Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan nghệ tâm (dendrobium loddigesii rolfe), hạc vỹ (dendrobium aphyllum (roxb.) fisher) của việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG PHỤC VỤ BẢO TỒN HAI LOÀI LAN NGHỆ TÂM (Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Khoa học cây trồng 9 62 01 10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Vũ Mạnh Hải 2. TS. Phạm Hương Sơn HÀ NỘI - 2019 Công trình hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Vũ Mạnh Hải 2. TS. Phạm Hương Sơn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 3. Thư viện…………………………………………….. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) và Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) là hai loài lan rừng đẹp, có giá trị y học và giá trị thương mại cao. Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dạ dày, ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015). Hạc vỹ dùng trị ho, đau họng, bỏng lửa, toàn cây điều trị kinh phong trẻ em, ăn uống bị ngộ độc (Sách Đỏ Việt Nam, 2007). Trong xu thế nhu cầu sử dụng làm cây hoa cảnh và dược liệu tăng mạnh những năm gần đây, hai loài Nghệ tâm và Hạc vỹ đã bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt. Mặt khác, do tỷ lệ nảy mầm từ hạt trong tự nhiên rất thấp và vùng phân bố của Nghệ tâm và Hạc vỹ bị thu hẹp nên hai loài lan này đang trong tình trạng gần như mất dần trong tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ nhân giống phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan này là rất cần thiết. Một trong các biện pháp hữu hiệu để nhân nhanh và bảo tồn các loài lan quý hiếm nói chung và Nghệ tâm, Hạc vỹ nói riêng là kỹ thuật nhân giống in vitro và tạo hạt giống nhân tạo, kéo dài quá trình bảo quản và cung cấp hạt giống cho sản xuất. Nhằm góp phần làm phong phú nguồn dược liệu quý của Việt Nam, làm đẹp môi trường cảnh quan, nâng cao thu nhập cho người trồng lan, chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) của Việt Nam”. 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu đánh giá các đặc điểm sinh học cơ bản và biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan quý Nghệ tâm và Hạc vỹ, từng bước góp phần vào sản xuất cây dược liệu, cây cảnh có giá trị của Việt Nam. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học Các kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học có giá trị về một số biện pháp kỹ thuật nhân giống dựa trên các đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ, góp phần bảo tồn, khai thác và phát triển chúng một cách phù hợp trong điều kiện Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu có tính hệ thống về đặc điểm nông sinh học, 2 dược tính và công nghệ tạo hạt giống nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ là nguồn tư liệu có giá trị, làm cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo, bổ sung vào tài liệu giảng dạy chuyên ngành trong các trường đại học, các chương trình phổ biến kiến thức cho cộng đồng. - Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả đề tài đã góp phần tích cực vào công tác bảo tồn hai loài lan dược liệu quý Nghệ tâm và Hạc vỹ của Việt Nam thông qua việc thu thập và lưu giữ với đầy đủ các thông tin bộ giống gốc bản địa. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, đề tài đã nhân giống và tạo được hạt giống nhân tạo cùng số lượng lớn cây giống sạch bệnh, khỏe với hệ số nhân cao, góp phần mở rộng diện tích trồng hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ cho mục đích sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm phục vụ nội tiêu và hướng tới xuất khẩu với hiệu quả kinh tế cao. 4. Đóng góp mới của đề tài - Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống về các đặc điểm hình thái, cấu trúc vi phẫu và thành phần hóa sinh của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) có giá trị làm thuốc và làm cảnh cao. - Đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan quý Nghệ tâm và Hạc vỹ phù hợp với điều kiện của Việt Nam, dễ áp dụng với nguồn nguyên vật liệu trong nước nên có tính khả thi cao. - Quy trình tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro sau bảo quản hạt hai loài lan đã kéo dài được thời gian bảo quản với tỷ lệ hạt nảy mầm từ 68% đến 70%, chi phí thấp và giữ được đặc tính giống. - Đã xác định được các biện pháp kỹ thuật cơ bản trong sản xuất cây giống in vitro và vườn sản xuất làm cơ sở để xây dựng quy trình công nghệ hoàn chỉnh về kỹ thuật sản suất hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ở Việt Nam. 5. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 130 trang không kể tài liệu tham khảo và phần phụ lục, 36 bảng kết quả nghiên cứu, 36 hình ảnh,169 tài liệu tham khảo trong và ngoài nước. Nội dung luận án gồm các phần: Mở đầu: 3 trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài 34 trang, Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 14 trang, Chương 3: Kết quả và thảo luận 72 trang, Kết luận, đề nghị 2 trang, Tài liệu tham khảo 16 trang và phần phụ lục 25 trang. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc và phân bố của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) của Việt Nam 3 Chi Hoàng thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799, Dendrobium được hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là lan Hoàng thảo (Trần Duy Quý, 2005). Chi lan Hoàng thảo ở Việt nam rất đa dạng và phong phú nhưng sự phân bố của chúng khá đặc thù. Lan Nghệ tâm Nam có mặt tại Thái Nguyên, Hà Giang, Lai Châu, Nghệ An (Averyanov et al., 2005). Lan Hạc vỹ phân bố tại Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai, Bắc Cạn, Ninh Thuận (Averyanov et al., 2005); Sách đỏ Việt Nam, 2007). 1.2 Một số đặc điểm thực vật học chính của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật chính của hai loài lan nghiên cứu Đặc điểm Nghệ tâm (D. loddigesii) Hạc vỹ (D. aphyllum) Lan sống phụ sinh, mọc bụi Lan sống phụ sinh, thân buông Thân nhỏ, thân mềm buông xuống xuống, mảnh dài 100 cm. dài 10 - 20 cm, có đốt thưa (Trần Hợp, 1998). (Trần Hợp, 1998). Lá thuôn hình giáo, dài 4 - 6 Lá xếp thành hình mác nhọn, Lá cm, rộng 1 - 2 cm, dễ rụng dài 6 - 8 cm, rộng 1,5 - 2 cm (Trần Hợp, 1998). (Sách Đỏ Việt Nam, 2007). Cụm hoa mọc ở nách lá, 1 - 2 Cụm hoa bên, 1 - 3 hoa, mọc hoa, mọc trên các thân mang suốt dọc chiều dài thân không lá, màu hơi đậm (gân đỏ) có mang lá, màu tím nhạt hay hơi Hoa đốm đậm. Cánh môi tròn, mép trắng. Cánh môi màu vàng có nhiều lông mịn và ở giữa nhạt có 3 gân. Mùa hoa tháng có màu vàng nghệ. Mùa hoa 4 - 5 (Trần Hợp, 1998; Sách tháng 4 - 8 (Trần Hợp, 1998; Đỏ Việt Nam, 2007). Zhu Guanghua et al., 2009). 1.3 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) ở Việt Nam Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dạ dày, ung thư phổi, chống đông máu (Tsai et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015). Lan Hạc vỹ có tác dụng bổ âm thanh nhiệt, tạo nước bọt giúp tiêu hóa, bổ phế và giảm ho (Zhao Yong Ling et al., 1994). Do có giá trị làm hoa cảnh, dược liệu và giá trị kinh tế cao nên lan Nghệ tâm và Hạc vỹ trong một số năm gần đây đã bị khai thác quá mức dẫn đến 4 nguy cơ mất hẳn trong tự nhiên. 1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam Với hoa lan, thị trường thương mại toàn cầu chủ yếu là hoa chậu và hoa cắt cành, ước tính khoảng 10% hoa tươi cắt cành được tiêu thụ trên thị trường quốc tế với giá trị trung bình trong giai đoạn từ năm 2007 đến năm 2012 là 483 triệu USD (Jayarama Reddy, 2016). Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39,7%), tiếp theo là Thái Lan (28,4%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) và New Zealand (6%). Các nước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%) và Mỹ (6%). Lan cắt cành được trao đổi thương mại trên thế giới chủ yếu là các loài lan Dendrobium (chiếm 85%) và Phalaenopsis, Cymbidium (chiếm 15%). (Cheamuangphan et al., 2013; De et al., 2014). Tại Hà Lan, việc sản xuất hoa lan Dendrobium trong chậu đã tăng phổ biến đạt 40 đến 50 triệu cây (De et al., 2014). Ở Việt Nam diện tích trồng hoa lan còn rất khiêm tốn, chỉ chiếm 10% diện tích các loại hoa đang được trồng. Sản xuất hoa lan ở Việt Nam tập trung theo 2 hướng chính là sản xuất theo quy mô công nghiệp các loài lan mới lai tạo hoặc được nhập nội (lan công nghiệp) và khai thác, nuôi trồng các loài hoa lan bản địa (lan rừng). Đối với thị trường trong nước, sản lượng hoa phong lan cũng chưa đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng, chỉ khoảng 30 - 40% nhu cầu lan cắt cành còn lại phải nhập từ các nước khác. 1.5 Tình hình nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam 1.5.1 Nghiên cứu thực vật học lan Hoàng thảo (Dendrobium) Shi-Jian Yang et al., (2016), nghiên cứu đặc điểm giải phẫu và sinh lý của lá và giả hành của 4 loài D. chrysotoxum, D. officinale D. crystallinum và D. crystallinum liên quan đến sự cân bằng nước. Metusala et al., (2017) đã nghiên cứu vi phẫu lá và thân của hai loài D. capra và D. arcuatum ở các môi trường sống khác nhau liên quan đến khả năng thích ứng của hai loài trong điều kiện khô hạn. Theo y học cổ truyền, lan Nghệ tâm (D. loddigesii) có tác dụng chống tế bào ung thư dạ dày và ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010), điều trị bệnh tiểu đường type 2 (Zhang et al., 2011). Trong lan Nghệ tâm có chứa shihunine, 9,10 dihydrophenanthrene 2,4,7 triol, moscatin, loddigesiinols C, moscatilin, gigantol và tristin (Li Chunyan et al., 2013). 5 Theo nghiên cứu của Ho Kyung Jung et al., (2015) chất chiết xuất từ lan Nghệ tâm có hiệu quả ức chế melanin, ức chế hoạt động tyrosinase và phát triển dendrite, có tác dụng làm trắng da. Veronika Cakova et al., (2017) cho rằng moscatilin trong Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy. Loddigessinol G-J, Crepidatuol B có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường. Trong thân lan Hạc vỹ có polysaccharides và các hợp chất phenol như: moscatin, moscatilin và tricetin 3', 4', 5'-trimetyl ete 7-O--glucopyranoside, ức chế sản xuất NO, có hoạt động điều hòa miễn dịch. Các chất chống oxy hoá peptide được chiết xuất từ Hạc vỹ (D. aphyllum) bao gồm superoxidedismutase, catalase và glutathione peroxidase. Các axit amin: Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys chỉ ra rằng peptit DA-P có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và có hoạt động chống oxy hoá tối ưu (Huifan Liu et al., 2017). Ở Việt Nam, trong những năm gần đây hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung về hình thái học của thân, lá, hoa, rễ...(Trần Hợp, 1998; Sách Đỏ Việt Nam, 2007; Dương Đức Huyến, 2007), các nghiên cứu về vi phẫu, phân loại dựa trên chỉ thị hình thái với lan Hoàng thảo còn rất hạn chế. Cao Phi Bằng và cs., (2017) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, giải phẫu và thoát hơi nước của cây phong lan Phi điệp tím (D. anosmum Lindl.) trong quá trình luyện cây ex vitro. Nguyễn Thị Mỹ Duyên và cs., (2012) đã nghiên cứu phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và tìm ra được ba loài D. pulchellum, D. gatton Sunray, D. moschatum có mối quan hệ rất gần nhau mức tương đồng lần lượt là 96,5% và 95%. Trần Duy Dương, (2015) đã kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền của 32 mẫu giống Hoàng thảo bản địa của Việt Nam trong đó có những loài có giá trị làm thuốc như Hoàng thảo Vảy rắn, Vảy rồng, Hạc vỹ… Ở Việt Nam cho tới nay chưa có công trình nào công bố về thành phần hóa sinh của lan Hoàng thảo. 1.5.2 Nghiên cứu về nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới 1.5.2.1 Nghiên cứu về nhân giống in vitro Trên thế giới có rất nhiều tác giả nghiên cứu nhân giống in vitro. Dake Zhao et al., (2013) nghiên cứu nhân giống và tạo hoa trong ống nghiệm loài 6 lan D. wangliangii. Xin Qian et al., (2014) nghiên cứu sản xuất hoa và hạt giống loài lan D. officinate trong ống nghiệm đã tạo được calluses từ các đỉnh chồi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l αNAA, nhiều chồi được tái sinh từ các mẫu PLBs khi cấy trong môi trường MS + 1 mg/l αNAA. Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, có khả năng ra hoa cao (83,2%) với tỷ lệ hoa bình thường 73,6% khi cấy trên môi trường MS + 15% nước dừa + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tuần. Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) nghiên cứu nhân giống lan Hạc vỹ cho rằng môi trường Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA giúp cho hạt nảy mầm tốt trong lúc hệ số nhân protocorm trên môi trường Phytamax + 1 mg/l BA + 1 mg/l αNAA khá cao. Đối với loài lan D. jerdonianum Wight (Sagaya Mary et al., 2016) cho rằng môi trường MS thích hợp cho nuôi cấy từ hoa, môi trường KC phù hợp với nuôi cấy từ lá, môi trường VW phù hợp với nuôi cấy từ đốt thân. Tapash Kumar Bhowmik et al., (2017) kết luận: môi trường Phytamax (PM) có bổ sung 20 g/l sucro đem lại tỷ lệ hạt nảy mầm loài D. palpebra, cao hơn so với gluco và fructo. Thejaswini et al., (2017) cho rằng nước ép cà chua và nước dứa 15% cho tỷ lệ nảy mầm tốt nhất khi gieo hạt in vitro lan D. ovatum (Willd.). Theo Edy Setiti WidaUtami et al., (2017), bổ sung 2 g/l peptone trong môi trường VW đã được chứng minh là hàm lượng thích hợp cho sự nảy mầm của hạt, hình thành chồi với sự phát triển của protocorm. Nghiên cứu về nuôi cấy cắt lát mỏng đã được các tác giả thực hiện trên một số đối tượng: nuôi cấy cắt lát mỏng ngang thân cây con in vitro lan D. chrysotoxum (chiều dày 2 mm) Saranjeet Kaur, (2017); Paromik Bhattacharyya et al., (2018) nhân giống lan D. aphyllum từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (t-TCL); Parthibhan et al., (2018) nghiên cứu tái sinh phôi soma được hình thành từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (tTCL) của lan D. aqueum Lindley. Ở Việt Nam, Nguyễn Thanh Tùng và cs., (2010) nghiên cứu lát cắt mỏng đoạn thân theo chiều ngang của chồi in vitro lan Hoàng thảo thân gãy (D. aduncum), một số nghiên cứu nhân giống từ hạt in vitro cũng được tiến hành trên D. nobile Lindl (Vũ Ngọc Lan và cs., 2013), D. officinale (Nguyễn Thị Sơn và cs., 2014), D. lituiflorum Lindley (Nguyễn Văn Việt, (2017), D. transparens (La Việt Hồng và cs., 2017), D. officinale (Lê Thị Diễm và Võ Thị Bạch Mai, 2017),… 1.5.2.2 Nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo hoa lan Các nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo hoa lan chủ y ếu sử dụng 7 protocorm (Bunnag et al., 2010; Zhang et al., 2011; Mohanty et al., 2013; Bustam Suryanti et al., 2013; Sukhumpinij et al., 2015) hoặc từ PLBs (Nhut và cs., 2005; 2007; Trần Thị Ngọc Lan, 2013). 1.5.2.3 Nghiên cứu sinh trưởng và phát triển của cây từ hạt nhân tạo có và không qua bảo quản Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá đặc tính di truyền loài Cineraria maritana, Srivastava et al., (2009) kết luận không có sự khác biệt về di truyền giữa cây gieo hạt không bảo quản và cây từ hạt bảo quản 6 tháng. Kết quả tương tự cũng được Mishra et al., (2011) ghi nhận trên Picrorhiza kurrooa (bảo quản 3 tháng); Mohanty et al., (2013) trên D. densiflorum (bảo quản 60 ngày). 1.5.2.4 Các nghiên cứu về nuôi trồng lan Hoàng thảo Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) cho rằng giá thể thích hợp trồng cây con D. aphyllum là hỗn hợp mảnh gạch, than, xơ dừa và chất khoáng (1: 1: 0,5: 0,5). Winarto et al., (2015) khuyến cáo với cây D. ‘Zahra FR 62’ và D. ‘Gradita 31’: trồng cây trên giá thể Cycas rumphii trong 2 tháng, sau đó chuyển sang giá thể than : C. rumphii (1:1), giảm cường độ ánh sáng (100-150 μmol⋅m-2⋅s-1) bằng cách che lưới 50% với độ ẩm tương đối 85 - 95%. Tỷ lệ cây sống đạt 90 -100%. Theo Selvaraju Parthibhan et al., (2015), trồng cây D. aqueum Lindley trên giá thể mảnh gạch và than củi (1:1), để rêu trên bầu và chụp túi polyethylene giữ ẩm, tỷ lệ cây con sống cao. Abdul Aziz Mirani et al., (2017) nghiên cứu loài lan D. nobile, kết luận: cây con cấy trên môi trường MS + 3 mg/l αNAA, sau đó đem trồng trên giá thể hỗn hợp than bùn xừa: cát: đá trân châu (1,0: 1,0: 0,2) cho tỉ lệ sống 100% sau 120 ngày. Bên cạnh phân bón, một số chế phẩm sinh học và chất kích thích sinh trưởng cũng đã được sử dụng để kích thích sinh trưởng, phát triển của lan Dendrobium. Với loài lan D. cv. sonia -17 trồng trong nhà kính, Bhatt et al., (2012) cho rằng khi phun GA 3 ở nồng độ 15 mg/l, số lượng chồi, chiều dài chồi và số lượng hoa đạt tối đa trên cây, trong khi BA với nồng độ 15 mg/l lại có tác dụng làm tăng số lượng lá/cây trong ở tháng thứ nhất và thứ hai… Ở Việt nam, các nghiên cứu về chăm sóc và nuôi trồng lan Hoàng thảo sau ống nghiệm còn rất hạn chế. Phạm Thị Liên và cs., (2010) đề xuất quy trình trồng một số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở miền Bắc với giá thể than củi + xơ dừa tỷ lệ 1:1, sử dụng phân bón tan chậm N:P:K tỷ lệ 8 20:20:20 và phân bón lá Grow more Vũ Ngọc Lan (2012) xác định giá thể phù hợp trồng 2 loài D.nobile và D.chrysanthum là bột xơ dừa, phun chế phẩm dinh dưỡng Komix 2 ml/l, 7 - 10 ngày/lần sau khi đưa cây in vitro ra vườn ươm một tháng. Hoàng Xuân Lam (2014) cho rằng thời vụ ra ngôi tháng 4, giá thể than + xỉ bọt núi lửa + rong biển (2:2:1); sử dụng phân bón lá Growmore (N:P:K = 30:10:10) và chất điều tiết sinh trưởng Atonik 1,8 SL (0,1%) có tác dụng tốt đến sinh trưởng, phát triển của lan D. cherry red. Nguyễn Thế Cường và cs., (2018) cho rằng trồng cây ở mật độ 44 cây/m 2 và sử dụng phân bón lá Growmore có tác dụng tốt đến sinh trưởng phát triển của lan D. officinale. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu giống sử dụng trong đánh giá đặc điểm hình thái, vi phẫu và phân tích thành phần hóa sinh là mẫu lan Nghệ tâm (D. loddigesii) được thu thập ở Định Hóa - Thái Nguyên và Hạc vỹ (D. aphyllum) được thu thập ở Hòn Bà - Khánh Hòa. - Vật liệu nuôi cấy mô chồi ngọn của mẫu lan Nghệ tâm và mẫu Hạc vỹ có chiều cao 7 - 10 cm. - Vật liệu tạo phôi sinh dưỡng: Các PLBs (protocorm like bodies) tạo thành sau 6 tuần, hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Sau 6 tuần nuôi cấy, các PLBs đồng nhất sẽ được cắt ra với kích thước 3 - 4 mm để làm nguyên liệu tạo hạt nhân tạo. - Giai đoạn vườn ươm: Cây in vitro được nhân giống từ hạt nhân tạo: đạt chiều cao 5 - 6 cm, có 4 - 6 lá và 3 - 5 rễ. - Giai đoạn vườn sản xuất: Cây có chiều cao 6 -7 cm, 6 - 7 lá/cây, 3 - 4 rễ mới. - Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: Cà chua, tảo, bí ngô… - Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính - Các giá thể: Rêu, vỏ thông đỏ, xơ dừa sợi, đá bọt núi lửa và dớn bảng. - Các chế phẩm dinh dưỡng: Orchid Focus grow, Seaweed (Rong biển) 95%, Đầu trâu 502, B1 Thái Lan, Growmore. - Chất kích thích sinh trưởng Superthrive. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) 9 - Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro, kỹ thuật tạo hạt nhân tạo và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) phục vụ cho công tác bảo tồn - Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm - Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) giai đoạn vườn sản xuất 2.3. Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp nghiên cứu hình thái hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ - Mô tả hình thái theo phương pháp của Nguyễn Nghĩa Thìn, (2007) bao gồm các đặc điểm, thân lá, hoa và cấu tạo hoa,… - Phân tích mẫu giống và xác định tên loài theo phương pháp so sánh hình thái dựa trên các tài liệu Hoa lan Việt Nam (Trần Hợp, 1998), Thực vật chí Việt Nam (Dương Đức Huyến, 2007). * Phương pháp nghiên cứu cấu tạo vi phẫu hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ - Đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá theo phương pháp cải tiến của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007). * Phương pháp phân tích một số thành phần hóa sinh cơ bản của lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) - Xác định hàm lượng alkaloids toàn phần: theo phương pháp acid - base (Dược điển Việt Nam IV, 2009). - Xác định hàm lượng flavonoids toàn phần: theo phương pháp đo quang UV-VIS. (Mudasir Sultana et al., 2012). - Xác định hàm lượng polysaccharids toàn phần: theo phương pháp đo quang UV-VIS. (Dược điển Trung Quốc, 2010). - Xác định hàm lượng chất khoáng (Ca, Mg, Fe): theo phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS). 2.3.2 Bố trí các thí nghiệm theo nội dung nghiên cứu - Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu cấy - Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng cefotaxime tới tỷ lệ sống vô trùng của mẫu cấy - Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo PLBs lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) - Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến khả năng tạo PLBs lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) 10 - Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + IBA) đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs - Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền bí ngô đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs - Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tảo Spirulina đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs - Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi - Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của chồi - Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%) và CaCl2.2H2O (mM) khác nhau đến khả năng tạo hạt và nảy mầm của hạt nhân tạo - Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch CaCl2.2H2O đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo - Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, tổ hợp (BA + IBA) đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo - Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo - Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo - Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của natri benzoat, carbendazim và topsin - M đến khả năng bảo quản hạt nhân tạo - Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + PAA) đến khả năng nhân nhanh protocorm và chồi - Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả năng nhân nhanh protocorm và chồi. - Thí nghiệm 18: Nghiên cứu ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh sau bảo quản - Thí nghiệm 19: So sánh khả năng sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản ở giai đoạn vườn ươm - Thí nghiệm 20: Nghiên cứu xác định thời vụ ra ngôi cây con in vitro giai đoạn vườn ươm - Thí nghiệm 21: Nghiên cứu xác định giá thể cho cây con in vitro giai đoạn vườn ươm - Thí nghiệm 22: Nghiên cứu bổ sung chế phẩm dinh dưỡng cho cây con in vitro giai đoạn vườn ươm 11 - Thí nghiệm 23: Nghiên cứu xác định giá thể cho cây ở giai đoạn vườn sản xuất - Thí nghiệm 24: Nghiên cứu chế độ dinh dưỡng cho cây ở giai đoạn vườn sản suất - Thí nghiệm 25: Nghiên cứu bổ sung Superthrive cho cây ở giai đoạn vườn sản xuất Các chỉ tiêu theo dõi: + Các chỉ tiêu về rễ: - Số rễ (rễ/cây), chiều dài rễ (cm) Chỉ tiêu giải phẫu: Kích thước vỏ, kích thước trụ, số bó dẫn và kích thước bó dẫn… - Các chỉ tiêu giải phẫu: Dày hậu mô, số lượng bó dẫn, tỷ lệ bó to/bó nhỏ, kích thước bó + Các chỉ tiêu về lá: - Hình dạng lá: thuôn dài, hình lưỡi, hình mác, chiều dài lá (cm), chiều rộng lá (cm) - Chỉ tiêu vi phẫu: Kích thước biểu bì, mô đồng hóa, số bó dẫn và kích thước bó. + Các chỉ tiêu về hoa: - Đường kính hoa (cm), chiều dài cành hoa (cm), kích thước cánh hoa (cm): đo chiều dài, chiều rộng của cánh đài, cánh tràng và cánh môi, - Chỉ tiêu vi phẫu: bao phấn,… + Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro và tạo hạt nhân tạo Tỷ lệ mẫu nhiễm (%), Tỷ lệ cây sống (%), Số PLBs/tTCL (PLBs), tỷ lệ tạo PLBs (%), Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%), Hệ số nhân protocorm (lần), Chiều cao chồi (cm); số lá/chồi (lá), tỷ lệ hạt nảy mầm (%), số chồi/hạt (chồi), chiều dài chồi (mm), tỷ lệ hạt ra rễ (%), số rễ/chồi (rễ)... + Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển (giai đoạn vườn ươm và vườn sản xuất) - Tỷ lệ cây sống (%), chiều cao cây (cm), đường kính thân cây (cm), số lá/cây (lá), chiều dài lá (cm), chiều rộng lá (cm), số nhánh/cây, số rễ trung bình/cây (rễ) 2.4 Điều kiện thí nghiệm Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các mẫu lan Hoàng thảo được thực hiện tại Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, năm 2013 - 2014. - Nghiên cứu cấu tạo vi phẫu được thực hiện tại: Phòng thí nghiệm Bộ 12 môn Thực Vật - Khoa Nông học - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, năm 2014 - 2015. - Thí nghiệm nghiên cứu khảo sát một số thành phần hóa sinh chủ yếu có trong hai loài lan: Nghệ tâm và Hạc vỹ thực hiện tại: Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu, Bộ Y tế, năm 2013 - 2014. - Các thí nghiệm nhân giống, tạo hạt nhân tạo, nuôi trồng được thực hiện ở phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật và nhà lưới của Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa học và Công nghệ, năm 2013 - 2017. Điều kiện nuôi cấy - Nhiệt độ phòng 25 ± 20C, ẩm độ 60 - 70%, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 1.500 - 2.300 lux. Điều kiện trồng và chăm sóc - Nhà lưới có mái che mưa và che lưới đen, độ che sáng > 70%, có nhiệt độ 25 ± 20C, độ ẩm không khí 70 - 80%, tưới phun sương đều 2 lần/ngày. - Phòng trừ bệnh hại: phun định kỳ 10 ngày/lần bằng Antracol 70WP nồng độ 0,1%. 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng các phương pháp thống kê sinh học để phân tích các số liệu thí nghiệm bằng phần mềm (Excel, IRRISTAT 5.0). CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm sinh học của lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) 3.1.1 Đặc điểm hình thái học của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ Rễ của hai loài Nghệ tâm và Hạc vỹ có đặc điểm chung là rễ chùm, khí sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, bộ rễ thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống, khả năng tái sinh mạnh, hút nước và dinh dưỡng tốt. Thân của hai loài Nghệ tâm và Hạc vỹ thuộc loại đa thân, dài, có nhiều đốt, mỗi đốt là một mầm ngủ. Lan Nghệ tâm có thân mềm, mảnh, hình trụ, rủ xuống, dài 40,2 cm, đường kính 0,50 cm; thân lan Hạc vỹ hình trụ, thuôn, thõng xuống, dài 70,4 cm, đường kính 0,8 cm. Lan Nghệ tâm có lá hình lưỡi, hình mũi mác thuôn dài, chóp lá nhọn, màu xanh đậm, phiến lá dày, cứng, dài lá 5,0 cm, rộng 1,5 cm, có 17 lá. Hạc vỹ có lá hình mác nhọn, trông giống như da, mép lá nhẵn. Lá màu xanh nhạt, phiến lá mỏng, mềm, chiều dài lá 7,62 cm, rộng lá 3,1 và có 32 lá. 13 Lan Nghệ tâm có hoa mọc đơn, 1 - 2 hoa trên các thân mang lá, hoa màu trắng ánh tím, trung tâm màu nghệ vàng. Cuống hoa dài 0,4 - 0,8 cm, màu xanh lá cây nhạt. Bao hoa có các phiến dạng màng, có màu trắng ánh tím nhạt. Đường kính hoa 5,2 cm. Cánh đài có dạng thuôn, chóp tù; 2 cánh đài bên dài 2,5 cm, rộng 0,7 cm. Cánh tràng hình bầu dục, đỉnh hơi tròn, dài 1,7 cm, rộng 1 cm. Cánh môi viền ngoài trắng, phần giữa màu vàng nghệ, gốc màu trắng, hình gần tròn, mép lượn sóng có tua rua màu trắng, dài 1,9 cm, rộng 3,1 cm. Hoa có mùi thơm nở vào tháng 4 - 8 và hoa bền từ 30 - 35 ngày. Lan Hạc vỹ có hoa mọc thành cụm 2 - 3 hoa, mọc suốt chiều dài thân không còn lá. Cuống hoa dài 0,2 - 0,6 cm, màu tím nhạt. Đường kính hoa 4,8 cm. Hoa màu trắng sọc tím với trung tâm màu tím đậm. Bao hoa có các phiến dạng màng, màu trắng ánh tím nhạt. Ba cánh đài kích thước gần như tương tự nhau: 2 cánh đài bên dài 3,6 cm, rộng 0,9 cm. Cánh tràng thuôn, đỉnh hơi nhọn, dài 3,4 cm, rộng 1,1 cm. Cánh môi hình gần tròn, mép có tua; dài 3,7 cm, rộng 3,6 cm. Hoa nở vào tháng 4 - 6 và hoa bền từ 27 - 30 ngày. 3.1.2 Cấu tạo vi phẫu của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ Rễ của hai loài lan có kích thước đường kính rễ, vỏ trong, vỏ ngoài, ngoại bì, nội bì sai khác nhau không nhiều. Điểm khác biệt lớn nhất trong cấu tạo vi phẫu rễ của hai loài là số lượng bó dẫn. Số lượng bó gỗ (libe) trong rễ của Nghệ tâm là từ 6 đến 7 bó còn trong rễ của Hạc vỹ là từ 7 đến 8 bó. Điều này có thể liên quan đến khả năng dẫn truyền nước của cây, Hạc vỹ có khả năng chịu khô hạn tốt hơn Nghệ tâm. Vì vậy, lan Nghệ tâm cần độ ẩm cao hơn và tưới nước nhiều hơn. Hạc vỹ có kích thước thân lớn gấp 1,12 lần và số lượng bó dẫn nhiều gấp 1,5 lần Nghệ tâm. Ở Hạc vỹ, các bó dẫn nằm sát biểu bì; còn ở Nghệ tâm, các bó dẫn tập trung ở phần giữa thân, kích thước bó dẫn lớn của hai loài tương tự nhau. Đặc điểm vi phẫu này cho thấy thân Hạc vỹ có khả năng nâng đỡ và chống chịu tốt hơn so với Nghệ tâm. Vì vậy, khi trồng loài Nghệ tâm ngoài vườn sản xuất cần có giá chống đỡ như: dùng que buộc thân lại nếu trồngtrên giàn, trồng trong chậu nên treo lên,… Lá của Hạc vỹ mỏng, mềm, phiến lá rộng. Ngược lại, Nghệ tâm có phiến lá dày, cứng và bề rộng của phiến lá hẹp hơn nhiều so với Hạc vỹ. Nghệ tâm có phiến lá dày gấp 2,5 lần phiến lá của Hạc vỹ, mô đồng hóa dày gấp 2,78 lần mô đồng hóa của Hạc vỹ. Tuy nhiên, kích thước bó dẫn ở gân chính của hai loài thì tương tự nhau. 14 Lan Nghệ tâm có hoa mọc đơn trên các thân mang lá, màu trắng ánh tím, với trung tâm màu vàng nghệ. Bao hoa có các phiến dạng màng, màu trắng ánh tím nhạt. Cánh đài có dạng thuôn, chóp tù; cánh đài bên dài 2,2 2,5 cm, rộng 0,7 cm, lớn hơn cánh đài đối diện cánh môi (dài 1,6 - 1,9 cm, rộng 0,7 - 0,8 cm). Cánh tràng hình bầu dục, đỉnh hơi tròn, dài 1,6 - 1,7 cm, rộng 0,8 - 1 cm. Cánh môi viền ngoài trắng, phần giữa màu vàng nghệ, gốc màu trắng, hình gần tròn, mép lượn sóng có tua rua màu trắng, dài 1,7 - 1,9 cm, rộng 2,1 - 3,1 cm, chia 3 thùy. Các thùy gốc tù, thùy giữa bao rộng; miền giữa có lông nhung ở họng; gốc màu vàng nghệ. Cánh môi dính với cột nhị - nhụy ở gốc. Trục nhị nhụy ngắn, có dạng nửa hình trụ, dài 0,7 - 0,8 cm. Bầu nhụy 3 ô, dài 3,1 - 3,5 cm, màu xanh lá cây nhạt. Bao phấn ở ngọn, có nắp tạo thành mũ hơi nhọn, gồm 2 ô phấn với 4 khối phấn xếp từng đôi một. Hạc vỹ có hoa mọc đơn độc hoặc thành cụm 2 - 3 hoa, trên thân già không lá, hoa màu trắng sọc tím với trung tâm màu tím đậm. Ba cánh đài kích thước gần như tương tự nhau: 2 cánh đài bên dài 2,7- 3,6 cm, rộng 0,7 0,9 cm; cánh đài đối diện cánh môi dài 2,5 - 3,1 cm, rộng 0,6 - 0,7 cm. Cánh tràng thuôn, đỉnh hơi nhọn, dài 2,7 - 3,4 cm, rộng 1 - 1,1 cm. Cánh môi hình gần tròn, mép có tua; dài 3,1 - 3,7 cm, rộng 3 - 3,6 cm; chia 3 thùy rõ rệt: hai thùy bên có gân sọc tím đậm nổi rõ; thùy giữa màu trắng ngà, có gân trắng nổi rõ ở chính giữa, có lông nhung bao phủ cả hai mặt. Các thùy gốc tù, thùy giữa bao rộng. Cánh môi dính với cột nhị - nhụy ở gốc. Trục nhị nhụy ngắn, có dạng nửa hình trụ, dài 0,9 - 1,3 cm. Bầu nhụy 3 ô, dài 2,4 - 3,1 cm, màu tím nhạt. Bao phấn ở ngọn, có nắp tạo thành mũ hơi nhọn, gồm 2 ô phấn với 4 khối phấn xếp từng đôi một. 3.1.3 Một số thành phần hóa sinh cơ bản của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ Kết quả phân tích bảng 3.6 cho thấy: Hàm lượng alkaloids toàn phần của hai loài giống nhau, chiếm 0,35%; hàm lượng flavonoids toàn phần tương đối thấp (0,92% ở lan Nghệ tâm và 0,56% ở lan Hạc vỹ). Hàm lượng polysaccharides toàn phần: lan Nghệ tâm có hàm lượng polysaccharides toàn phần đạt 1,42% và lan Hạc vỹ 4,2%, cao hơn nhiều so với flavonoids và alkaloids. Hàm lượng protein, Ca, Mg và Fe của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ không chênh nhau nhiều với giá trị lần lượt là 6%, 12030 mg/kg, 1726 mg/kg, 168 mg/kg (lan Nghệ tâm) và 6,6%, 14821 mg/kg, 2829 mg/kg, 134 mg/kg (lan Hạc vỹ). Bảng 3.6 Kết quả định lượng một số thành phần hóa sinh cơ bản có trong hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ (Viện Dược liệu, 2013 - 2014) 15 TT Nhóm chất 1 2 3 4 5 6 7 Hàm lượng Alkaloid toàn phần (%) Hàm lượng Flavonoid toàn phần (%) Hàm lượng Polysaccharid toàn phần (%) Hàm lượng Protein (%) Hàm lượng Ca(mg/kg) Hàm lượng Mg(mg/kg) Hàm lượng Fe(mg/kg) Nghệ tâm Hạc vỹ (D. loddigesii) (D. aphyllum) 0,35 0,35 0,92 0,56 1,42 4,2 6,0 6,6 12030 14821 1726 2829 168 134 3.2 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro, tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 3.2.1 Xác định chất khử trùng và thời gian khử trùng của mẫu nuôi cấy Sử dụng NaOCl nồng độ 3% trong 15 phút và 1‰ cefotaxime, tỷ lệ mẫu sống vô trùng sau 6 tuần đạt cao nhất (79,9% với Nghệ tâm; 86% với Hạc vỹ) 3.2.2 Nghiên cứu tạo vật liệu protocorm like bodies (PLBs) từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) 3.2.2.1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo PLBs từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) Trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar bổ sung 1,5 mg/l BA cho kết quả tốt nhất cả về số lượng PLBs hình thành và tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs (30,1 PLBs/tTCL; tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs là 52% với lan Nghệ tâm và 28,7 PLBs/tTCL, tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs là 49,2% với lan Hạc vỹ sau 6 tuần nuôi cấy). 3.2.2.2 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) lên khả năng tạo PLBs từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) lên khả năng tạo PLBs từ tTCL (6 tuầần nuôi cầấy) Chất kích thích sinh Tỷ lệ mẫu tạo PLBs Số PLBs/tTCL trưởng (mg/l) (%) BA αNAA NT HV NT HV 1,5 0(Đ/C) 52, 03 30,40 30,12 17,83 1,5 0,5 38,0 49,22 21,00 28,71 1,5 1,0 31,0 38,30 19,00 20,70 1,5 1,5 21,9 19,96 12,80 12,30 16 1,5 2,0 CV (%) LSD0,05 16,0 3,1 7,6 14,80 4,3 1,93 7,00 3,3 0,4 7,45 3,6 0,19 Kết quả bảng 3.10 cho thấy: Đối với loài lan Nghệ tâm việc bổ sung αNAA kết hợp BA vào môi trường đã không làm tăng tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs cũng như số PLBs hình thành từ tTCL so với nền môi trường VW chỉ bổ sung BA. Với lan Hạc vỹ bổ sung 1,5 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l αNAA là tốt nhất đạt 49,22% mẫu tạo thành PLBs và số lượng PLBs tái sinh từ lát cắt mỏng tế bào là 28,71, các PLBs to và có màu xanh, có lông hút nhiều. 3.2.3 Tái sinh chồi từ protocorm like bodies (PLBs) 3.2.3.1 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + IBA) đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs Bổ sung BA+ IBA vào môi trường nuôi cấy thúc đẩy quá trình hình thành chồi từ cụm PLBs sau 8 tuần nuôi cấy. Tổ hợp 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA có tỷ lệ tái sinh chồi và chiều cao chồi cao nhất (6,8 chồi/mẫu, chồi cao 2,86 cm với lan Nghệ tâm; 6,9 chồi/mẫu, chồi cao 2,9 cm với lan Hạc vỹ). 3.2.3.2 Ảnh hưởng của dịch nghiền bí ngô đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs Bổ sung dịch nghiền bí ngô làm tăng số chồi tái sinh từ PLBs rõ rệt. Trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar +1 g/l than hoạt tính + 2 g/l peptone+ 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí ngô, sau 8 tuần nuôi cấy, tỷ lệ chồi tái sinh đạt 10,6 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 4,2 cm (với lan Nghệ tâm) và 11,6 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 4,43 cm (với lan Hạc vỹ). Tuy nhiên, nếu bổ sung ở nồng độ cao hơn 30 g/l thì số chồi chồi có xu hướng giảm đi. 3.2.3.3 Ảnh hưởng của bột tảo Spirulina đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs Số liệu bảng 3.13 cho thấy: Bổ sung 1 g/l tảo Spirulina vào môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính + 2 g/l peptone + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí ngô, pH 5,5 đem lại kết quả tốt nhất cho tái sinh chồi từ PLBs. Bảng 3.13. Ảnh hưởng của bột tảo Spirulina lên khả năng tái sinh chồi từ PLBs (sau 8 tuần nuôi cấy) Dịch Tảo Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) nghiền bí Spirulina Chất lượng chồi ngô (g/l) (g/l) NT HV NT HV 17 30 0,0 (Đ/C) 10,59 11,60 4,20 4,34 30 1 16,82 17,10 6,14 6,22 30 2 14,50 14,60 5,00 5,10 30 3 11,24 11,30 4,50 4,46 3,6 2,16 3,0 1,02 2,9 1,42 3,3 0,41 CV (%) LSD0,05 Chồi to, khỏe, lá màu xanh đặc trưng Chồi to, khỏe, lá màu xanh bóng Chồi to, khỏe, lá màu xanh đặc trưng Chồi nhỏ, lá bé màu xanh nhạt 3.2.4 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh Trong bước tạo cây in vitro hoàn chỉnh, chúng tôi bổ sung IBA và PAA ở các nồng độ khác nhau vào môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l THT, kết quả được thể hiện ở bảng 3.14 và bảng 3.15. Với lan Nghệ tâm, bổ sung 1 mg/l IBA làm tăng sinh trưởng cây con rõ rệt, sau 6 tuần nuôi cấy, cây cao 6,5 cm với 5,3 lá/cây, 7,3 rễ/cây; chiều dài rễ 2,87 cm, rễ dài và mập (bảng 3.14). Còn với lan Hạc vỹ (bảng 3.15), bổ sung 0,5 mg/l PAA cho kết quả tốt nhất, sau 6 tuần nuôi cấy cây cao 6,96 cm, 5,7 lá/cây, 7,4 rễ/cây; rễ dài 3,02 cm mặc dù sự vượt trội so với bổ sung 1 mg/l IBA là không lớn. Bảng 3.14 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi lan in vitro (sau 6 tuần nuôi cấy) Nồng độ Chiều cao cây IBA (mg/l) (cm) 0,0 (Đ/C) 0,5 1,0 1,5 2,0 CV (%) LSD0,05 NT 3,50 5,30 6,50 5,00 4,60 3,3 0,93 HV 3,52 5,38 6,80 5,72 5,35 3,0 0,39 Số lá (lá) Số rễ (rễ) Chiều dài rễ (cm) NT 3,00 4,20 5,30 4,08 4,00 4,1 0,6 HV 3,00 4,50 5,40 4,10 3,90 3,0 0,38 NT 2,50 6,20 7,30 4,90 3,70 3,7 0,32 HV 2,50 6,00 7,00 5,10 4,10 3,8 0,53 NT 1,12 2,13 2,87 1,92 1,26 3,9 0,74 HV 1,14 2,24 2,80 1,86 1,24 3,8 0,16 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của chồi lan in vitro (sau 6 tuần nuôi cấy) Nồng độ Chiều cao Chiều dài rễ Số lá (lá) Số rễ (rễ) PAA cây (cm) (cm) (mg/l) NT HV NT HV NT HV NT HV 18 0,0 (Đ/C) 3,53 3,52 3,00 3,00 2,50 2,50 1,10 1,15 0,5 6,16 6,96 5,18 5,7 6,50 7,40 2,46 3,02 1,0 5,42 5,50 5,46 5,1 5,40 5,90 2,00 2,20 1,5 5,10 5,22 5,08 4,8 4,50 5,20 1,30 1,60 2,0 4,20 4,60 5,02 4,2 3,60 4,50 0,92 1,03 CV (%) 3,3 3,3 4,5 3,1 4,0 3,2 2,7 3,1 0,79 0,31 0,35 0,42 0,34 0,46 0,91 0,19 LSD0,05 3.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo 3.2.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%) và CaCl2.2H2O (mM) đến khả năng tạo hạt và nảy mầm của hạt nhân tạo Cho dung dịch sodium alginate nồng độ 3% có chứa PLBs vào dung dịch CaCl2.2H2O 100; 125 mM hoặc nồng độ 4% vào dung dịch CaCl 2.2H2O 100 mM đều có tác dụng tốt đến sự hình thành hạt nhân tạo cho lan Nghệ tâm và Hạc vỹ. Tuy nhiên, chỉ sodium alginate ở nồng độ 3% mới đem lại tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo cao nhất (92% đối với lan Nghệ tâm; 95,2% đối với lan Hạc vỹ). 3.2.5.2 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến khả năng tạo hạt, nảy mầm và khả năng sinh trưởng của hạt nhân tạo Cho dung dịch sodium alginate 3% tiếp xúc với dung dịch CaCl 2.2H2O 100 mM trong 30 phút, tỷ lệ hạt nảy mầm đạt cao nhất với lan Nghệ tâm và Hạc vỹ. 3.2.5.3 Ảnh hưởng của BA, tổ hợp (BA + IBA) đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo Tổ hợp 2 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA đem lại tỷ lệ hạt nảy mầm, tỷ lệ ra rễ, số rễ/hạt, số chồi/hạt, chiều cao chồi cao nhất (các giá trị tương ứng là 96%; 88%; 4,1 rễ/hạt; 7,6 chồi/hạt; 13 mm với lan Nghệ tâm và 98%; 88%; 4 rễ/hạt; 8 chồi/hạt; 14,2 mm với lan Hạc vỹ). 3.2.6 Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản hạt nhân tạo 3.2.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo Bảo quản hạt nhân tạo ở 4°C, tỷ lệ nảy mầm của hạt cao nhất (68% với lan Nghệ tâm; 71,2% với lan Hạc vỹ), các chỉ tiêu chiều cao chồi, tỷ lệ ra rễ, số rễ/hạt cũng trội nhất sau 16 tuần (tương ứng 4,15 mm, 68,2% và 2,6 rễ với lan Nghệ tâm; 4 mm, 70% và 3 rễ đối với lan Hạc vỹ). 3.2.6.2 Ảnh hưởng của ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo