2.1 ĐIỀU CHẾ CÁC MẪU CAO SÀNG LỌC .................. Error! Bookmark not defined. 2.1.1 Hóa chất và thiết bị............................................ Error! Bookmark not defined. 2.1.2 Nguyên liệu ....................................................... Error! Bookmark not defined. 2.1.3 Xác định độ ẩm nguyên liệu ............................. Error! Bookmark not defined. 2.1.4 Điều chế các mẫu cao methanol......................... Error! Bookmark not defined. 2.2 TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT .................................. 32 2.2.1 Hóa chất .......................................................................................................... 32 2.2.2 Thiết bị............................................................................................................ 32 2.2.3. Trích ly và phân lập hợp chất từ thân cây T.erubescens .................................. 33 2.2.4. Trích ly và phân lập hợp chất từ thân cây N.orientalis .................................... 34 2.3 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............... Error! Bookmark not defined. 2.3.1 Nguyên tắc ........................................................ Error! Bookmark not defined. 2.3.2 Hóa chất và thiết bị............................................ Error! Bookmark not defined. 2.3.3 Chuẩn bị mẫu .................................................... Error! Bookmark not defined. 2.3.4 Qui trình xác định.............................................. Error! Bookmark not defined. 2.3.5 Dựng đường chuẩn ............................................ Error! Bookmark not defined. 2.3.6 Xử lý kết quả..................................................... Error! Bookmark not defined. 2.3.7 Nơi thực nghiệm................................................ Error! Bookmark not defined. 2.4 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA .................................................. 34 2.4.1 Khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ...................................................... 34 2.3.2 Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ..................................... 36 2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan trên chuột nhắt bị suy giảm hệ miễn dịch bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) . Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................... 39 3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓAError! Bookmark not defined. 3.1.1 Điều chế các mẫu cao MeOH ............................ Error! Bookmark not defined. v 3.1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPHError! Bookmark not defined. 3.1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipidError! Bookmark not defined. 3.1.3 Bàn luận kết quả nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa ................. Error! Bookmark not defined. 3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY T.ERUBESCENS VÀ THÂN CÂY N.ORIENTALIS ........................................................ 39 3.2.1 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của cây T. erubescensError! Bookmark not defined. 3.2.2 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của cây N. orientalisError! Bookmark not defined. 3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY T. ERUBESCENS ................................................................................................................ 40 3.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol đơn vòngError! Bookmark not defined. 3.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất stilbene ............................................... 40 3.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất flavonoid ............................................ 47 3.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất benzopyranoidError! Bookmark not defined. 3.3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm lignanError! Bookmark not defined. 3.3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất nhóm steroidError! Bookmark not defined. 3.3.7 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất nhóm norisoprenoidError! Bookmark not defined. 3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.).............................................................. Error! Bookmark not defined. 3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol đơn vòngError! Bookmark not defined. 3.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất benzopyranoidError! Bookmark not defined. vi 3.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất triterpenoidError! Bookmark not defined. 3.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất monoterpenoidError! Bookmark not defined. 3.4.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất flavonoidError! Bookmark not defined. 3.4.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan ... Error! Bookmark not defined. 3.5 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............... Error! Bookmark not defined. 3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA ........................................................ 66 3.6.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ..................................... 66 3.6.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid .................... 69 3.6.3 Kết quả nghiên cứu in vivo- mô hình gây suy giảm miễn dịch ở chuột nhắt bằng cyclophosphamide ..................................................... Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 74 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A : Acetone AO (AH) : Antioxidant (chất kháng oxy hóa) Asc : Ascorbic acid (vitamin C) BHA : Butylated hydroxyanisole br : Broad (rộng) BTH : Butylated hydroxytoluene CHCl3 : Chloroform CPA : Cyclophosphamide CTPT : Công thức phân tử d : Doublet (mũi đôi) DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide DNA : Acid deoxyribonucleic DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl E : Ethyl acetate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ET : Electron transfer methods GSH : Glutathione H : n-hexan HAT : Hydrogen atom transfer methods HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HR-EIS-MS : High resolution electron spray ionization mass spectroscopy HSQC : Heteronuclear single quantum coherence IC50 : Nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do J : Hằng số ghép M : Methanol m : Multiplet (mũi đa) MDA : Malonyldialdehyde NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) viii NOS : Nitrogen oxygen species NP : Nomal phase (pha thường) PBS : Phosphate buffered saline PG : Propyl gallate Pr : Protein quin : quintet (mũi năm) RNS : Reactive nitrogen species ROS : Reactive oxygen species RP : Reversed phase (pha đảo) s : Singlet (mũi đơn) SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn của giá trị trung bình) SKC : Sắc ký cột TBA : Acid thiobarbituric TBHQ : tert-Butylhydroquinone TCA : Trichloroacetic acid TLC : Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng) Trolox : Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic UV : Ultraviolet (tử ngoại) W : Water (nước) XO : Xanthine oxydase YHCT : Y học cổ truyền ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU x DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xi MỞ ĐẦU * Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Tình hình ngoài nước: hoạt tính kháng oxy hóa là một hoạt tính sinh học được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhiều vào khoảng 20 năm trở lại đây. Trên thế giới có môt số ít các công trình nghiên cứu mang tính qui mô trên đối tượng lớn các cây thuốc. Xu hướng nghiên cứu phân lập các hoạt chất từ các mẫu dược liệu hiện đang phát triển mạnh. Họ Nho (Vitaceae) là một họ thực vật lớn, trong đó chi Tetrastigma là chi lớn thứ ba với hơn 95 loài. Song các nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa mới được thực hiện trên 1 loài (T. thomsonianum) và nghiên cứu thành phần hóa học mới được tiến hành trên 5 loài. Cây T. Erubescens (Tứ thư hồng) là một loài cây chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa. Tình hình trong nước: nước ta là một trong những nước nhiệt đới có thảm thực vật phong phú nhất thế giới với khoảng 12.000 loài, chưa kể tới các rong, rêu, nấm. Bên cạnh đó, YHCT Việt Nam cũng đang phát triển với bề dày kinh nghiệm được lưu truyền qua các thế hệ. Có nhiều cây thuốc được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý trong đó phải kể tới các bệnh liên quan tới gốc tự do như ưng thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp. Tuy nhiên, những bằng chứng khoa học về những cây thuốc này chưa có hoặc còn rất hạn chế. Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu mang tính qui mô, sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa. - Cây T. Erubescens là một loài cây chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa. Do vậy, ngoài mục tiêu chính là tìm kiếm những hoạt chất kháng oxy hóa mạnh, chúng tôi còn tiến hành phân lập và định danh các hợp chất nhằm tìm hiểu thêm về thành phần hóa học của cây này. * Tính cấp thiết: Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến các vấn đề gốc tự do, chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa. Trong cơ thể con người, khi lượng gốc tự do quá lớn, vượt qua mức kiểm soát của hệ thống miễn dịch, 1 gốc tự do sẽ tấn công vào các đại phân tử như DNA, protein, lipid và gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Gốc tự do được biết là thủ phạm có liên quan tới nhiều căn bệnh mà trong đó phải kể tới các bệnh nguy hiểm hiện nay như ung thư, viêm khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson …Chất kháng oxy hóa được đưa vào cơ thể con người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả năng ngăn ngừa, ức chế và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Nhu cầu và thị yếu của con người ngày càng cao, đòi hỏi sự tìm tòi, nghiên cứu của các nhà khoa học càng sâu rộng, hiệu quả và kịp thời. Ngày này, xu hướng nghiên cứu mới là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm thay thế cho các chất kháng oxy hóa tổng hợp hiện vẫn còn sử dụng nhiều trong thực phẩm, y học và cuộc sống hằng ngày. Vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, An Giang có hệ thực vật phong phú và đa dạng, được sử dụng nhiều trong y hoc cổ truyền (YHCT). Có nhiều cây thuốc được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý liên quan tới gốc tự do như ung thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp…Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có bất kỳ một nghiên cứu qui mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa. Từ kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của 90 cây thuốc An Giang (3/2012), nhóm chúng tôi đã tìm ra cao MeOH trích ly từ thân cây Tứ thư hồng có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50= 2,1 µg/ml (phương pháp thử ức chế gốc tự do DPPH) và IC50= 4.9 µg/ml (phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid). Ở Việt Nam và trên thế giới, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về thành phần và hoạt tính của cây Dây rơm nói chúng và thân cây Dây rơm nói riêng. Do vậy, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Tứ thư hồng là hết sức cần thiết và hứa hẹn những kết quả khả quan. * Mục tiêu:  Cô lập các hợp chất từ thân cây Tứ thư hồng, Tetrastigma erubescens Planch., Họ Nho (Vitaceae). 2  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, ức chế quá trình peroxyde hóa lipid. * Cách tiếp cận  Tham khảo tài liệu.  Thực nghiệm. * Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: Điều chế các mẫu cao bằng phương pháp trích nóng trong dung môi MeOH và cô lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản mỏng điều chế.  Phương pháp nghiên cứu phân tích tổng hợp: Phân tích và tổng hợp các dữ liệu phổ nghiệm như phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13 C, DEPT, COSY, HMBC, HMQC và khối phổ để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol cô lập được. * Đối tượng và phạm vi nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu: thân cây Tứ thư hồng  Phạm vi nghiên cứu : - Cô lập 10 hợp chất tinh khiết * Nội dung nghiên cứu  Cô lập các hợp chất tinh khiết từ thân cây Tứ thư hồng bằng các phương pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký bản mỏng điều chế.  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, khối phổ,...  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1 Khái niệm về gốc tự do Gốc tự do (free radical) được định nghĩa là những phân tử, nguyên tử, nhóm nguyên tử có chứa 1 hay nhiều electron tự do (electron độc thân) ở lớp ngoài cùng. [25,32,35] Gốc tự do gồm 2 dạng hoạt động chính là: dạng hoạt động của nitrogen (RNSreactive nitrogen species) (bảng 1.1) và dạng hoạt động của oxygen (ROS-reactive oxygen species) (bảng 1.2). Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen [25] Các dạng động Ký hiệu Thời tồn tại Nitric oxide NO● 1s Nitrogen dioxide Acid peroxynitrous Peroxynitrite NO2● 1s Vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương và ngoại biên. Hình thành trong quá trình ô nhiễm không khí ONOOH Khá ổn định Được hình thành khi ONOO─ nhận thêm 1 proton. ONOO─ 10-3 s Hoạt tính cao, hình thành từ NO● và O2●─ hoạt gian Hoạt động Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen [25] Các dạng hoạt động Ký hiệu Thời gian tồn tại Superoxide O2●─ 10-6s Gốc hydroxyl HO● 10-9s Alkoxyl Gốc peroxyl Hydroperoxide hữu cơ Hydrogen peroxide RO● ROO● 1s 1s ROOH Ổn định H2O2 Bền Singlet oxygen 1 10-6s Ozon O3 O2 1s Hoạt động Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ thống tim mạch và các bộ phận khác Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình trạng cơ thể dư chất sắt (phản ứng Fenton) Hoạt tính cao, được hình thành khi các đại phân tử bị gốc tự do tấn công Phản ứng với các ion kim loại chuyển tiếp để tạo ra các dạng hoạt động. Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận 1 electron để chuyển hóa thành gốc tự do HO● Hoạt tính cao, hình thành trong quá trình quang học (photosensitization) và phản ứng hóa học Là 1 chất gây ô nhiễm trong khí quyển, có thể phản ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra 1O2. 4 Các gốc tự do thường kém bền và có năng lượng cao, dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa…. Gốc tự do có hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của chúng thường rất ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố: cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp.[82] Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO-, trong đó NO• là gốc tự do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp. Nếu như các dạng hoạt động của nitrogen có ý nghĩa trên lâm sàng thì các dạng hoạt động của oxygen lại là tác nhân nguy hiểm gây ra nhiều bệnh lý.[25,84] Các dạng oxygen hoạt động này có năng lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như protein, lipid, DNA… gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.[25,84] 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể 1.1.2.1. Nguồn nội sinh Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý (quá trình hô hấp ở tế bào), quá trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy hóa (prooxydant enzyme) và sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể. a) Quá trình hô hấp của tế bào [26,39,98] Quá trình hô hấp ở tế bào là một chuỗi những phản ứng oxy hóa-khử và gốc tự do là các sản phẩm trung gian được sinh ra trong quá trình này. Ví dụ: Quá trình khử oxygen tạo nước trong quá trình hô hấp tạo các gốc tự do như O2●-, HO● thông qua những phản ứng như sau: O2 + 4 H+ + 4e  2H2O (1.1) O2 + e  O2●H2O2  O2 ●- (1.2) + + 2H + e 5 (1.3) H2O2 + H+ + e  HO● + H2O ● + HO + H + e  H2O (1.4) (1.5) Bên cạnh đó, phản ứng phụ giữa các gốc tự do trong quá trình hô hấp cũng sẽ hình thành những gốc tự do mới, độc hại hơn. Một phản ứng phụ đáng chú ý là phản ứng - Haber-Weiss (phản ứng 1.6), xảy ra giữa gốc O2● và H2O2 tạo nên gốc HO● và oxygen đơn bội: O2●- + H2O2  O2 + HO● + HO- 1 (1.6) Phản ứng 1.6 sẽ xảy ra nhanh hơn khi được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển tiếp như sắt, đồng, coban,… Oxygen đơn bội và gốc hydroxyl hình thành là những gốc tự do có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại. Chúng là nguyên nhân chính gây ra các quá trình peroxide hóa màng lipid. b) Hội chứng viêm nhiễm [26,76] Hội chứng viêm nhiễm là một phản ứng tự vệ của cơ thể sống nhằm chống lại sự tấn công của các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ từ bên ngoài xâm nhập vào cơ thể hoặc sinh ra ngay trong cơ thể. Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính (neutrophil) bao kín để làm nhiệm vụ thực bào. Lúc này, enzyme NADPH oxydase ở màng bạch cầu được hoạt hóa, xúc tác phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do O2●- (phản ứng 1.7), từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm phân hủy các sinh vật lạ. Một phần các gốc tự do bị thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm. NADPH oxydase 2O2 + NADPH 2O2●- + NADP + H+  (1.7) c) Các enzyme thân oxy hóa [26,33,88] Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do như xanthine oxydase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxydase … Gốc O2●- và NO● là 2 gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy hóa này. - Xanthine oxydase là một enzyme quan trọng trong quá trình thoái hóa của các hợp chất purine. XO dùng O2 như một chất chuyển electron trong quá trình phản ứng 6 và kết quả dẫn đến là hình thành gốc O2●-. Điều này được minh họa bằng phản ứng 1.8 như sau: O HN O O H N + N H H2 O + 2O2 XO HN N N H O H N 2O2 O + + 2H+ (1.8) N H Sự tạo thành gốc O2●- bởi XO đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra các tổn thương trong hiện tượng thiếu máu cục bộ (ischaemia injury). - Nitric oxide synthase là một enzyme xúc tác sự oxy hóa L-arginine thành citrulline và tạo gốc NO●. Enzyme này dùng NADPH làm chất chuyển electron trong quá trình phản ứng. Nếu trong phản ứng có tồn tại gốc O2●- thì gốc O2●- dễ dàng phản ứng với gốc NO● tạo ONOO- (một hợp chất có hại đối với DNA). - Enzyme myeloperoxydase được tạo ra do sự hoạt hóa bởi bạch cầu trung tính, sử dụng H2O2 để oxy hóa ion Cl- tạo ra HOCl, một hợp chất không phải là gốc tự do nhưng có khả năng oxy hóa mạnh, gây nguy hại cho các mô cơ trong quá trình viêm nhiễm. d) Các ion kim loại chuyển tiếp [26,76] Phản ứng giữa một ion kim loại chuyển tiếp và một hợp chất peroxide cũng góp phần sản sinh gốc tự do trong cơ thể. Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO● dưới xúc tác ion sắt là một ví dụ điển hình (phản ứng 1.9 và 1.10) Fe2+ + H2O2  HO- + HO● + Fe3+ (1.9) Fe3+ + H2O2  H+ + HOO● + Fe2+ (1.10) Hai phản ứng trên được gọi là phản ứng Fenton. Ngoài sắt, các ion kim loại chuyển tiếp khác như đồng, cobalt cũng có thể tham gia quá trình này. 1.1.2.2 Nguồn ngoại sinh Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi các yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc, ozon … a) Sự bức xạ [26] 7 Thành phần chủ yếu của cơ thể là nước, do đó các bức xạ có năng lượng cao (tia X, tia UV…) khi chiếu vào cơ thể sẽ phân hủy các phân tử nước thành các gốc tự do, có khả năng phản ứng rất mạnh (phản ứng 1.11 và 1.12): H2O  HO● + H+ + e-aq ● ● H2O  HO + H (1.11) (1.12) Nếu trong nước có oxygen thì sẽ xảy ra phản ứng sau (phản ứng 1.13 và 1.14): -aq O2 + e ●  O2 ●- (1.13) ● H + O2  HOO (gốc hydroperoxide) (1.14) Như vậy, dưới tác dụng của bức xạ, các gốc tự do như HO●, O2●-, HOO● được hình thành trong cơ thể. Điều này có thể giải thích vì sao sự lão hóa của da người sẽ tăng lên tại những vùng bị phơi bày dưới ánh sáng. Đó là do các bức xạ mặt trời, tia cực tím đã làm sản sinh những gốc tự do có khả năng tham gia quá trình peroxide hóa lipid ở các tế bào da. Bức xạ cũng có thể khơi mào những phản ứng gốc trong tế bào, chẳng hạn như sự tự oxy hóa các lipid. Đồng thời, các phân tử DNA cũng là mục tiêu bị nguy hại bởi các bức xạ vì các gốc tự do sản sinh từ sự phân giải nước sẽ tấn công các bazơ của DNA. b) Khói thuốc lá [58] Khói thuốc chứa một lượng lớn những hợp chất như aldehyde, expoxide, peroxide và những gốc oxy hóa như nitric oxide, gốc peroxyl, gốc với trung tâm carbon hiện diện trong pha khí. Theo ước tính, trong một làn hơi thuốc lá có khoảng 1015 gốc tự do. Chúng có khả năng tồn tại trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn công túi phổi. Bên cạnh đó, khói thuốc còn chứa các gốc bền trong nhựa thuốc. Sự vi xuất huyết là nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt được tìm thấy ở mô phổi của những người hút thuốc. Sắt trong thể này dễ dàng xúc tác cho phản ứng Fenton, sinh gốc HO● độc hại. c) Ozon [40] Ozon là một trong những tác nhân độc hại tạo ra gốc tự do và sự ảnh hưởng của nó trên cơ thể sống biểu hiện chủ yếu qua các tổn thương ở phổi và máu. Ozon có thể 8 phản ứng trực tiếp với các hợp chất bất bão hòa như các acid béo trong lipid hoặc có thể tự phân hủy sinh ra O2, từ đó gia tăng khả năng hình thành các gốc tự do trong cơ thể . 1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể Ở nồng độ thấp và trung bình, gốc tự do rất có lợi và cần thiết cho các hoạt động của cơ thể sống. Trong quá trình trao đổi chất, gốc tự do đóng vai trò trung gian di chuyển các điện tử từ phân tử này sang phân tử khác nhằm tạo ra năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của con người. Gốc tự do góp phần cùng với bạch cầu tiêu diệt các vi sinh vật có hại, tăng cường khả năng bảo vệ cho hệ thống miễn dịch của cơ thể. Bên cạnh tác dụng giúp tiêu diệt các vi sinh vật lạ, gốc tự do còn góp phần quét dọn những tế bào già, chết trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi, phát triển và tiêu diệt những tế bào bất thường như tế bào ung thư. Ngoài ra, gốc tự do còn tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác cho cơ thể như đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh (NO•) và tác nhân điều hòa huyết áp. Trong cơ thể sống luôn tồn tại sự cân bằng các dạng hoạt động và dạng kháng oxy hóa, đó là một trạng thái cân bằng nội môi (homeostasis). Tuy nhiên, do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động ngoại sinh làm gia tăng nồng độ của các dạng hoạt động, vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống kháng oxy hóa trong cơ thể. Hiện tượng stress oxy hóa (oxydative stress) xảy ra, mang lại nhiều nguy hại cho con người khi các gốc tự do bùng phát và tấn công các phân tử sống như lipid, protein, DNA và có thể gây chết tế bào.[80,82] Các bộ phận cơ thể chịu sự tấn công của gốc tự do và các bệnh lý liên quan được trình bày trong sơ đồ 1.1. Theo các nhà khoa học, gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh (sơ đồ 1.1), đáng kể nhất gồm có: viêm khớp, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp, xơ gan, thiếu máu cơ tim... [25,84] Các bệnh lý này thường xảy ra do quá trình tổn thương trong cơ thể. 9